BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用课件.ppt
BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用,02化工专业：伍品端指导老师：马志玲 副教授,目录,.研究意义和研究现状.实验部分.结果与讨论.实验创新点,.研究意义和研究现状,手性分离的重要性 生物大分子几乎都具有“手性”特征。手性药物各对映体的药效学等可能存在很大的差异。因而评价手性药物各对映体的生物学活性,建立快速、准确、灵敏的对映体拆分方法具有十分重要的意义。,拆分对映体的色谱技术：高效液相色谱高效毛细管电泳超临界流体色谱,毛细管区带电泳胶束电动色谱毛细管电色谱（CEC）(以电渗流为驱动力的微柱液相色谱技术),对映体分离机理：手性选择剂与对映体主要为疏水和静电作用，只有具备特定空间构形和化学官能团的分子才能与这一区域结合。,.研究意义和研究现状,CEC的优点：,CE,LC,CEC,高效性,高选择性多功能性,高效性、高选择性、多功能性,.研究意义和研究现状,常用CEC手性选择剂人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵类粘蛋白、-酸性糖蛋白 等。,手性引入方法柱前手性衍生化法手性流动相添加剂法 手性固定相法,.研究意义和研究现状,总之，CEC以样品与固定相之间的相互作用为分离机理，以电渗流为流动相驱动力。不仅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高选择性。而且，CEC整体柱在手性分离中也显示出一定优势。,.研究意义和研究现状,返回,.实验部分,毛细管处理,在毛细管内聚合整体柱基质,用动态法在聚合整体柱基质上键合BSA蛋白,使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离,1.仪器和试剂（略）2.实验方法,二、在毛细管内合成整体柱,返回,单体,交联剂,三、键合BSA蛋白,Epoxy method,返回,四、使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离。,返回,分离对象：D,L组氨酸分离条件：运行缓冲溶液：2mM磷酸盐缓冲液 分离电压：6kV检测方法：电导检测,.实验结果与讨论,一、整体柱基质聚合条件的优化二、整体柱分离D,L-组氨酸对映体,活性基团IR渗透性背压孔结构SEM、氮吸附法,整体柱基质聚合条件的优化,表1 整体柱各性能的影响因素,最佳聚合条件,环氧活性基团IR,环氧基和酯基分别在约910cm-1和1730cm-1处有吸收。,图1 整体柱基质的红外光谱图,单体含量对整体柱活性基团含量的影响,固定致孔剂和溶剂的含量，改变单体（）和交联剂（）相对含量，用红外光谱法比较环氧基吸收峰（约910cm-1）和酯基吸收峰（约1729cm-1）峰面积。,返回,表2 环氧基与酯基峰面积比较,1.交联剂含量对整体柱背压的影响,原因：随着交联剂用量的减少，相分离提前，使孔径 增大。,表3 不同交联剂含量的整体柱基质背压,2.致孔剂含量对整体柱背压的影响,随着致孔剂（非良性溶剂）用量增大，相分离提前，孔径增大。,返回,图2 不同致孔剂含量整体柱基质背压,孔结构SEM,图3 K1#（50%致孔剂）SEM图,图4 K5#（10%致孔剂）SEM图,表4 整体柱基质组成,孔结构氮吸附法,该整体柱基质的孔都是中孔和大孔，孔径分布在50nm-90nm范围内最多。,图5 K1#（50致孔剂）孔径分布图,返回,单体:24%交联剂:16%致孔剂:50%溶剂:10%,整体柱基质聚合条件,返回,CEC分离组氨酸对映体结果,在6.0kV的分离电压下，以2mmolL1，pH5.5磷酸盐缓冲溶液作运行液，分离D,L-组氨酸，所得CEC图。,图6 D,L-组氨酸CEC图,表5 缓冲液的pH值对分离效果的影响,结论 缓冲液作运行液的pH值越高，BSA（pI=4.7）离解的负电荷越多，使正的电渗流越强，使保留时间越早。较高pH值的缓冲液作运行液时分离度下降是由于，正的电渗流较强，待分离对映体与手性选择剂的作用来不及很好地进行，就被带出毛细管。,返回,实验创新点,通过条件实验，用IR、测定背压、SEM和氮吸附法等方法，确定出最佳聚合条件，成功制备出毛细管电色谱柱。,用手性毛细管电色谱柱分离组氨酸对映体，并考察了运行缓冲液pH值对柱效及分离度的影响,并从原理上作出解释。,最简便的方法（环氧基法），用BSA蛋白对毛细管整体柱进行修饰，制成手性毛细管电色谱柱。,首次建立了采用IR法定性和定量分析整体柱基质表面的活性基团。,前景展望,目前，CEC在药物分析方面已有广泛的研究，集中在与药物相关的杂质分离和手性药物的分离等。随着毛细管电色谱技术的不断完善和提高，将在生物技术、环境保护、农业化学、精细化工产品、食品工业等多个领域的分析中得到应用。在可预计的将来，CEC作为一种发展中的快速分离技术，将有更广泛的应用前景。,致谢,感谢创新化学实验与研究基金项目感谢导师马志玲副教授的悉心指导感谢凌连生、谢天尧、曾锋、邹世春等老师的关心和帮助感谢师兄师姐和朋友们对我的鼓励和帮助,谢谢！,
