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微生物检测基础,质量人,一什么是微生物？,微生物是指所有形体微小，具有单细胞或简单的多细胞结构，或没有细胞结构的一群最低等的生物。,整个微生物家族的主要成员有：病毒、细菌、霉菌、酵母、蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体、微细藻类、原生动物。,病毒,没有细胞结构的专性寄生的大分子生物。如流感病毒、肝炎病毒（人体病毒），鸡瘟病毒、口蹄疫病毒（动物病毒），烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒（植物病毒），噬菌体（细菌和放线菌病毒）等。,细菌,单细胞原核生物，一般在普通光学显微镜（油镜）下放大一千倍以上并染色才能清楚看见其个体。如人体肠道内的大肠杆菌、粪链球菌，用于酿醋的醋酸杆菌，使牛奶变酸的乳酸杆菌，生产味精的谷氨酸短杆菌，生产淀粉酶的枯草杆菌等。,2023/4/1,5,酵母菌,单细胞真菌，最低等的真核生物。一般用高倍镜（401600倍）观察其个体细胞形态。如面包酵母、酿酒酵母、红酵母等。,霉菌,真核生物，单细胞或多细胞丝状真菌可用低倍或高倍镜观察其形态。如酿制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生产葡萄糖的曲霉菌、生产青霉素的青霉等。,蓝细菌（蓝绿藻）,原核微生物，单细胞或细胞聚合体。,单细胞，介于细菌与病毒之间的一类原始而小型的原核微生物。,支原体、衣原体、立克次氏体,微细藻类,单细胞藻类。如红藻、绿藻、小球藻等。,原生动物,单细胞，无真正细胞壁。如变形虫、吸管虫、草履虫等。,二微生物的特性,主要有五个方面,1种类多,到目前为止，人们已认识的微生物已有10多万种。,2分布广,微生物因其形体微小，重量轻，故可以随着风和水流到处传播。,3繁殖快,微生物惊人的生长繁殖速度是其他任何生物都望尘莫及的。一般细菌的世代时间为几十分钟到一百多分钟。在最适宜的条件下，人们最熟悉的大肠杆菌每1320min就可分裂出新的一代。,4代谢强,微生物的代谢强度比起高等生物要高出几百到几万倍，主要表现在吸收多转化快。,5易变异,微生物容易发生变异的主要原因是个体多为单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结构，因而在受到外界物理或化学因素影响后，很容易引起细胞内的遗传物质发生突变，结果导致遗传性状，包括形态或生理表型上的变异。微生物易变异的另一个原因是细胞增殖速度快，细胞数量多，因而尽管其自发突变率很低，也会造成在短时间内产生较多的变异后代。,三常见微生物的 形态结构,四实验室微生物的培养,实验室中微生物生长（培养）在液体或固体培养基中。细菌生长的培养基应含所有生长的基本需求：能量、碳源、氮源以及基本的离子，磷、硫、钠、钙、钾和铁及各种微量元素。,原养型不需要在培养基中添加另外的成分，而营养缺陷型需要添加生长因子如氨基酸、维生素和含氮碱基。所用的培养基可以是所有成分及量均确切知道的限定培养基（合成培养基）和含有不确定营养物混合物的天然培养基。,琼脂（洋菜）是用来固化液体培养基的。选择培养基或鉴定培养基是用来检测特殊微生物类群的。,生长培养基,实验室中细菌通常生长（培养，cultured）在摇瓶、瓶子或称作发酵罐的大培养容器液体培养基中或在圆的、通常为塑料、灭菌碟子培养皿的固体培养基中。,将微生物引种在这些培养基上称为接种（inoculation）。,培养基的性质取决于微生物的天然环境和微生物生长的营养要求。分离大量微生物或基产物用液体培养基，固体培养基用于个别细菌的分离和保存。,限定培养基或合成培养基,含有通常为特殊微生物生长基本要求的确定成分。通常是简单的（最低的）、含有最低生长要求的培养基。,天然培养基 天然培养基含有不确定的成分如蛋白胨（大豆粉酶消化液）和提供足够营养成分的酵母提取物（氨基酸、维生素、糖和碱基），适合广泛范围微生物的生长。天然培养基如营养肉汤（NB）和胰胨、豆胨肉汤（TSB）是实验室中常规用的细菌培养基，特别对生长要求还未确定的细菌生长使用。,常用血液作培养基的附加成分分离人类病原菌，由于它提供许多难养的人类病原菌生长的基本营养，如链球菌。特殊的选择培养基和监别培养基经常用于分离特殊的微生物类群，尤其在医院的实验室中。,选择培养基与鉴别培养基设计这些培养基是为选择特殊类群的微生物或鉴别两种菌种时用。选择培养基含有抑制非目的细菌生长的成分，鉴别培养基是添加某种营养物或和化学物质，促进所要的微生物生长，使在鉴别培养基平板上两种不同的微生物的菌落可以区分开来。