微藻工厂化培养经验分享.doc

微藻工厂化培养经验分享（附单胞藻的培养配方）大家好，很高兴今天能跟大家交流一下微藻的规模培育。规模培育在水产养殖方面现在主要运用于大棚生物饵料方面(一定地点建立车间、浓缩之后近距离管道运输到养殖区域)、提取色素添加在饲料中，至于土塘泼洒，如何控制量、增氧和开口饵料这方面正在摸索，需要大家一起总结出经验。今天我跟大家主要跟大家分享一下藻种的工厂化规模化培育。群里面应该很多人都培育过藻，大家都知道藻种的培育分为一级、二级、三级培养，今天我是简单从一级、二级、三级培养过程可能中遇到的问题、日常管理、接种、藻种营养配方这些方面做一下简单的交流。因各地环境气候、温度、光照、水质条件不同。不同季节、藻种性质不同，单位水体养殖品种的需求量也不同。所以培养条件、营养盐配方等各有不同。今天我主要是以金藻为例，引申出其他藻种的营养配方，让大家学习一下其中的相似点。国内大部分水产育苗企业，在育苗生产中都是自备微藻养殖设施，自行生产各类饵料用微藻。但是一般育苗场都普遍缺乏相应的专业技术力量，只能利用各自的藻池和天然水体粗放培养，在饵料微藻种质、生产技术和应用方法上都各自为正，导致微藻种质混乱、供应不稳定、营养成分不平衡、饵料效价低、缺乏多品种集约化生产应用技术；同时，受限于微藻高密度养殖、采收技术和浓缩液保藏技术的限制，国内几乎没有统一的、专业化的饵料微藻质量标准和集中供应点。所以工厂化育苗需要及时的补充藻种，开口饵料非常重要。首先从工艺流程上来说一级培养：主要用于保种，主要用的仪器是锥形瓶，其能够完全消毒，所以应用在保种上面特别多。二级培养：主要是用塑料白桶（聚丙烯材料），生产上也用20L的饮水桶，但是瓶口小，操作不方便，消毒也不彻底；而用氧气袋又易破裂。在南方经常可以见到用玻璃制作的大型鱼缸和氧气袋。回复举报|来自Android客户端2楼2016-03-03 08:04··· xiazaiba06··知名人士10三级培养：主要有小型的10 m3、20 m3、30m3左右的室内水泥池，采光良好，白色透明玻璃钢瓦或塑料薄膜于车间顶部用于培育藻种。接下来我主要简单的讲一下容器和工具的洗涤、消毒。培藻过程中所有的容器和工具，比如锥形瓶、矿泉水桶、搅拌棒等必须经过去污渍、肥皂等刷洗，之后再用消毒后的蒸馏水冲洗3-4遍。消毒的方法一般有加热消毒法、化学试剂消毒法、紫外线消毒法。一般小型仪器用加热消毒法，比如锥形瓶，方法是在锥形瓶瓶口放一培养皿，瓶中加水，煮沸，煮沸完之后，用牛皮纸或纱布包住，备用，这种方法能杀死营养体的部分芽孢。大型仪器、工具、培养池用化学药品消毒（漂白粉、酒精、高锰酸钾、铬酸洗液等），漂白粉的有效氯含量一般是30-35%，漂白精的有效氯的含量是漂白粉的2倍，消毒时按1/10000-3/10000的含量配成水溶液，浸泡容器、工具半小时，再用消毒水冲洗3-4次（消毒水既是煮沸、沉淀、过滤其中的水）。水泥池的消毒可配成高浓度的浆糊状漂白溶液，淋洒池壁，半小时后用消毒水冲洗干净。也可以用较低含量的漂白粉进行全池浸泡后，用消毒水冲洗，停放12小时后才可使用。酒精消毒一般用于人为操作，如在活化藻种、摇瓶或者搅拌的时候，涂抹手，消毒小的仪器上使用。酒精一般是配置成70-75%左右，杀菌效果是最显著的，使生物蛋白脱水变性凝固，故有杀菌效果。海水的消毒，一般海水的消毒有过滤和加入化学消毒剂法。因为海水消毒主要用于三级培养，三级大规模培养时候主要用于杀灭有害生物，处理水必须无毒，对培养藻类的生长繁殖影响不大。水消毒必须简单、经济、易行，不然大规模运水特别多的时候培藻成本会加大。补充：消毒海水时可根据培养的目的和方式选用以下方法之一。1、加热消毒法：经沉淀、过滤的海水，一般加温至90左右维持5分钟或达到沸腾即可。由于海水中的一些对藻类生长有促进作用的有机物在高温时易遭破坏，所以加温时间不宜太长。2、过滤除菌法：把经沉淀的海水先经砂滤，把大型生物和非生物杂质去除，再用陶瓷过滤罐过滤，除去微小生物。