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生物工程专业毕业论文 从自然界筛选产乳酸微生物及菌 种初步鉴定生物工程专业毕业论文摘要酸菜是东北地区的一种传统发酵食品BCP选择培养基的分离方法对菌种进行筛选分离通过测定OD值和PH 值来绘制生长曲线实验总结乳酸菌的最佳pH值和最适盐浓度以及温度H2O2酶试验硫化氢产生柠檬酸盐关键词酸菜Abstract Pickle is a traditional fermented foods in the Northeast of China This experiment used self-brewed Pickle juice as the sources of collecting and breeding bacteria The unknown strains of lactic acid bacteria were isolated and screened from the Pickle juice This experiment used BCP method to select medium for isolating and screening bacteria The drawing of growth curves based on the OD values and the PH values The results showed that the the optimum conditions for lactic acid bacteria were pH70 0-2 of salt concentration and 37 And the physiological and biochemical characteristics of the unknown bacteria were identificated The results showed that H2O2 enzyme test was negative hydrogen sulfide was positive citrate was positive there was acid production but no gas production gelatin liquefaction was negative litmus milk was positive glycogen tests of glucose sucrose fructose lactose were positiveKey words sauerkraut lactic acid bacteria identification目 录摘要IAbstractII1 绪 论11 12 乳酸菌的基本属性1 13 乳酸菌的发展时期及分类2com 乳酸菌的发展时期2com 乳酸菌的分类214 乳酸菌的发酵特性215 乳酸菌的应用3com 乳酸菌在食品领域的应用3com 乳酸菌制剂416 乳酸菌的生理作用和作用机理4com 乳酸菌的生理作用4com 乳酸菌的作用机理5176com 乳酸菌的发展历史6com 乳酸菌的发展现状7187com 乳酸的概述7com L乳酸的生产8com 乳酸提取工艺101 本课题的目的及研究的意义122 实验部分1321 实验材料与仪器13com 实验材料13com 13com 实验试剂14com 实验培养基1422 实验方法15com 从自制酸菜汁中分离提纯乳酸菌的思路和原理1515com 菌种储藏15com 样品采集15com 乳酸菌的分离和筛选1616com 乳酸菌的生理生化鉴定171831 乳酸菌的形态学鉴定1818com 乳酸菌的复筛18com 菌株形态1932 乳酸菌的产酸定性定量试验20com 菌株产乳酸试验202 乳酸定量试验203 乳酸菌的生长过程鉴定2121com 菌株最适生长起始pH值的确定21com 乳酸菌株耐盐性的确定22com 乳酸菌的不同温度生长鉴定2333 乳酸菌的生理生化鉴定25结 论28参考文献29致谢31 绪 