脂肪酶的固定化及其手性拆分的研究进展.doc

韩祝平，叶鹏，王新平( 浙江理工大学 化学系，浙江 杭州310018)摘 要: 将脂肪酶固定化可提高酶的选择性、稳定性等，已广泛应用于手性拆分等研究。常用的高分子固定化载体有聚丙烯酸多孔树脂及带功能基团的共聚物等。从脂肪酶结构的角度介绍其手性拆分机理，并具体讨论了一些商 品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及固定化载体材料对手性拆分的影响。关键词: 脂肪酶; 手性拆分; 酶固定化; 功能化载体中图分类号: TQ 932文献标识码: A文章编号: 1671 3206( 2011) 10 1823 05Lipase immobilization and research progress in chiral resolutionHAN Zhu-ping，YE Peng，WANG Xin-ping( Department of Chemistry，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China)Abstract: Immobilized lipase is widely applied in chiral resolution research recently，for which can en-hance its enantioselectivity，stability and so on Macroporous polyacrylate resin and functionalized copoly- mers are the most common polymer immobilized supports This review summarized the influence of struc- ture on the resolution mechanism，the application of commercial immobilized lipase and the influence of immobilized methods or support materialsKey words: lipase; chiral resolution; enzyme immobilization; functional support将生物 催 化 剂“酶”固定化可以有 效 提 高 酶 的稳定性及重复使用性，而固定化载体材料的选择和 设计则是酶固定化研究的关键之一，常用的固定化载体材料有天然高分子材料、合成高分子材料及无 机材料等。其中一些合成高分子材料( 如聚丙烯酸 树脂、共聚树脂等) 便宜易得，且易于进行功能基团化改性，具有很好的研究意义及应用前景。脂肪酶具有高度的立体选择性，可以催化手性 拆分制备单一手性醇类、胺类和酯类等有机合成中间体。目前已有一些商品化固定化脂肪酶被有机化 学家应用于药品手性拆分研究中，其中诺维信公司 的 Novozyme 435( 以聚丙烯酸树脂为 载 体 ) 的 报 道最为广泛。关于脂肪酶手性拆分的研究报道，主要 集中于动力学拆分、动态动力学拆分以及反应介质、温度等方面1，而从载体材料角度研究脂肪酶固定化后催化拆分的文献较少。本综述简单介绍脂肪酶 结构及其手性拆分机理，并总结了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及载体材料对手性拆分影响的研究，提出通过设计功能化固定化载体以 控制脂肪酶手性拆分性能的思路。1脂肪酶手性拆分机理脂肪酶的催化活性中心是由丝氨酸( Ser) 残基、天冬氨酸( Asp) 和组氨酸( His) 组成的三元体系，正常情况下，该 中心埋在一个或数个 -螺 旋 结 构 的 “盖子”下面，并受其保护。催化时，盖子打开，脂肪 酶活性中心暴露，处于活性构象，但也有些脂肪酶和 脂酶中没有“盖子”。来源不同的脂肪酶，往往会表现出不同的手性 选择性，如脂肪酶 Candida Antarctica B 被认为是在 宽的底物( 仲醇类、胺类及酯类等) 范围内可优先对R-构型底物反应2，且反应速度快，选择性高。而脂 肪酶 Candida rogusa lipase 则 优 先 对 S-构 型 底 物 反应3。表 1 列举了几种不同来源脂肪酶应用于手性 拆分报导中的选择性。收稿日期: 2011-08-20修改稿日期: 2011-09-01基金项目: 国家自然科学基金 ( 50803059) ; 浙江省自然科学基金资助项目( Y407275)作者简介: 韩祝平( 1987 ) ，女，浙江海宁人，浙江理工大在读硕士研究生，师从叶鹏副教授，主要从事酶固定化和生物材 料方面的研究。电话: 0571 86843691，E mail: han_pipi 126 com表 1Table 1来源不同脂肪酶的手性选择性The chiral selectivity of different sources of lipase肪酶对底物链长的选择性密切相关。不同脂肪酶隧道区的长度差别很大，对于 CRL 隧道区的长度可以 容纳至少 18 个碳原子的碳链，而 RML 活 性 中 心 到 酶表面的隧道区的长度很短。因此，不同脂肪酶适 用于不同大小底物分子，表现出的选择性也不同。研究脂肪酶手性拆分机理，需要考虑脂肪酶与 底物复合体的结合情况。通过定向进化技术，还可 以改变脂肪酶与底物结合位点的结构，从而改变选 择性。