,生长的环境条件,温度 氧浓度 PH 水活度,温度,嗜冷微生物适合于10生活的细菌，最适生长温度在20左右。嗜温微生物生长温度在1545之间，最适生长温度在37左右的细菌。嗜热微生物生长温度在3075之间，最适生长温度在55，在100以上温度生长，称为嗜高热微生物。,氧浓度,根据细菌对氧要求的不同分为好氧菌，厌氧菌，包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌、耐氧菌微好氧在正常大气氧浓度20情况下就受到损伤，只能在更低的氧浓度下才能存活。,pH值,嗜碱菌（alkaliphiles）：生长在高pH（8.511.5）的微生物。嗜酸菌（acidophiles）：生长在低pH（05.5）中的微生物。,水活度,像所有生物一样，微生物对周围环境的渗透压是敏感的。低渗透压时，水将聚集于细胞内，高渗透压时水逸出。,五微生物的生长,1细菌以二等分裂方式（124）分裂，细菌的生长为指数生长。群体细胞数目加倍所需的时间为倍增时间（td）。,细菌典型生长曲线,log10 稳定期（平衡期）活 细 对数期 衰亡期（死亡期）胞 延迟期（指数期）数（延滞期）培养时间,2真菌的生长,真菌是丝状的、无光合作用的、营异养性营养的真核微生物。,真菌生长的各个时期,稳定期 细 减速期 胞 直线期 自溶期 数 目 延迟期 指数期 培养时间,3微生物生长的测定方法,微生物的生长可用原生质的增加、细胞数目的增加或以代谢活动情况作指标。根据细胞 的干重或某一化学成分如总氮含量数量很少，以至误差很大。最常采用的微生物生长的方法是统计群休数目。,(1)活菌计数法,有时一个菌落并非绝对地都是由一个单细胞所长成的，往往两个或两个以上相连结的细胞只长成一个单菌落；有些细胞比其它细胞较早地分裂，分裂的速度也快，于是它就首先出现可见的菌落，而其它的细胞较迟才出现菌落，所以，必须培养足够长的时间，才能使所有的菌落增至足以肉眼看见的大小，一般至少需要24-48小时，有些生长较缓慢的微生物甚至需要几天至一星期；此外，要控制培养皿内出现的菌落数不宜过多。,（2）计算器法,将待检菌液充分混匀，注入改良纽氏血球计数板，计数一定量的菌液中所含菌数，计算出每毫升所含菌数。,（3）比浊法,据细菌悬浮液的透光量间接测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光的穿透量成反比，与光密度成正比。对于丝状真菌的生长率，可以根据菌丝的生长长度或菌丝增加的重量。,六微生物生长的控制,使工作者免受他们所研究的微生物伤害和所研究的微生物培养物不受环境中其他微生物污染的方法称作无菌（灭菌）技术。,1灭菌方法,2023/4/1,62,自动高压蒸汽灭菌锅,2消毒剂与防腐剂,消毒剂是用于非生命体杀菌的化学物质防腐剂是能杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质，这类物质对活组织是无毒性。,七微生物的观察,1细菌的染色,原理：细菌是无色透明的。在光学显微镜下，菌体与其背景相差很小，不易看清细菌的形态和结构，故通常要对细菌用染料染色，以增加菌体与背景的反差，便于在光学显微镜下观察。,细菌染色所用的染料，按其所带电荷状态分，碱性染料和酸性染料。碱性染料：结晶紫、龙胆紫、碱性品红（复红）、蕃红、美蓝、甲基紫、中性红、孔雀绿等。酸性染料：酸性品红、刚果红、曙红等。在通常的培养条件下细菌带负电，碱性染料带正电荷，易与菌体的酸性物质（带负电荷的细胞成分有核酸和酸性多糖）牢固地结合。所以，多采用碱性染料染色。只有在分枝杆菌属（Myoobaoterium）或诺卡氏菌属(Macardia)中的一些菌才能用酸性染料（石碳酸品红）染色（抗酸性染色）。,方法简单染色和复合染色法。简单（单）染色法只用一种染料染菌体，目的仅为增加反差，便于观察。复合（杂）染色法是用两种染料染色，以区别不同细菌的革兰氏染色反应或抗酸性染色反应；或将菌体和某一结构染成不同颜色，便于观察。,革兰氏染色法,革兰氏染色是最普通的细菌染色之一，根据它们细胞壁的结构，把细菌分成两类。革兰氏阳性细菌细胞围绕原生质膜的外膜是由厚的肽聚糖层组成。革兰氏阴性细菌只有一个薄的外部的肽聚糖层，但在其外面还有第二层胞壁外膜。革兰氏阳性细菌用乙醇冲洗时保留了结晶紫和碘的复合物，因此光学显微镜下呈现紫色。革兰氏阴性细菌由于它们失去了结晶紫和碘的复合物，并且吸收了较浅的石炭酸复红，复染成粉红色。,2023/4/1,72,革兰氏染色法,（1）用接种环取少量细菌在干净的载玻片上涂布、固定。（2）用草酸铵结晶紫染色。（3）用弱酸性媒剂碘碘化钾溶液媒染。（4）用中性脱色剂，如乙醇或丙酮脱色，能被脱色的叫革兰氏阴性菌，其菌体无色；不能被脱色的叫革兰氏阳性菌，其菌体呈紫色。