3、次氯酸钠消毒法：按每立方米海水20毫克有效氯的量加入次氯酸钠溶液，充气10分钟后停气，经67小时消毒后，按每立方米水体25克的量加入硫代硫酸钠，强充气46小时，用硫酸-碘化钾-淀粉溶液测试，若无余氯即可使用。4、紫外线消毒：有成型的紫外线消毒器可供选用。但此法不易杀灭较大的浮游动物。最好和过滤法结合使用。加热消毒我们就不解释了。主要是过滤除菌消毒，沉淀后的海水经过纱虑池纱虑大型的生物及非生物杂质出去，再经陶瓷过滤罐过滤，除去微小生物，也可两次纱虑，两次纱虑也可以起到比较好的效果。漂白粉和漂白液消毒的时候，向水中加入漂白粉和漂白液，用硫代硫酸钠中和余氯，中和余氯的过程以及操作流程的具体步骤如下：氯含量测定 方法一硫代硫酸钠滴定法需要的物品:1%碘化钾溶液 (1 g溶于100ml水中)1.58%硫代硫酸钠溶液 (1.58g溶于100ml水中 )HCI 37%样品溶于一定数量的水中的溶液（即稀释一定倍数）程序在滴定瓶中加50ml碘化钾溶液，0.25ml HCI 和1ml样品溶液，这时候瓶中溶液应该变为褐色用硫代硫酸钠滴定，直到瓶中溶液变为澄清（没有颜色）。每ml硫代硫酸钠可以中和3.55ppt的氯样品溶液的氯浓度 = 硫代硫酸钠的毫升数×3.55 ×100/1000(%) 样品的氯含量=样品溶液的氯浓度×样品稀释倍数方法二1 试剂（1）KI溶液：10%。（2）淀粉溶液：0.5%。 称取0.5克可溶性淀粉于小烧杯中，用少量水搅匀后加入 100ml的沸水中，加入后不断搅拌，并煮沸至溶液透明为止。加热时间不易过长且应迅速冷却，以免降低淀粉指示剂的灵敏性能。如需久存，可加入少量的HgI2或ZnCl2等防腐剂。（3）H2SO4溶液：2 mol/L。（4）K2Cr2O7标准溶液：0.1000 mol/L。将K2Cr2O7在150-180烘干2小时，放入干燥器中冷却至室温。准确称取1.2258克于100ml烧杯中，加蒸馏水溶解后转入250ml容量瓶中，用水稀释至刻度充分摇匀。（5）Na2S2O3溶液：0.1 mol/L。将12.5克Na2S2O3 ·5H2O溶解在500毫升新煮沸冷却后的水中，加入0.1克碳酸钠，储于棕色瓶中并摇匀，保存于暗处一周后标定使用。（低浓度的溶液需稀释）（6）丙二酸：20%溶液。2 实验步骤（1） 硫代硫酸钠溶液的标定用25毫升移液管吸取0.1000 mol/L重铬酸钾标准溶液三份，分别置于250毫升碘量瓶中，加入5毫升6N盐酸、5毫升20%KI，摇匀后在暗处放置约5min，待反应完全，用100毫升水稀释。用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液由棕色到绿黄色，加入2毫升0.5%淀粉指示剂，继续滴定至溶液由蓝色至亮绿色即为终点。根据消耗的硫代硫酸钠溶液的毫升数计算其浓度。（低浓度的溶液标定类似）（2） 有效氯含量的测定取10毫升待测消毒溶液，置于250毫升碘量瓶中，加入2 mol/L 硫酸 10毫升，10%碘化钾溶液10毫升，此时溶液出现棕色。盖上盖并振摇混匀后加蒸馏水数滴于碘量瓶盖缘，在暗处放置约5min。打开盖，让盖缘蒸馏水流入瓶内。用硫代硫酸钠溶液（装于25毫升棕色滴定管中）滴定游离碘，边滴边摇匀，待溶液呈浅棕黄色时，加入10滴0.5%淀粉指示剂，溶液立即变蓝色，继续滴定至溶液由蓝色至无色即为终点。记录消耗的硫代硫酸钠溶液的毫升数（V，ml）。重复测3次，取3次平均值进行以下计算。 因1 mol/L硫代硫酸钠标准溶液营养盐接下来说一下营养盐的加法。以金藻为例，金藻的生长繁殖过程中必须每个营养元素都有一个最低量，如果低于这个最低量，生长繁殖则会受到抑制，如果某种营养的含量过高也会对藻类产生毒害作用，甚至死亡，因为含量过高会破坏渗透压系统，让藻脱水死亡。