论乳酸菌是对能利用可发酵碳水化合物产生出大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称自然界中乳酸菌分布十分广泛可以存活在各种动物的消化道及其其他器官里在乳制品发酵植物食品自然界的湖泊和泥土都有所发现人们常常利用乳酸菌产酸等特性来处理和加工食品延长食物的储存时间和提高食品的适口性乳酸菌从发现分离到分类体系的建立经过了大约一个世纪目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上至少可划分成 23 个属共有200多种涉及到的有关属则更多有的只是某些属中的少数成员除极少数外其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群其广泛存在于人体的肠道中目前已被国内外生物学家所证实肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系 而人体肠道内乳酸菌拥有的数量与人类年龄成倒数增长曲线在平时健康人比病人多50倍长寿老人比普通老人多60倍当人到老年或生病时乳酸菌数量可能下降100至1000倍直到老年人临终完全消失因此人体内乳酸菌数量的实际状况已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标现在由于抗菌素的广泛应用使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏抵抗力下降健康受到极大的威胁所以增加人体肠道内乳酸菌的数量就是明智之举人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好也完全符合诺贝尔得奖者生物学家梅契尼柯夫长寿学说里所得出的结论乳酸菌 益生菌 长寿菌 在面对抗生素的日渐无能为力的现状不断寻求新的更加有效的生物抗菌产品是正确选择瑞典科学家研究发布的结果治疗胃和大肠炎症时直接喝乳酸菌比用抗生素更好危险性基本没有而在日本乳酸菌制品占据日本乳制品市场的85以上二十年来研究记录表明日本青年平均身高增加15厘米平均寿命达85岁居世界第一位这是乳酸菌制品所带来的直接健康功效具有的基本特点为革兰氏阳性细胞 菌体常排列成链乳酸链球菌族菌体球状通常成对或成链乳酸杆菌族菌体杆状单个或成链有时成丝状产生假分枝 过氧化氢酶反应为阳性 消耗的葡萄糖50以上并且产生乳酸 不形成芽孢 极少运动或者不运动 可以分解蛋白质 不产生腐败产物 可以分解脂肪但是能力较弱乳酸菌所属界细菌界Bacteria所属门厚壁菌门Firmicutes所属纲芽孢杆菌纲Bacilli所属目乳杆菌目 Lactobacillales 所属科乳杆菌科 Lactobacillaceae 所属属乳杆菌属 Lactobacillus 肠球菌属 Enterococcus Thiercelin and Jouhaud 在固体培养基上菌落较小生长缓慢在液体发酵培养基内可以很快的生长离心洗涤可以获得纯度较高的菌体且兼具需氧和厌氧的性能多数不运动少数以鞭毛运动有的也连消化驱动乳酸茵的分类也经历了四个主要的发展时期分别是经典分类时期和化学分类时期数值分类时期分子分类时期com 乳酸菌的分类乳酸菌根据来源大体上可分为两类一类是植物源乳酸菌一类是动物源乳酸菌植物源乳酸菌因为取自植物摄取的量不易受限制人体不会产生异体蛋白排斥反应并且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力能比动物源乳酸菌多数倍的数量到达人体小肠内定植从而发挥乳酸菌稳定的生物功效因为动物源取自动物菌种相对于植物源不稳定生物功效也较不稳定在大量摄取后较容易导致人排斥反应目前对乳酸菌的分类鉴定是以表型特征和生物学特性为依据来判定其归属这种分类鉴定方法也有其局限性这种方法耗时耗力培养条件的改变可能会导致结果发生变化并且仅依靠主观选择的特征很难对某些区别不明显的生理生化特性的乳酸菌进行有效的区分因此随着分子生物学同其相关技术的发展分子标记技术可以快速准确灵敏的分类并且鉴定乳酸菌14 乳酸菌的发酵特性 乳酸菌作为化能异养型微生物 代谢活动需要单糖 尤其是葡萄糖 经发酵作用将单糖转变为低分子的乳酸和其它有机酸获取能量乳酸菌的发酵作用根据代谢途径不同和产物的差异 可以划分为异型乳酸发酵和同型乳酸发酵 同型乳酸发酵 葡萄糖经糖酵解途径几乎变成100的乳酸如链球菌片球菌和部分乳杆菌等 葡萄糖通过糖酵解途径转化为两个乳酸 异型乳酸发酵 葡萄糖的分解完全依赖磷酸戊糖途径转变为乳酸和其它产物 根据产物不同 