（5）以上四步已能区分两大类细菌，为了使革兰氏阴性菌易被观察，还需用与草酸铵结晶紫颜色鲜明对比的品红或蕃红复染。经脱色的革兰氏阴性菌被染上红色，没有脱色的革兰氏阳性菌染不上红色，仍呈紫色。,革兰氏染色法步骤,八微生物的分离,细菌的纯培养,实验室中通常需要细菌的纯培养，即所有的细胞都来自同一个最初的细菌。采用划线平板法和倾注平板法接种细菌到琼脂平板以获得彼此分离的单个细菌细胞。经合适温度培养后，每一个细菌形成一个肉眼可见的菌落，含有相当于109个细菌细胞。,划线 划线 烧接种环 烧接种环 灭菌通过本生煤气灯 培养后的 单个 菌落 烧接种环 划线 划线分离细菌培养物为单菌落的示意图,转移1ml 转移1ml 转移1ml加1ml菌液计数 10-1 10-2 10-3 10-40.1ml涂布平板 计数太多 62个菌落 计数太少 菌落数目稀释倍数细胞数（菌落形成单位，CFU）ml原菌液 6210310（吸取0.1ml到平板）6.2105CFU/ml,2023/4/1,78,微生物检验的质量控制,2023/4/1,79,前言,在实际工作中存在许多复杂因素影响微生物学检验，可能给检验结果带来偏差甚至错误，因此必须对影响检验结果的诸多因素采取控制手段保证检验结果的正确性，不断完善微生物检验的质量控制。,2023/4/1,80,主要内容,1 检验人员 2 仪器、设备 3 检验培养基、试剂 4 检验环境 5 采样 6 样品的接收和预处理 7 检验质量 8 校验的执行 9 参考菌株及其保存 10 实验室内外部质量控制 11 检验报告及结果质量控制,2023/4/1,81,1 检验人员,（1）微生物检验不能完全依赖全自动鉴定仪器，检验工作中每一步骤均需要有高度的主观分析和判断能力，与个人的经验、技能和微生物检验基础知识水平密切相关。（2）除要求微生物检验人员必须具备严肃认真的工作态度、精密细致的观察和操作习惯，注重个人卫生外，还必须熟练掌握微生物学检验技术。,2023/4/1,82,1 检验人员,（3）检验人员应执行上岗前培训制度，上岗前培训合格方能上岗操作，还要主动参加学习、培训、讲座，学习新技术，掌握微生物学检验方法、标准及相关法律法规；（4）参与编写测试程序及仪器操作程序，学习质量保证体系知识和计量学基本知识；,2023/4/1,83,1 检验人员,（5）参加各类水平测试和盲样测试，提高检测水平和分析问题、解决问题的能力；（6）微生物学检验室负责人应定期对检验人员进行专业知识和操作熟练程度的考核，提高检验人员的素质。,2023/4/1,84,2 仪器、设备,大型微生物检验室的主要仪器及设备包括：无菌室、微生物自动鉴定仪、微生物快速初筛仪、显微镜、菌落计数器、高压灭菌器、干热灭菌器、离心机、蒸馏设备、培养箱、厌氧箱、水浴箱、冰箱、超净工作台、酶标仪、洗板机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。,2023/4/1,85,2 仪器、设备,要求所有的仪器和设备均应按照生产厂家提供的方法和有关规定正确使用。需要强制性定期检定的仪器和设备，经符合资历的计量部门校准合格后方可使用。对于常用的贵重仪器和设备，在使用前应加以检查，使用后要登记，要做到定期维护，以保证仪器处于良好的工作状态。,2023/4/1,86,2.1 高压灭菌器,（1）操作人员应了解蒸气灭菌的原理并遵守操作规则。（2）放入的灭菌物品不宜放得过挤。（3）使用时，放入必要的监视指标，可选用121、15min 或121、30min监视指标。（4）生物指标为嗜热脂肪芽胞杆菌的耐受性（121，15min）。（5）灭菌后，再培养观察有无细菌生长。（6）也可采用水银留点温度计进行校准。,2023/4/1,87,2.2 干热灭菌器,（1）应遵守操作规则，放入箱内灭菌的器皿不宜放得过挤，器皿与内层底板不能直接接触。（2）灭菌完毕，不能立即开门取物，须关闭电源，待温度自动下降至50以下再开门取物。（3）带有纸包装的物品灭菌温度不能超过160。,2023/4/1,88,2.3 培养箱,（1）箱内不应放入过热或过冷的物品，取放物品时，应随手关闭箱门，以维持恒温。（2）如培养物不慎泼洒到箱内，马上清洁，需消毒的马上消毒。（3）培养物不宜与培养箱最底层直接接触。（4）必要时，可放入装水容器以维持箱内的湿度。（5）每天记录温度及湿度的变化，观察培养箱内温度与设定温度是否一致。在两次计量周期之间要进行内部校准。,2023/4/1,89,2.5 显微镜,按说明进行操作。使用油镜后先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用沾上二甲苯的擦镜纸擦拭，最后用干净擦镜纸擦干。注意防尘，保持清洁、干燥。