实验二 血涂片的制备和瑞氏染色课件.ppt

实验二、血涂片的制备和瑞氏染色及血细胞记数,血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极广泛，特别是对于各血液病的诊断具有重要的价值。血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。,实验目的,学习涂片制备的一般方法学习瑞氏染色的方法学习辨认各种血细胞学习血细胞级数,实验原理,用推片法将血液制成薄的血涂片，使血细胞成单层排列。瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue）和酸性染料伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝 染料即瑞氏（美蓝伊红Y）染料。甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。,细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩。例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。,瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。,实验材料,1、材料：蛙血和羊血2、瑞氏染液3、普通显微镜、玻片,实验操作,1、清洁载玻片：2、加样：在干净的载玻片右面13 处滴血一滴。取另一张载玻片作为推片，让推片的一端与血滴接触，并与血滴玻片成3545夹角。3、推片：待血液沿着两块载玻片接触线向两边扩散后，将推片保持夹角，向血玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血玻片上形成一层血膜，即为血涂片。,图1-6 推片,流程：清洁加样推片干片选区染色洗片,4、干片：推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。5、选区：在显微镜下观察，寻找涂片中均匀分散良好的血膜，用蜡笔在四周画线，作为堤坝。6、染色：滴加适量的瑞氏染液覆盖选定区域，染1分钟；在滴加稍多的PH6.4的PBS缓冲液稀释染液，轻摇混匀，液面浮现一层金黄色金属物质，然后静置染色510min。7、洗去多余染液：用流水或滴加蒸馏水直接洗去浮液。8、观察辨认各种细胞。,区分：红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等,注意事项,血量不能多，标本过厚，细胞重叠不便观察，并且造成细胞皱缩变形。染液PH值是6.4-6.8，染色偏酸或偏碱都会使染色反应异常。PH对细胞染色有影响。由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。,二、血细胞记数,细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法，一般利用计数板（血球计数板）进行。分两步：1、制备细胞悬液2、计数与计算,目的:学习掌握细胞计数的基本方法及误差消除方法。,血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。每一个大方格边长为1，则每一大方格的面积为12，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1，所以计数室的容积为0.13。,使用步骤：1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、镜下观察。,用血细胞计数板计数。1）一般计数四周大方格内细胞，密度计算公式为：细胞密度（个/ml）(4大方格细胞总数/4)10000稀释倍数2）记数中间大方格内细胞，公式为：细胞密度（个/ml）（5个中方格总数/5)25 10000稀释倍数,注意事项：,务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。计数板及盖玻片应彻底用酒精棉球擦洗干净。注意方法：加样时要先盖好盖玻片，再加样品。用细口滴管将细胞悬液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让悬液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室。（或用10l的加样枪缓慢从盖玻片边缘加样，直到悬液到达计数室另一边。）计数原则：对压线细胞，计左不计右，计上不计下。显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团10，说明细胞分散不充分。,