免疫血清制备课件.ppt
免疫血清制备,中山医学院免疫学教研室,实验目的和要求,?,了解影响机体免疫应答强度的,因素,;,?,明确初次应答和再次应答抗体产生的,规律,；,?,制备牛血清白蛋白（,BSA,）的抗血清；,?,熟悉佐剂的制备和动物免疫的常用方法；,?,了解抗体检测的常用方法。,?,在免疫学实验中,为制备抗体通常以,抗原性物质给动物注射,经一定时间,后,动物血清中可产生大量特异性抗,体，这种含有特异性抗体的血清称,免,疫血清,。,实验原理,免疫应答的影响因素,抗体的产生通常与,抗原的质和量,、,动物种类,以及,接种的途径,有密,切关系。,一、抗原分子的结构和性质,1.,分子量：分子量越大，免疫原性越强。,2.,化学组成及结构,（,1,）蛋白质,（,2,）多糖：具有免疫原性,较蛋白质弱。,（,3,）核酸：多无免疫原性。,3.,结构的复杂性,4.,分子构象,5.,易接近性,6.,物理状态,二、宿主方面的因素,1.,遗传因素,同种动物不同品系及不同个体对同,种抗原产生不同强度的免疫应答。,2.,其他因素,年龄、性别与健康状态。,三、免疫原的剂量及进入途径,（,1,）剂量,1,）剂量不足或过多均不引起免疫应答。,2,）重复进入引起强免疫应答。,（,2,）途径：皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、呼,吸道和口服免疫应答水平依次降低。,抗体产生的一般规律,?,初次应答和再次应答规律。,抗体产生的顺序规律：,IgM-IgG-IgA-IgD-IgE,初次应答和再次应答抗体产生比较,实验方案,?,免疫佐剂制备及动物初次免疫（第一周）,?,再次免疫及血清采集（第二周）,?,血清采集及抗体检测（第三周）,W1,W2,W3,未免疫血清采集,再次免疫血清采集,初次免疫血清采集,初次免疫,再次免疫,实验材料,?,动物：,昆明鼠（每组一只），约,20g,只。,?,抗原：,4mg,ml,牛血清白蛋白（,BSA),?,佐剂：,完全福氏佐剂。,?,其它：,PBS,、,1ml,塑料管（保存血清用），无菌小试管，,棉签，,1ml,注射器、,12,针头等。,实验流程,12,只,小,鼠,小鼠眼眶取血制备血清,2,只,2,只,8,只,W1,W3,W2,初次,免疫,（,1,只,/,组）,再次,免疫,1.5,ml,BSA,1.5ml,完全,福氏佐剂,搅拌,完全乳化,第一周实验步骤,1.,抗原制备,滴于水中经久不散,2.,动物免疫,?,用,1ml,注射器,12,针头吸出完全乳化的抗原,1ml,；,?,换,4,针头双后足垫和背部皮下接种，每处约,10-20ul,。,(,接种处先用碘酒、酒精消毒,),?,将免疫后的小鼠放回鼠笼。,?,1ml,注射器（内有乳化好的抗原）贴好标签，,4保存下次用。,第一周实验步骤,3.,采集阴性血清,（,每班,2,只,）,?,用无菌小试管收集未免疫小鼠血（眼眶,放血法），标记后送准备室；,?,2,000 rpm,离心,10,分钟,;,?,吸取血清置,1ml,塑料管，做好标记,;,注意,:,老鼠断颈椎处死后放到楼梯口的红桶,第一周实验步骤,第二次课内容,抗原抗体反应,抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复,合物,。,物质基础,:,1,）抗原表位与抗体高变区间的互补结合,2,）抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表,面的结合,3,）抗原抗体之间的结合力,4,）亲水胶体转化为疏水胶体,抗原抗体结合力,?,静电引力,（,electrostatic forces,）,?,范德华引力,:,作用最小,（,van der Waals interactions,）,?,氢键,:,最具特异性,（,hydrogen bond,）,?,疏水作用力,:,作用最大,（,hydrophobic,interactions,）,抗原抗体结合力示意图,抗原抗体的亲和力和亲合力,?,亲和力：抗体分子上一个抗原结合点与,对应的抗原决定簇之间相适应而存在着,的引力，是抗原抗体间固有的结合力,?,亲合力：抗体结合部位与抗原表位之间,结合的强度,亲水胶体转化为疏水胶体,?,抗原抗体的结合后，使水化层表面电荷减少或消失，,水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化,为疏水胶体。如再加入电解质，如,NaCl,，则进一步使,疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。,抗原,(,亲水胶体,),抗体,(,亲水胶体,),抗原抗体复合物,(,疏水胶体,),电解质,可见反应,+,抗原抗体反应的一般规律,?,特异性与交叉反应,性；,?,可逆性：表面的结,合，有可逆性；,抗原抗体交叉反应示意图,?,适比性：适合的比,例，反应才可见；,?,阶段性：不可见,可见反应；,?,条件依赖性：,PH,，,温度，电解质。,抗原抗体反应比例性示意图,?,血清制备：,取首次免疫后的小鼠,2,只，采集血清,(,方,法同上,),标记后冻存备用。,?,再次免疫：,其余小鼠于,腹腔和背部皮下,注射上次制,备的乳化抗原，每鼠注射,0.5,ml,。,第二周实验步骤,第三周实验步骤,血清制备：,?,采集剩余小鼠血,将血置室温半小时凝固,;,?,2,000 rpm,离心,10,分钟,;,?,吸取血清置,1ml,塑料管，做好标记,.,血清抗体检测：,以,ELISA,测定抗体效价，以未免疫鼠,血清作对照。,Thanks!,