,2023/4/1,90,2 仪器、设备,实验室需要使用的无菌器具应能正确实施灭菌，无菌器具和器皿有明显标识，以便与非无菌器具和器皿加以区别。,2023/4/1,91,3 检验培养基、试剂,3.1培养基 微生物学检验所用干粉培养基，必须由专业厂家生产，产品质量必须符合有关的质量标准，保存也应符合要求，防止潮解、结块等。干粉培养基易受潮变性，需要重视。,2023/4/1,92,3.1培养基,为保证干粉培养基质量指标，在实际工作中应注意：（1）加强包装的密封性能；（2）使用时尽量缩短开盖时间；（3）一般干性培养基放在低温干燥的环境中保存，对于易受潮的品种，启用后宜放入干燥器中保存；（4）由于配制水分不同、启用次数或时间增加，干粉培养基的pH值可能会有所变化，应随时略加调整。,2023/4/1,93,3.1培养基,干粉培养基所要求的理化指标，可以从下面几个方面进行初步检查：（1）干粉培养基应为疏松颗粒状或粉末状，颜色正常、一致；（2）溶解后清彻透明，无沉淀；（3）45时pH值为7.2士0.2；熔化温度70左右，凝固温度为35-40；（4）水分含量符合标准。,2023/4/1,94,3.1培养基,商品化带培养基的平皿应对所用培养基作外观检查，如培养基是否开裂、平皿有无破碎、血平板有否溶血、有否冰冻、灌注是否均匀、有否过多的气泡，清晰度和有无污染也需要检查。培养基平皿的制备商必须按照标准随产品附上书面鉴定资料，实验室应将此鉴定书保存一定时期。,2023/4/1,95,3.1培养基,实验室自制培养基应有质量控制，包括：制备数量 制备日期 有效日期 制备者姓名还必须检查：培养基颜色 均匀度 厚度 光洁度 溶血与否 有否过多气泡 是否污染,2023/4/1,96,3.1 培养基,培养基的配制应严格按照标准规定的方法进行操作，并做好原始记录。为保证培养基质量，在配制时应注意：制备培养基必须在玻璃容器、搪瓷缸或铝锅中进行，如用铜、铁器皿，会对微生物生长有毒害作用；配制培养基时应按检验项目规定的配方添加，不得随意增减或更改培养基成分。,2023/4/1,97,3.1培养基,此外，要用专用的角匙取药品，避免交叉污染而影响检验结果；培养基配制最好用蒸馏水或去离子水，避免使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质；不同类型的微生物对pH值的要求不同，配制培养基时应测调pH值，如测定结果与所要求的pH值不符，则用lM NaOH或lM HCl溶液进行调节。,2023/4/1,98,3.1培养基,制备好的培养基应及时使用，使用不完的，如无特殊需求，可室温或低温2-8保存。如用塑料袋密封，保存期可延长，有产酸、产气等被污染迹象或干裂现象的则不能再使用。,2023/4/1,99,表1 培养基在2-8条件下保存的有效期,2023/4/1,100,3.1培养基,每批自制培养基必须做无菌试验和规定的质控菌株测试，对各种不同培养基规定了专门的质控测试菌株。无菌培养试验可将无菌的培养基放入37的培养箱培养2448小时(对于细菌培养基)或放入28的培养箱中培养5-7天(对于细菌培养基以外的其它培养基)，以检查灭菌是否彻底。,2023/4/1,101,3.1培养基,效果试验是指按不同的培养基接种相应的菌株，观察细菌的发育、菌落形态、色素、溶血等特征，据此判断培养基是否符合要求。,2023/4/1,102,表2 常见培养基的质量控制,注：+发育良好;发育差或不生长,2023/4/1,103,表2 常见培养基的质量控制,注：+发育良好；发育差或不生长,麦康凯培养基,大肠埃希氏菌,+,分解乳糖，菌落红色,2023/4/1,104,表2 常见培养基的质量控制,注：+发育良好；发育差或不生长,羊血琼脂,溶血性链球菌,明显的乙型溶血环,+,2023/4/1,105,表2 常见培养基的质量控制,注：+发育良好；发育差或不生长,2023/4/1,106,3.2 检验试剂及药品,检验药品、试剂须在分析纯(AR)级以上。在利用药品、试剂配制标准溶液、染色液、缓冲液及其他试剂时应注意：(1)按要求选取溶剂；(2)用带塞的试剂瓶盛装；(3)易分解的试剂宜用棕色瓶；(4)挥发性的试剂其瓶口应予密封；(5)如发现溶液有变质现象，应停止使用；(6)标准溶液应定时标定。,2023/4/1,107,3.2 检验试剂及药品,实验室内保存的试剂应定期进行清点，陈旧或损坏的试剂应弃去；注意保存试剂的使用有效期以及最佳保存方式。,2023/4/1,108,3.3 染色液,染色液配制后，必须选用适当的标准菌株作阳性及阴性对照来鉴定染色液的性能，如革兰氏染色选用枯草杆菌、葡萄球菌和大肠杆菌作为对照，鞭毛染色液采用普通变形杆菌和福氏志贺氏菌作为对照。对经验不足者，每次染色时均应作对照染色。