又有两种类型第一明串珠菌和部分乳杆菌将葡萄糖转变为乳酸乙醇和二氧化碳葡萄糖通过磷酸戊糖途径转化为乳酸和乙醇和二氧化碳 第二双歧杆菌将1mol 葡萄糖转变成1mol乳酸和1 5mol 乙酸 两个葡萄糖通过磷酸戊糖途径转化为两个乳酸和三个乙酸15 乳酸菌的应用com 乳酸菌在食品领域的应用人类对于乳酸菌的应用可以追溯到远古时代那时候人类就在酿造和食品方面利用了乳酸菌人类研究和掌握乳酸菌的生长规律并加以利用乳酸菌能够赋予食品柔和的香味和酸甜的口感可以改善食物的品质和营养还具有抗菌抗肿瘤抗变异原和降低胆固醇维持微生态环境增强免疫力等生物学功能被广泛的应用在食品工业领域中在酸乳制品中的应用是将乳酸菌纯种培养活化后制成乳酸菌发酵剂再添加于经过灭菌处理的鲜乳或者复原乳中在4045度下发酵获得终产物常用的发酵剂为嗜酸链球菌保加利亚乳杆菌嗜热链球菌经乳酸菌发酵的乳酸菌奶酪蛋白及乳脂被转化为短肽氨基酸和小分子的游离脂类等更易被人体吸收乳酸与钙结合形成乳酸钙极易被人体吸收也可被乳糖不耐症人群选用乳酸菌奶促进消化促进胃液分泌对胃具有保养功能能抑制肠道内腐败菌的生长其生物保健价值远远高于牛奶 在酿造业中的应用是通过乳酸菌产生的乳酸与乙醇酯化生成乳酸乙酯提高白酒的质量及口感也可以改善葡萄酒的风味乳酸菌产生的乳酸是一种呈香物质可伊提高产品酸度又可改善风味并且提高产品质量在发酵肉制品中的应用是通过发酵产生乳酸降低pH值从而抑制肉毒杆菌及其它病原微生物的生长繁殖或产生毒素减少了腐败还可以促进亚硝酸盐的分解形成稳定的亚硝基肌红蛋白促进发色和减少致癌物质一亚硝胺产生使肌肉蛋白变性形成胶状组织增加肉块间的结合力可以提高制品的硬度和弹性在发酵果蔬制品中乳酸菌的应用是通过同型或异型发酵产生乳酸醋酸丙酸等有机酸这些酸赋予发酵果蔬制品柔和的酸味同时产生的微量双乙酰赋予制品奶油香味产生的2一庚酮2一壬酮对爽口清香有一定作用低级饱和脂肪酸与脂肪醇所形成的酯类具有水果香味在饲料中添加乳酸菌不仅可以提高蛋雏鸡成活率和日增重还可以使断乳后仔犬体重显著增加因此显著提高饲料利用率com 乳酸菌制剂 利用现代生物技术发酵生产的具有活性的乳酸菌制剂是安全高效的动物保健制剂目前已经投入广泛应用固体发酵和液体发酵的两类活菌制剂克服了死的菌体及代谢产物效果不确切的弊端为动物保健及食品安全保障提供了动力7com1 固态发酵制剂应用移动发酵技术多菌种复合保质技术高负压吸真空技术好氧厌氧分阶段发酵技术使发酵产品在潮湿状态保质期达到18个月以上保证了乳酸菌的活性com2 液态发酵制剂为养殖场提供小型全自动乳酸菌发酵罐并提供菌种培养基由养殖场自行发酵随用随饮保证了乳酸菌的活性16 乳酸菌的生理作用和作用机理com 乳酸菌的生理作用1防治有些人种普遍患有的乳糖不耐症喝鲜奶时出现的腹胀腹泻等症状2促进蛋白质单糖及钙镁等营养物质的吸收产生维生素B族等大量有益物质3抑制腐败菌的繁殖消解腐败菌产生的毒素清除肠道垃圾4使肠道菌群的构成发生有益变化改善人体胃肠道功能恢复人体肠道内菌群平衡形成抗菌生物屏障维护人体健康5抑制胆固醇吸收降血脂降血压作用6抗肿瘤预防癌症作用7免疫调节作用增强人体免疫力和抵抗力8有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染9提高SOD酶活力消除人体自由基具抗衰老延年益寿作用 10控制人体内毒素水平保护肝脏并增强肝脏的解毒排毒功能com 乳酸菌的作用机理 通过对大量资料的研究我们得以知道乳酸菌有一下功能调节胃肠道正常菌群维持微生态平衡促进动物生长从而改善胃肠道功能抑制肠道内腐败菌生长提高机体免疫力提高食物消化率和生物效价降低血清胆固醇控制内毒素等乳酸菌通过发酵产生的有机酸特殊酶系酸菌素等物质这些物质具有特殊生理功能它们可以刺激组织发育对机体的免疫反应和应激反应营养状态生理功能等产生作用第一提供营养物质促进机体生长乳酸菌可以通过挥代谢活性为宿主提供可利用的必需氨基酸各种维生素维生素B族和K等 还可提高矿物元素的生物活性进而达到为宿主提供必需营养物质增强动物的营养代谢直接促其生长的作用Dalmin等 2001 研究报道乳酸菌可以改良水质提高斑节对虾的存活率生长速率和健康状况Hamad 1979 试验证明小麦稻米等谷物用乳酸菌发酵后营养价值大大提高此外乳酸菌产生的酸性代谢产物使肠道环境偏酸性而一般消化酶的最适PH值为偏酸性 淀粉酶65糖化酶44 