今天我跟大家说一下金藻的营养盐，一般主要的营养盐配方是F/2，营养盐有大量元素、微量元素以及维生素，大量元素一般都是硝酸钠（NaNO3）、磷酸二氢钠（ NaH2PO4），微量元素有锌（Zn）、锰（Mn）、钼（Mo）、钴（Co）、铜（Cu）、铁(Fe)，维生素有维生素B1（VB1）：主要是辅助糖类代谢，对能量起到积极的作用、维生素B12（VB12）：有利于铁的利用，促进代谢等发育成熟、维生素B6（VB6）：活化多种酶，有助于VB12的吸收等、生物素（VBH）：脂肪和蛋白正常代谢不可或缺的物质，是一种维持生长、繁殖的营养素。培藻过程中如果是人工繁殖时，在光照、营养盐、PH适合的情况它会非常大规模的繁殖。此时，水体中的二氧化碳会成为藻类繁殖的限制因子。现在金藻和其它藻在人工繁殖的时候，碳源的补充是非常重要的，因为其它营养盐可以通过正交分解得出最优的含量，而在藻体繁殖过程中光合作用需要大量的二氧化碳，从而导致碳源的需求量增大，这时根据情况人为补充碳源的话会起到非常好的繁殖效果，可通过气石、搅拌等方式补充二氧化碳。培藻过程中如果是人工繁殖时，在光照、营养盐、PH适合的情况它会非常大规模的繁殖。此时，水体中的二氧化碳会成为藻类繁殖的限制因子。现在金藻和其它藻在人工繁殖的时候，碳源的补充是非常重要的，因为其它营养盐可以通过正交分解得出最优的含量，而在藻体繁殖过程中光合作用需要大量的二氧化碳，从而导致碳源的需求量增大，这时根据情况人为补充碳源的话会起到非常好的繁殖效果，可通过气石、搅拌等方式补充二氧化碳。培养金藻的时候，一般一、二级用康维方，康维方一般基于F/2配方基础上的一个配方，而三级培养的时候用金藻培养液。金藻培养液：硝酸钠溶液：磷酸二氢钾溶液:柠檬酸铁氨=100：10：1，1000ml灭菌海水。在三级培养的时候，营养盐的添加都是1:1000的添加，就是1毫升的营养盐添加到1L的水体中。在生产时可以为了生产等便利，可以放大配方比例，在大规模的培养中1：10000的添加也是可以的。实验结果当然是1:1000最好，但是实验和实际生产中肯定有一定的误差，在实际生产中1:10000也可以正常的培育出高密度的金藻。当然在大规模的培养中1：10000的添加，起到的效果稍微差一点，但也不会差到哪里去。接种接下来就是接种，接种其实也是一个很简单的操作，接下来我简单说明下。金藻在二级培养（高密度扩大培养的时候），能达到700800万个cell/ML，扁藻能达到100150万个cell/ML，小球藻也能达到1000万个cell/ML。接种就是把作为藻种的藻液接入新配好的培养液中，进行丰富培养。接种的过程虽然简单，但要注意藻种的质量、藻种的密度、接入藻液的数量以及接种的时间等问题。藻种的质量我们可以根据藻细胞运动、附壁、沉淀、镜检颜色，观察它的质量好坏。金藻是金褐色，硅藻是呈黄褐色，绿藻是鲜绿色，有运动能力会上浮，没有运动能力均匀漂浮在水中。附壁和沉淀：好的藻种一般没有明显的附壁，如果藻种受到环境因子等各方面的不适宜条件的时候，会大量的聚集沉淀。镜检的时候一般都是观察颜色和运动，有无杂藻，有无大的原生动物和虫子，水体中的藻种是否过关。接藻的时候，金藻培育从二级向三级接的时候，金藻藻细胞达到250万/毫升的时候就可以接种了。一级培养或小型培养可以是1:2或者1:3的接种，二级培养或生产培养可以是1:10、1:20、1:40的接种也可以正常生长。刚说的这些，1:20不清楚，我举一些简单的例子，假设5000Ml的锥形瓶，培养5000ML的藻液，可以接种1个 20L的矿泉水桶，3个20L的矿泉水桶可以接种1m3的保种池，1m3米的保种池可以接种2个5m3的生产池。接种时间一般选择在早上的8:0010:00，这时候选择接种是因为藻体的活性随着光照、环境温度的上升，活性是最好的，接种的时候它能够快速的进入到指数生长期。培养工艺，金藻培养有一次性施肥、混合营养盐的施肥和碳酸氢钠分批次的施肥。金藻在国内现在应该是开放式半连续培养。日常管理日常管理是非常重要的一块，跟消毒一样。