,2023/4/1,109,3.4诊断血清,沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠埃希氏菌等诊断血清，使用时应注意有效期及效价。每月用相应的菌株检查其有效性，过期血清和变混浊的血清不应继续使用。诊断血清一般放普通冰箱内保存，使用时应以最短的时间暴露于空气中。最好备有两个生物制品研究所生产的诊断血清，以便互相对照，检查其可靠性。,2023/4/1,110,4 检验环境,微生物学检验均在检验室进行，既不能让微生物散布出去，又必须使样品不再受污染，更不能允许病原菌感染检验人员，为此，检验室的环境要求和卫生管理制度非常重要。实验室总体布局和各部位的安排应减少潜在的对样本的污染和对人员的危害。,2023/4/1,111,4 检验环境,微生物学检验室要求内外环境整洁，布局合理，操作区域与办公区域分开。洗涤室、培养室、消毒间、无菌室应分开，设有专室。无菌室要设有套间或缓冲间，最好设推拉门，以防空气振荡过大。微生物检验室应备有自动或脚踩式洗手池和固定的消毒设施。,2023/4/1,112,4 检验环境,微生物检验室应制定合理、完善的卫生管理制度，工作人员必须每天坚持做好环境卫生工作，防止灰尘飞扬，定期对操作环境进行消毒。对经培养后的培养基、培养液、用过的检样及其他废弃物，应投入指定的容器内，经无害化处理后方可排放，禁止乱扔乱放，以防某些病原微生物散布。,2023/4/1,113,4 检验环境,对需在无菌条件下工作的区域应以明确标识并能有效地控制、监测和记录。检验人员应待无菌室过滤净化装置开机0.51h后，再进入无菌室工作；每天记录环境检测报告，并经常进行空气落菌实验：空气落菌以营养琼脂开上皿15min后盖上盖子，361培养48h计数；定期对无菌室进行室内环境消毒，空气消毒可采用甲醛熏蒸法，甲醛与高锰酸钾比例2:1。,2023/4/1,114,5 采样,（1）采样工具和容器宜选用耐消毒灭菌的材料，如玻璃、陶瓷、搪瓷、铝、不锈钢、牛皮纸等，使用之前应进行认真清洗、干燥和相应的灭菌处理。采样工具和容器不能用消毒剂消毒，样品中也不得加入防腐剂，以免影响检验结果的正确性。（2）在严格无菌操作的条件下，按国家规定的样品采集标准均匀而准确地取样，并及时封口，使样品具有准确性和代表性。,2023/4/1,115,5 采样,（3）每件样品封口后，贴上标签，做好记录(如样品名称、采样地点、时间、数量、储藏情况、采集或送检单位及姓名、采样现场温度、湿度及卫生状况等)。采集后的样品，一般可保存在0-5的环境中，如果样品是冷冻食品，应保持在冷冻状态，并及时送检。（4）采样数量不能少于全部检验需要量的3倍，以供检验、复检、备查。,2023/4/1,116,6 样品的接收和预处理,样品送达实验室时，应检查样品标记是否与样品相符，样品包装状况是否正常。若存在下述情况，应考虑拒收样品：（1）抽样后样品送达实验室的时间太迟，使其不能在规定的时间内进行检验；（2）样品温度太高；（3）在转运中样品遭到破损或受到污染。,2023/4/1,117,6 样品的接收和预处理,若对这些样品进行分析，应将情况记录并在分析报告中加以说明。检验前，冷冻食品应在最高温度为4下解冻，不超过18h；较小、易解冻的样品可放置于最高温度为37的恒温箱内最长达15 min。,2023/4/1,118,6 样品的接收和预处理,微生物学检验室在收到样品后，必须及时准备条件、组织力量进行检验。送检的样品，一般需保持在05的环境中，对于冷冻食品应保持在冷冻状态，直到检验为止。,2023/4/1,119,6 样品的接收和预处理,冻藏的样品应尽快放在冷藏的温度下解冻，亦可放在适宜温度(37)下短时间(15min)使其解冻，但温度必须较低，以防止病原菌死亡。冻结样品化冻时，必须小心放置于细菌生长温度之下以免使细菌数量增加。从容器中取出样品、称取样品应注意无菌操作。,2023/4/1,120,7 检验质量,除按国家标准方法对所需检验项目进行检测外，在实际工作中还应注意以下几个方面，否则会影响检验结果的准确性：,2023/4/1,121,7 检验质量,（1）在定量检验时用重量法还是用体积法，检验结果会有误差，因为比重不等于1的样品，1ml和1g的化验结果绝不会相等。一般固态的样品宜用重量法，液体样品宜用体积法。但对于粘性液体(如酸牛奶)，如用体积法，会粘附一定量的样品在吸管上，因此此类样品最好用重量法。,2023/4/1,122,7 检验质量,（2）如检样需用无菌水或无菌生理盐水稀释，则最好用匀质器或组织捣碎机，以800010000转/min的转速处理1min，制成均匀的菌悬液。,2023/4/1,123,7 检验质量,（3）样品稀释时，常会滞留少量样品在吸管内外，应多加注意。