这样就有利于营养素的消化吸收何机峻的产生还可加强肠道的蠕动和分泌也可促进消化吸收养分第二改善胃肠道功能维持肠道菌群平衡动物的整个消化道在正常情况下都寄生有大量微生物就其作用而言可分乃三类共生性类型主要是兼性厌氧菌在生态平衡时它们的维生素和蛋白质合成消化吸收生物拮抗和免疫等功能对宿主有利致病性类型正常情况下数量少寄生于正常部位不至于使宿主发病若失控则会导致宿主的不良反应中间性类型即同时具有生理和致病两种作用微生物群的平衡对机体的健康十分重要而乳酸菌就能够调节这种微生态平衡保障宿主正常生理状态乳酸菌是肠道常在菌常生菌畜禽服用乳酸菌后可以改变肠道内环境抑制有害菌繁殖调整胃肠道菌群平衡乳酸菌通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合在肠粘膜表面定植占位成为生理屏障的主要组成部分从而达到恢复宿主抵抗力修复肠道菌群屏障治愈肠道疾病的作用如果这个屏障遭到抗生素或其他因素的破坏宿土丧失了对外来菌抵抗力会使具有耐药性的肠内菌异常增殖而取代优势菌的位置造成肠道内微生态平衡的失调第三改善免疫能力乳酸杆菌和双歧杆菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用另一方面由于它能在肠道定植相当于天然自动免疫它们还能刺激腹膜巨噬细胞诱导产生干扰素促进细胞分裂产生抗体及促进细胞免疫等所以能增强机体的非特异性和特异性免疫反应提高机体的抗病能力Pergidon等 1988 报道口服乳酸菌后对巨璇细胞的半乳糖甙酶活性巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活和促进作用当异物侵入机体时免疫细胞被乳酸菌激活增强了机体对异物产生抗体的作用Chndra 1984 认为乳酸菌之所以具有有激机体产生抗体的作用是由于菌体通过淋巴结粘膜刺激淋巴细胞接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结 MIN 循环到血流中并分布全身从而调节机体的免疫应笞第四抗菌作用研究资料表明乳酸菌对一些腐败菌和低温细菌有较好的抑制作用可用于防治腹泻下痢肠炎便秘和由于肠道功能紊乱引起的多种疾病以及皮肤炎症其抗菌机制主要表现在以下几个方面产生的乳酸等有机酸能显著降低环境pH值和Eh 氧化还原电位 值使肠内处于酸性环境对于致病菌如痢疾杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌弯曲杆菌葡萄球蔺等有拮抗作用产生的过氧化氢能够激活牛乳中的过氧化氢酶-硫氰酸系统抑制和杀灭革兰氏阴性菌过氧化氢酶阳性细菌如假单胞菌属大肠杆菌类和沙门氏菌属等产生类似细菌素的细小蛋白质或肽类抗菌肽如各种乳酸杆菌素和双歧菌素对葡萄球菌梭状芽孢杆阔以及沙门氏菌和志贺氏菌有拮抗作用另外双歧杆菌等还可将结合的胆酸分解为游离的肌酸后者对细菌的抑制作用比前者更强com1 乳酸菌的发展历史早在五千年前人类就已经在使用乳酸菌到目前为止人类日常食用的酸奶泡菜调味品酱油等都是应用乳酸菌这种原始而简单的又容易得到的天然发酵的代谢产物早在20世纪初俄国著名的生物学家诺贝尔奖获得者梅契尼柯夫Mechnikoff1845-1916在他的长寿学说里已明确指出保加利亚的巴尔干岛地区居民日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌这些乳酸菌能够定植在人体内有效地抑制有害菌的生长减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害这是保加利亚地区居民长寿的重要原因这个具有划时代意义的长寿学说为人类利用乳酸菌生产健康食品开创了新纪元今天利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品com 乳酸菌的发展现状在发酵型乳酸菌奶饮品已有上百年历史的欧美国家发酵型乳酸菌奶饮料在乳制品市场的比例高达80随着消费者健康意识的提高中国乳酸菌市场发展迅猛目前产业规模已经超过200亿元人民币中国的乳酸菌产业正处于快速发展期正以每年25的速度递增中国乳酸菌奶饮品的年总产量已突破100万吨随着消费者的需求增长继世界最大的乳酸菌饮品养乐多进入中国后国内乳品企业也开始发力乳酸菌产品市场未来五年将是中国乳酸菌行业快速发展的黄金时期18 