比如你培养了30m3的水池，如果你培养时从颜色等感觉还行，突然之间有可能全部死亡，可能是你日常管理不规范、不细致，引起杂菌繁殖和无法探知的原因导致培养的藻体全部死亡。2.2 亚心形扁藻培养液NaNO3 0.05克KH2PO4 0.005克FeC6H5O7 (1%溶液) 0.2毫升维生素B1 200微克维生素B12 200毫微克人尿 2毫升海水 1000毫升3、硅藻培养液配方3.1、湛江水产学院硅藻培养液NaNO3 0.08克KH2PO4 0.008克FeC6H5O7 (1%溶液) 0.2毫升Na2SiO3 0.02克维生素B1 200微克维生素B12 200毫微克人尿 1.5毫升海水 1000毫升培养三角褐指藻、小新月菱形藻、钙质角毛藻、牟氏角毛藻。3.2、中肋骨条藻培养液KNO3 0.4克Na2HPO4 2H2O 0.04克K2SiO3 0.02克Fe(SO4)3 7H2O 0.014克土壤提取液 15毫升“920”植物生长激素 45国际单位海水 1000毫升3.3 牟氏角毛藻配方NH4NO3 520毫克KH2PO4 0.51毫克FeC6H5O7 3H20 0.52毫克海水 1000毫升4、金藻培养液配方4.1 “f /2”培养液NaNO3 74.8毫克NaH2PO4 4.4毫克Na2SiO3 9H2O 8.416.7毫克f /2微量元素溶液 1毫升f /2维生素溶液 1毫升海水 1000毫升4.2 等鞭金藻OA-3011培养液（陈椒芬等）NaNO3 0.06克K2HPO4 0.004克FeC6H5O7 0.5毫克Na2SiO3 0.005克维生素B1 100500微克维生素B12 0.51.5毫克NaHCO3 1克海水 1000毫升二、微量元素溶液配方1、A5-B6微量元素溶液配方A5：H3BO3 2.86克MnCl2.4H2O 1.81克ZnSO4.7H2O 0.22克CuSO4.5H2O 0.08克Na2MoO4 0.021克纯水 1000毫升H2SO4 （浓） 1滴B6NH4VO3 229.6毫克Cr2(SO4)4.24H2O 960.2毫克NiSiO4.6H2O 447.8毫克Co(NO3)2.6H2O 493.8毫克Ti溶液 20毫升0.2摩尔/升 H2SO4 1000毫升Ti溶液配法：把736.6克草酸钛溶解于少量纯水中，加入氢氧化铵使成碱性，发生沉淀。用离心机将沉淀集中，用0.2摩尔的硫酸20毫升溶解。用量：每1000毫升培养液中加入A5、B6溶液各1毫升。2、“f /2”微量元素溶液ZnSO4.4H2O 23毫克MnCl2.4H2O 178毫克CuSO4.5H2O 10毫克FeC6H5O7.5H2O 3.9克Na2MoO42H2O 7.3毫克CoCl2.6H2O 12毫克Na2EDTA 4.35克纯水 1000毫升每1000毫升培养液加1毫升。三、维生素溶液配方1、维生素溶液S3硫胺素盐酸盐 0.05克尼古丁酸（烟酸） 0.01克泛酸钙 0.01克对氨安息香酸 1.0克维生素H 0.1克肌醇 0.5克叶酸 0.2微克胸（腺）间氮苯 0.3克纯水 1000毫升每1000毫升培养液中加入1毫升。2、“f /2”微生素溶液维生素B12 0.5毫克维生素B1 100毫克维生素H 0.5毫克纯水 1000毫升1000毫升培养液中加入1毫升。现在很多情况下我们都是藻种培养规模培育之后，很多人希望运用到土塘培养方面，土塘水质调控、开口饵料等方面（单位幼苗生物饵料投喂量），但是给土塘如何泼洒、如何控制那个量，起到最好的增氧效果方面，我在天津做的时候我的一个老师建议我别往这方面做，因为各地环境因子等不同，在室外培养受到天气、气候等的影响，不利于培养。所以我只是以金藻为例，把培育藻的简单的操作和需要注意的一些点跟大家交流一下，希望有能力、有想法的、自己想做的可以往土塘方面发展，因为个人能力有限，各地情况不同，我也总结不了这么多东西。