吸管插入样品或稀释液中应深浅一致，否则会影响检验结果；吸入液体后，应沿管壁慢慢注入递增的稀释液中，特别注意此时吸管尖端切不可碰到稀释液中。,2023/4/1,124,7 检验质量,（4）在培养基倾注入检样、菌悬液时，注意培养基温度宜在45-50之间，并使培养基与检样、菌悬液充分混合。（5）微生物培养时，应根据要求选择正确的培养温度和时间。,2023/4/1,125,7 检验质量,（6）应用无菌水或无菌生理盐水作空白对照，如果在空白对照中检出细菌，则可认为培养基质量存在问题或在操作过程中存在污染情况。另外，采用标准菌种作阳性对照，观察培养基的质量情况。,2023/4/1,126,7 检验质量,（7）整个检验过程应严格遵守无菌操作。（8）及时检查结果，做好原始数据记录。,2023/4/1,127,8 校验的执行,仪器设备档案应包含以下内容:（1）仪器名称、编号、启用日期。（2）常规校验的方法和校验周期。（3）可以接受的操作范围。（4）仪器功能上的缺陷，如有克服缺陷 的步骤应详细列出。（5）常规维修的日期(按制造商的推荐意 见)。,2023/4/1,128,8 校验的执行,仪器只要不报废，维修记录均应保存。实验室应预先制定仪器校验计划，并按计划对需要强制性定期检定的仪器和设备经符合资历计量部门校验，根据校验结果决定对仪器设备继续使用、降级使用或停止使用。,2023/4/1,129,8 校验的执行,实验室可根据需要对部分仪器进行自校以节约成本，但用于自校的计量工具必须经过计量部门校准方可使用。,2023/4/1,130,9 参考菌株及其保存,参考菌株可以从国际菌种保藏中心如ATCC、国内具资质菌种保藏中心或室间质控活动中获得，准确鉴定过的分离株也可使用。实验室要准备好足够种类和数量的参考菌株，满足培养基、试剂盒和试剂质量测试的需要。,2023/4/1,131,表3 食品微生物检验常用标准菌株,2023/4/1,132,表3 食品微生物检验常用标准菌株,2023/4/1,133,表4 食品微生物检验用于生化试验的质控菌株,2023/4/1,134,表4 食品微生物检验用于生化试验的质控菌株,2023/4/1,135,表4 食品微生物检验用于生化试验的质控菌株,2023/4/1,136,表4 食品微生物检验用于生化试验的质控菌株,2023/4/1,137,参考菌株的保存,保存菌株要定期传代，注意无菌操作，使菌株不污染、不死亡、不丢失；应设专人妥善保管，菌株保存箱应加锁放置适宜环境，取出使用应登记；,2023/4/1,138,参考菌株的保存,保存菌株应建册登记，基本项目应包括菌种名称、分离来源、分离日期、传代日期、保存方法、主要性状、保管者、领用者等；对保存菌种，经传代数次后应进行一次系统生化反应、血清学特性等生物学性状观察，检查其是否发生变异。,2023/4/1,139,参考菌株的保存,常见的参考菌株保存方法如下：,2023/4/1,140,细菌,(1)营养要求不高的需氧细菌在胰胨大豆琼脂斜面上能存活1年。(2)需氧或厌氧菌的长期储存需冷冻干燥，或存放在-70。(3)营养要求不高的冻干菌种每隔5年要解冻分离重新冻干，苛氧菌每隔3年重新冻干。(4)细菌低温冰冻保存时可悬浮于消毒去脂牛奶、含15%甘油的胰胨大豆肉汤或无菌马血中。,2023/4/1,141,真菌,(1)酵母菌按营养要求不高的细菌同样处理。(2)霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂斜面上4储存6个月-1年，斜面上覆盖消毒石蜡油可在室温下长期存放。,2023/4/1,142,10 实验室内外部质量控制,10.1 内部质量控制 为保证实验室连续评价结果的可靠性和精密度，必须对所用方法的重复性及再现性定期测定。对于不同的控制系统，实验室必须建立限值，超过限值应采取纠偏措施。,2023/4/1,143,10.1 内部质量控制,实践中内部质量控制可包括：（1）系统地使用一式双份的菌落计数测定；（2）由同一检验人员和几个检验人员作平 行样；（3）定期或不定期进行盲样测试。,2023/4/1,144,10.2外部质量控制,实验室应参加外部的质量控制活动，对其开展的每一项检测均应参加相应的室间质量控制。对有关实验室或管理机构发出的测试样品应严格地当作普通样品一样处理，这样一种方法有助于实验室每天测试的准确性和重复性，是对实验室所用的方法、试剂、设备和人员能力的测试。,2023/4/1,145,10 实验室内外部质量控制,从室间样品测试中的错误可以发现实验室的不足之处，对工作人员的教育改进可以提高实验室的检测质量。对返回的室间测定评级中存在的问题应当召集全体员工讨论，改进措施(包括方法的改变、员工的改变、员工的再训练、培养基和试剂购买来源的更换等)应当记录在案。