乳酸的生产及应用 com 乳酸的概述 乳酸又名丙醇酸或-羟基丙酸2-hydroxypropanoic acidCH3CHOHCOOH是一种天然存在的有机酸广泛存在于人体动植物微生物中因含有不对称C原子而具有光学异构现象分为L型D型外消旋体的DL型com L乳酸的生产com1 化学合成法com2 酶法com3 微生物发酵法com4发酵中和剂com 乳酸提取工艺com1钙盐法com2萃取法com3酯化法com4吸附法com5分子蒸馏法com6电渗析法19 本课题的目的及研究的意义乳酸菌作为一种绝大多数为益生菌的菌种对人类的健康起着重要作用而选育出优良的乳酸菌菌株对生产有特殊的意义能够更突出的表现出乳酸菌的优点和功效然而目前被运用到生产的乳酸菌种十分的固定自然界中还有许多未知的乳酸菌种值得我们去寻找筛选提纯并且诱导本实验研究目的在于从自然界筛选及鉴定未知的乳酸菌使其生理生化特征可以表现出来从而判断是否能够在酱油酸奶陈醋等发酵产品生产中更好发挥乳酸菌的作用更好的达到发酵的效果能够培育出人类生产中所需要的优质的乳酸菌方便的应用于发酵产品的生产中2 实验部分21 实验材料与仪器设备名称生产厂家721E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司电热恒温培养箱DHP-9162上海恒科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KB上海申安医疗器械厂空气振荡器HZQ-C哈尔滨市东联电子技术开发有限公司振荡器DZP-102哈尔滨市东联电子技术开发有限公司电子天平FA1104上海天平仪器厂SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台杭州净化设备有限公司生化培养箱LRH-70F上海恒科学仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9203A上海恒科技有限公司PH计PHS-3C上海精科紫外分光光度仪W1000 上海天美有限公司可见分光光度计721天津市普瑞斯仪器有限公司光学显微镜Motic-BA200Digital日本尼康公司电炉子SX2-4-10 天津市中环实验电炉子有限公司其他仪器pH酸度计试管容量瓶量筒玻璃棒烧杯纱布报纸锥形瓶铁架台酒精灯涂布棒镊子等com 实验试剂实验药品名称级别生产厂家蛋白胨生物试剂北京奥博星生物技术有限责任公司牛肉粉生物试剂北京奥博星生物技术有限责任公司干酪素生物试剂北京市海淀区微生物培养基制品厂葡萄糖分析纯天津市天力化学试剂有限公司氯化钠分析纯天津基准化学试剂有限公司硫酸铵分析纯天津市天力化学试剂有限公司磷酸氢二钠分析纯天津市天力化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯天津市博迪化工有限公司硫代硫酸钠分析纯天津市百世化工有限公司氢氧化钠分析纯天津市博迪化工股份有限公司可溶性淀粉生物试剂北京市海淀区微生物培养基制品厂明胶生化试剂天津市风船化学试剂科技有限公司L-酪氨酸生化试剂天津市光复精细化工研究所石蕊分析纯天津市巴斯夫化工有限公司溴甲酚紫分析纯天津市光复精细化工研究所1-萘酚分析纯天津市光复精细化工研究所酚酞分析纯天津市永太化学试剂开发中心对二甲氨基苯甲醛分析纯上海试剂工厂酸性品红生物染色剂北京化工厂无水乙醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司95乙醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司com 实验培养基com1 乳酸菌分离培养基分离培养基BCP培养基配方5g乳糖5g酵母浸粉15g-20g琼脂5溴甲酚紫25ml1000mlH2OPH68-70121高压灭菌1com2 乳酸菌的生理生化鉴定培养基 产硫化氢试验培养基蛋白胨10 g氯化钠5 g牛肉膏10 g半胱氨酸05 g蒸馏水1000 mlpH值为7074121灭菌20 分钟石蕊牛乳试验培养基25 石蕊水溶液4 ml脱脂牛奶100 ml115灭菌20 分钟硝酸盐还原试验培养基葡萄糖 20 gKH2PO4 1 gMgSO4·7H2O 05 g酵母膏 02 gKNO3 78 g蒸馏水 1000 mL121灭菌20分钟柠檬酸盐试验培养基NaCl 50 gMgSO4·7H2O 02 g NH4 H2SO4 10 g K2HPO4·3H2O 10 g柠檬酸钠20 g 溴百里酚蓝1水溶液 10 ml 水洗琼脂120 g蒸馏水990 mlpH值为70121灭菌20分钟糖发酵基础培养基蛋白胨 20 gNaCl 5 g16 溴甲酚紫乙醇溶液 1 mL糖 10 g蒸馏水 1000mL 121 下灭菌15 分钟22 实验方法com 从自制酸菜汁中分离提纯乳酸菌的思路和原理酸菜发酵是多种细菌共同作用的结果本实验利用BCP培养基变色原理BCP培养基中酵母浸粉提供氮源葡萄糖是可发酵的糖类溴甲酚紫为pH指示剂乳酸菌通过反应使菌落周围的PH发生改变从而使培养基变色在乳酸菌菌落附近培养基会从紫色变成黄色因此通过在BCP培养基上不断的分离培养可以得到乳酸菌单一菌种所有平板和斜面均在37下恒温培养所有液体菌株均在37150rpm的摇床中震荡培养将菌种划线培养于斜面上于4冰箱中保藏约四周左右定期转接com 乳酸菌的分离和筛选将各代活化的样品用无菌生理盐水稀释10-110-6倍 分别吸取0 1mL涂布于培养皿中 于37 恒温培养48h 挑取长势优良且单一的菌落反复进行分离纯化 直至得到纯菌落为止 并将得到的菌落编号保存备用平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后其中的微生物充分分散成单个细胞取一定量的稀释液接种到平板上经过培养由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞com 乳酸菌的产酸定性定量试验com1 菌株产乳酸试验乳酸定性试验- 纸层析法com2 乳酸定量试验 通过测定乳酸生成量来确定高产酸的菌株 利用酸和碱在水中以质子转移反应为基础的滴定分析方法可用于测定酸碱和两性物质其基本反应为HOH H2O也称中和法是一种利用酸碱反应进行容量分析的方法 乳酸生成量测定取乳酸发酵液10 mL 加入过量Ca CO3然后加入指标剂钙黄绿素蒸馏水稀释至25mL用0 05 molL 的E DT A-Na2 滴定并以新鲜发酵培养基为空白对照计算乳酸含量 乳酸含量计算公式 乳酸含量 90083×005×V EDTA-Na 10com 乳酸菌的生理生化鉴定221 乳酸菌的形态学鉴定 1菌落形态观察分离培养基平板上的菌落形态并且记录 2 菌株形态将所分离的菌株进行革兰氏染色于100倍油镜下观察并且记录com2 乳酸菌的生长过程鉴定菌株最适生长起始pH值的确定用乳酸将BCP液体培养基调至pH50607080的不同pH值梯度系列将培养18h的菌株接种于其中37培养以空白培养基作为对照每隔2h测定其OD值 600nm 菌株耐盐性的确定 用NaCl将MRS液体培养基调至024681012的不同盐浓度梯度系列将培养18h的菌株接种于其中37培养以空白培养基作为对照每隔2h测定其OD值 600nm com3 乳酸菌的生理生化鉴定3 结果与讨论乳酸菌的形态学鉴定1取酸菜汁1mL依次加入到装有9mL生理盐水的试管中将菌液稀释为10-1取稀释液1ml加入到装有9ml生理盐水的试管中将菌液稀释为10-2以此类推稀释到10-310-4一共4个稀释度然后分别取02mL涂布于BCP固体培养基上37培养48 h 2对所有使培养基变色的菌落进行编号并划线分离4次最后选择单菌落观察菌落特征镜检确认为纯培养采用革兰氏染色法 观察其细胞形态1选择4株健康的远离其他菌落的菌株再进行培养分别编号为R1R2R3R42确保R1R4平板为纯菌落培养为止接种试管斜面37恒温培养48h作为保留菌种3将编号斜面菌种分别接种到BCP液体培养基的三角瓶中37恒温培养48h4分别取四只三角瓶菌种做革兰氏染色观察并记录 图3-2 乳酸菌的液体培养 图3-3 乳酸菌的菌落形态表3-1菌落的形态学特征菌株染色结果菌落特征1G扁平边缘光滑表面粗糙圆形乳白色表面湿润直径为2 mm2G呈凹透镜状突起圆形不透明灰白色直径0515 mm3G呈凹透镜状突起光滑圆形乳白色半透明直径为12 mm4G扁平边缘光滑表面粗糙圆形微黄色表面湿润直径1mm将所分离的菌株进行革兰氏染色于100倍油镜下观察并且记录菌株 染色结果细胞形态1G菌体表现长杆状少量短链无芽孢2G菌体呈球状或豆状单个或链状无芽孢3G菌体呈短杆状成对或链状排列无芽孢4G菌体呈球状或豆状单个或短链排列无芽孢32 