,2023/4/1,146,10 实验室内外部质量控制,某些项目缺少室间质量控制，实验室可以设置室内质量控制，每半年自行评估一次。经常参加微生物实验室室间质控活动，有助于加强检测人员的基本功训练，增强样品检测过程中“量”的概念。实验室间的质控可在国内外范围进行，有能力的实验室应力争参加国际间质控活动，树立良好的检验信誉。,2023/4/1,147,11 检验报告及结果质量控制,对原始数据进行整理，用回归分析法和方差分析法进行处理，去除不必要的误差，获得准确的数据，编制微生物学检验报告考虑引入不确定度概念。,2023/4/1,148,11 检验报告及结果质量控制,原始数据要求：主题明确符合检样要求和分析目的；内容准确定性判断和定量计算应准确 无误；文字简明文字、表格简洁明了，表达 适当；书写清楚菌类名称(学名)、有关数字及其它 文字说明必须书写清楚。,2023/4/1,149,11 检验报告及结果质量控制,应注意检验结果应与卫生标准的表示方法一致，定量检测以N10n表示，不宜用基数字表示，N为两位有效数字；对定性检测的报告，一定要用汉字“阳性”或“阴性”表示。,2023/4/1,150,11 检验报告及结果质量控制,上述的微生物学检验报告，必须经过规定的手续进行复查，并对照各类标准对微生物学质量进行全面准确的评价和作出合理的解释。有关人员签字后，加盖检验单位印章，以示生效。这样，才能使检验结果既有法律依据又有学术依据。,2023/4/1,151,结语,微生物检验的质量控制比较复杂，目前尚无统一规范，国内各实验室条件参差不齐，开展此项工作任重道远。要使微生物检验的质量控制日臻完善，仍需广大微生物检验人员共同努力。,2023/4/1,152,杀菌和抑菌试验,制作人：质量人,2023/4/1,153,一、总则,适用范围：本方法适用于医疗、卫生、食品等行业的杀菌和抑菌试验。引用标准：消毒技术规范2002,2023/4/1,154,二、术语,消毒 disinfection 杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的处理。灭菌 sterilization 杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。消毒剂 disinfectant 用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。灭菌剂 sterilant 可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。,2023/4/1,155,二、术语,杀灭时间 killing time,KT 用于生物指示物抗力鉴定时,指受试指示物样本，经杀菌因子作用不同时间后,培养后的全部样本均无菌生长的最短作用时间(min)杀灭率 killing rate,KR 在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值，以其表达杀灭效果。灭对数值 killing log value 微生物数量以对数表示时，消毒后与消毒前比较,以其减少的对数值来表达杀灭效果。,2023/4/1,156,三、菌悬液与菌片的制备,（一）、试验前应选择合适的细菌，在下述规定中表中+为必做试验 的微生物，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。,2023/4/1,157,三、菌悬液菌片的制备,（二）、试验器械A.无菌蒸馏水 B.细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基等 C.刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。D.数字可调移液器（10l200l）及配套用一次性塑料吸头。E.浊度计。F.游标卡尺。,2023/4/1,158,三、菌悬液菌片的制备,（三）、细菌繁殖体悬液的制备 1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37 培养18h24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37 培养 18h24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37 培养 18h24h，即为第3 代培养物。2）取菌种第 3代14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h24h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用,2023/4/1,159,三、菌悬液菌片的制备,5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲 80 次，以使细菌悬浮均匀。