乳酸菌的产酸定性定量试验com 菌株产乳酸试验 所分离菌株在发酵培养基中30培养12h以4 接种量接种至盛有250mL 发酵培养基的500 mL 三角瓶中30静置培养24h得乳酸菌发酵液 乳酸定性试验- 纸层析法展开剂 正丁醇 甲酸 水 80155用毛细管分别吸取乳酸发酵液多次点样于新华滤纸上以15 的标准乳酸作为对照平衡2h 后进行层析以1 溴甲酚蓝显色并计算Rf 值2 乳酸定量试验 取乳酸发酵液10 mL 加入过量Ca CO3然后加入指标剂钙黄绿素蒸馏水稀释至25mL用0 05 molL 的E DT A-Na2 滴定并以新鲜发酵培养基为空白对照计算乳酸含量 乳酸含量计算公式 乳酸含量 90083×005×V EDTA-Na 10项目R1 R2R3R4pH乳酸含量吉尔涅尔度°T365661213924598347681244564881 对分离所得到的菌株进行纸层析检测发酵产物中是否产生乳酸结果见表进一步试验定量检测菌株的产酸能力结果见表表 菌株的乳酸定性试验结果由表 数据可知4 株菌株发酵液与标准乳酸纸层析具有相近的Rf 值表明菌株发酵产物中含有乳酸定量试验表明R1R3株菌株的产乳酸含量较高产酸能力也较强33 乳酸菌的生长过程鉴定 图3-4 四株菌株在37中24h的pH变化 由图3-4可以看出在28小时内四株菌株的pH变化最为明显R2菌株在2-8小时内pH最低但和其他菌株差距不明显在后期pH基本不变表示乳酸菌基本代谢稳定com 菌株最适生长起始pH值的确定用乳酸将BCP液体培养基调至pH50607080的不同pH值梯度系列将培养18h的菌株接种于其中37培养以空白培养基作为对照每隔2h测定其OD值 600nm 根据4乳酸菌的表现我选择1号和2号做不同pH对菌种的生长影响图3- 菌1在不同pH的生长曲线图3- 菌2在不同pH的生长曲线 图3-2和图3-3分别为菌1和菌2在不同pH值培养基中的生长情况结果表明两株菌在初始生长pH值为58期间均能生长菌种1最适初始生长pH值为6080菌种2则最适初始生长pH值为70com 乳酸菌株耐盐性的确定用NaCI将BCP液体培养基调至0246810的不同盐浓度梯度系列将培养18h的菌株接种于其中37培养以空白培养基作为对照每隔2h测定其OD值 600nm 图3- 菌1在不同盐浓的生长曲线图3-和图3-分别为菌1和菌2在不同盐浓度中培养的生长情况结果表明菌种1能在小于6的盐浓度中生长当盐浓度达到8时几乎不生长菌种2能在小于8的盐浓度中生长当盐浓度达到10时几乎不生长根据以上两株菌的耐盐能力以上两株菌均能用于需要一定盐浓度的腌制发酵com 乳酸菌的不同温度生长鉴定 将培养18h的四株菌株接种于BCP液体培养基中置于3037中恒温培养以空白培养基作为对照每隔2h测定其OD值 600nm 图3-10 菌株R2在不同温度的生长曲线 图3-11 菌株R3在不同温度的生长曲线 图3-12 菌株R4在不同温度的生长曲线 由上图可知图3-9图3-10图3-11图3-12是4株乳酸菌在不同温度下的生长情况结果表明四株菌在30和37时均能生长1号菌种在30时比37生长迅速其他三株在37比30生长迅速412hOD值迅速增长菌体处于生长期1618hOD值基本达到最大值菌株进入稳定生长33 乳酸菌的生理生化鉴定过氧化氢酶试验挑取分纯菌株的菌落一环置于洁净载玻片上滴加3过氧化氢溶液观察结果半分钟内发生气泡者为阳性反之为阴性硫化氢试验将分离纯菌接种于产硫化氢试验培养基试管后用无菌镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内下端接近培养基表面而不接触液面上端用棉塞塞紧实验中设空白对照35 培养248 h观察纸条是否变黑变黑者为阳性不变者为阴性柠檬酸盐试验将分纯的菌株在在斜面上划线接种37 培养37 d培养基为碱性指示剂蓝色或桃红色者为阳性否则为阴性产气产酸发酵试验将保存的菌株接种到糖发酵液体培养基的杜氏套管中28 培养第二天开始观察一直到第七天判断结果小倒管内有气体者为产气记为阳性不产气者为阴性设空白对照明胶液化试验 试验菌接种于明胶基础培养基后37培养观察时低温处理如对照管空白实验接种管液化为阳性同时凝固为阴性 石蕊牛乳试验将分纯的菌株接种于石蕊牛乳培养基37 培养7 d另外保留一支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照取出培养物以不接种任何细菌的试管为对照观察接种不同细菌生长后的变化情况多种糖源发酵试验 将菌种分别接种于不同糖源的BCP培养基中37培养24h另外保留一组空白实验观察接种培养基颜色变化 8吲哚实验将菌种接于蛋白胨水培养基中加3滴乙醚摇动数次静置2分钟待乙醚上升后沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应表3-3四株菌株的生理生化实验结果菌号1R2R3R4H2O2酶试验-硫化氢产生硫化氢产生硫化氢产生硫化氢产生硫化氢产生柠檬酸盐产酸产气产酸不产气产酸不产气产酸不产气产酸不产气明胶液化-石蕊牛乳胨化胨化胨化无变化葡萄糖果糖糖蔗糖吲哚-注""为阳性反应""为阴性反应硫化氢产生在吲哚试验中加入菌种的试管无任何变化证明为阴性反应说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力在糖发酵试验中在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后培养液变为黄色反应结果为阳性且杜氏小管内无气泡加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡证明该菌种能分解葡萄糖和蔗糖而产酸杜氏小管内没有气泡说明该菌种分解糖后不产气因为在发酵液的上清液中加入10硫酸1 ml 和2高锰酸钾1 ml 后此时上清液中的乳酸转化为乙醛加热后使乙醛挥发因此使滤纸条变黑结 论以自制酸菜汁为原料通过筛选得到四株未知乳酸菌种并对它们进行了生物学鉴定生长鉴定生理生化鉴定得到以下结论 形态学鉴定和生理生化结果伯杰细菌鉴定手册1菌株为植物杆菌2菌株和3菌株为链球菌4号为短乳杆菌通过对其生长条件的研究发现这四株菌种生长旺盛可以在较宽泛的盐浓度下生长可以在较宽泛的pH条件下生长并且能较快的达到生长对数区R1R3株菌株的产乳酸含量较高产酸能力也较强是适合作为乳酸菌发酵工艺的菌种在实验过程里吲哚试验中为了保证实验的准确性在加入吲哚试剂后切勿摇动试管这样乙醚层就不至于被破坏在糖发酵试验中应该在灭菌时适当延长煮沸时间这样可以防止倒置杜氏小管内有残留气泡注意了上述几点有利于实验的成功性此外随着现代科学技术的不断发展对菌种的鉴定也逐渐应用了分子生物学手段但由于本实验室条件有限不能做这个方面的实验如有条件可以做测定DNA的GC含量限制性片段长度多态性分析RFLP随机扩增DNA多态性分析RAP等等这样就能更精确地鉴定该菌种参考文献李幼筠中国泡菜的研究J中国调味品2006l57-63李红印崔焕成杜鹃等乳酸菌发酵在食品加工中的应用J郑州牧业工程高等专科学校学报2003325-29谢达平赵国华陈晓平食品生物化学M北京中国农业出版社2004黄良昌吕晓玲邢晓慧酸奶发酵剂的研究进展J广州食品工业科技200117 3 43-46吕兵张国农林金资酸奶发酵剂速效干荆制备中保护剂的研究J中国乳品工业1996 2 3-5刘会平南庆贤乔发东化学中和法制各高效浓缩乳酸菌发酵剂的研究J中国畜产与食品19985 2 50-52贾士杰生庆海发酵乳及新型发酵剂的研究概况J中国奶牛2000345-48乔发东吴秀芳南庆贤浓缩乳酸菌发酵剂的现状J中国乳品工业199826 1 22-23梁勇杜敏南庆贤浓缩乳酸菌发酵剂的制备J中国乳品工业199523 2 132-133张兰威鄂志强万海峰等乳酸菌增殖培养基的筛选及干燥保护剂的选择J中国乳品工业2000 2 7-9杨洁彬凌代文郭兴华等乳酸菌一生物学基础及应用M北京中国轻工业出版社199675-83142-145 陈仲翔董英泡菜工业化生产的研究进展J食品科技2004433-35田洪涛万红兵刘宽庆等酸奶冻干发酵剂制备中保加利亚乳杆菌不同菌株特性的研究中国乳品工业200634 12 4-6陆利霞王晓飞熊晓辉等植物乳杆菌B2纯种发酵萝卜泡菜的研究J食品工业科技200526 7 59-6063陈仲翔董英泡菜用乳酸菌发酵剂培养基的优化J食品工业2004 5 49-50孟宪刚周鸽鸽张丽珂等 传统发酵蔬菜浆水中好氧微生物的分离与初步鉴定J 食品工业科技2010 3 222-224Carvalho ASSilva JHo Pat e1Relevant factors for the preparation offreeze-dried lactic acid