3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4）细菌繁殖体悬液应保存在 4 冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。,2023/4/1,160,四、菌片的制备程序,1）滴染法染菌时，先用浊度计测定的菌悬液浓度，调 至含菌量为15108cfu/ml将经灭菌的载体片平铺于 无菌平皿内，菌液滴加量每片为10l。用10l移液器 接灭菌塑料吸头，滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体 表面。滴染菌液后，染菌载体可置37温箱内烤干（约20min30min），或置室温下自然阴干后再使用。2）每个菌片的染菌量，即回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为 5105 cfu/片5106 cfu/片。3）配制菌悬液和制备菌片时，保持环境的洁净和安静，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。,2023/4/1,161,五、活菌培养计数技术,1）取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固 体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用手掌上用力振敲 80 次，形成菌悬液。2）将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、10-3.等。3）将菌悬液样本在手掌上用力振敲 80次，吸取 0.5ml加至 10-1 管内。4）将 10-1 管依前法在手掌上用力振敲 80次，混匀，再吸取出 0.5ml 加入10-2 管内。如此类推，直至最后一管。,2023/4/1,162,五、活菌培养计数技术,5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 30cfu300cfu 者为宜），吸取混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。需接种2个3个不同稀释度。6）将冷至 4045 的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿 15ml20ml。置 37 温箱内培养7）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h），计数最终结果的菌落数。,2023/4/1,163,六。杀菌试验,1）首先按产品说明书要求配制消毒液。一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍，置201 水浴备用。取已配制浓度为1108cfu/ml5108cfu/ml,(实际作用时菌浓度为107cfu/ml）。在无菌大试管，先加入0.5ml有机干扰物质，再加入0.5ml试验用菌悬液，混匀，置 201 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。2）待菌药相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5ml 菌药混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。3）各管菌药混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。,2023/4/1,164,六.杀菌试验,4）同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。5）所有试验样本均在 37 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。6）试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值:杀灭对数值(KL)对照组平均活菌浓度的对数值（No）试验组活菌浓度对数值（Nx）,2023/4/1,165,六、杀菌试验,1)在悬液定量杀灭试验中,各次试验阴性对照无菌生长,阳性对照回收菌数在1107cfu/ml5107cfu/ml范围内,各次试验的杀灭对数值