Karin 等10利用定向进化将 Candida Antarc- tica lipase A ( CalA) 活性位处的苯丙氨酸用甘氨酸 来替代，由于甘氨酸体积小减小了空间位阻，有利于 R-构型底物进入，而野生型的脂肪酶对 S-构型底物 有选择性。2商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应 用随着酶固定化技术的不断成熟，一些固定化脂 肪酶已经获得商业化生产，并在手性拆分等领域得 到广泛地研究和应用。表 2 为一些商品化固定化脂 肪酶的信息。脂肪酶来源a优先选择性文献22-345-678CABLR-CRLS-PFLR-PCLBCL RMLR-R-S-a: CABL: Candida Antarctica B; CRL: Candida rogusa lipase; PFL:Pseudomonas Fluorescence Lipase; PCL: Pseudomonas cepacia lipase;BCL: Burkholderia cepacia lipase; RML: Rhizomucor miehei lipase脂肪酶的结构决定其所能催化的底物及其底物 的立体选择性，这主要与脂肪酶结合位点结构不同 有关。Pleiss 等9研究了 6 种脂肪酶上脂肪酸结合 位点的几何形状，分为三类: 疏水狭缝状结合位点( 来源于根酶菌类，如 RML) ; 漏斗状结合位点( 来 源于 南 极 假 丝 酵 母、假 单 胞 菌 属 等，如 CABL 和 PFL) ; 隧道状结合位点( 来源于假丝皱落酵母，如 CRL) 。这些结合位点的大小、形状及理化性质与脂表 2 商品化固定化脂肪酶Table 2 Commercial immobilized lipase商品名生产商或供应商脂肪酶载体酶活性aE 或 ee % bE 20011，E 20012，E = 277 713，E 10014，E 10015，DKRc ，ee% = 9516E = 10 12;E = 1512，ee% = 8318E 20011，E = 10912E = 24920，DKR，ee% 9921DKR，ee% 9922ee% 99E 20011，E = 54 813Novozyme 435Novozyme Corp( Sigma)CALB聚丙烯酸树脂10 000 U /gLipozyme RM IMLipozyme TL IMNovozyme Corp( sigma)Novozyme CorpRMLTLLd阴离子交换树脂二氧化硅5 800 U /g170 IUN /gl17Amano Pharmaceutical( Aldrich)1 638 U /g19Amano lipase PS-C IPCL陶瓷Lipase PS-DAmano PharmaceuticalPCL硅藻土10 500 U /gLipase B Candidaantarctica immobilizedon Immobead 150Immobead 150( 交联甲基丙 烯酸与环氧树 脂共聚物)SigmaCALB18 000 U /gIMMCALBY-T1-350c-LEctaCALB聚丙烯颗粒2 500 TBU /ga: 固定化脂肪酶活性测定方法各有不同，故所表示酶活性值仅作为参考; b: 外消旋转化率 ( C) ，底物对映体过量值 ( ees ) ，产ln1 C( 1 + eep) ees SRRS物对映体过量值 ( eep ) ，对映体选择率 ( E) 计算如下式: E = ln1 C( 1 ee ) ，eep =，ees =，C =，R+SR+See + eepspR 和S分别表示 R-对映体浓度和 S-对映体浓度; c: DKR( 动态动力学拆分 Dynamic Kinetic Resolution) ; d: Thermomyceslanuginosus lipase 米曲脂肪酶。由表 2 可知，国外大的固定化脂肪酶生产商主要有 Novo、Sigma、Amano，采用的酶源主要有 Candi- da antarctica lipase B( CALB) 、Rhizomucor miehei li-pase( RML) 、Pseudomonas cepacia lipase( PCL) 等，选用的载体大多是比较便宜易得的聚丙烯酸、聚丙烯树脂类及功能化共聚物，另外也有硅藻土、硅胶、陶 瓷等无机载体以及离子交换树脂等。其中 Novo 公 司的 Novozyme 435 是以 CALB( 相对其他酶源较便 宜) 作 为 酶 源，聚丙烯酸树脂为载体，应 用 非 常 广泛。不仅因为 Novozyme 435 相对比较便宜易得，还 由于它的耐热稳定性及重复使用性也较好，在有机溶剂中表现出很好的活性19，23，对许多药物中间体 表现出很 好 的 选 择 性8，13-15，尤 其是可催化一些仲 醇类在有机溶剂中水解、酯交换、酯化拆分，故经常被研究者选用。Foresti 等8研究利用 Novozyme 435 催化拆分布洛芬，在不加有机共溶剂的情况下，控制 反应物乙醇与布洛芬摩尔比为 7，对映体过量值 ee= 54% ，转化率 63% 。Novozyme 435 在催化动态动 力学学 拆 分 ( DKR) 中也显示很好的活性选择性， Vallin 等16研究动态动力学拆分 1-芳基乙醇类，对于大多数底物 ee% 95。de Souza 等12 研 究 5 种 商 用 固 定 化 脂 肪 酶 催 化拆分外消旋苯乙醇，发现同时在微波辐射加热下，3 1吸附法操作简便，载体选择范围广，吸附量大，并 能 对一些底物也表现出较好的选择性，故应用较为普遍。da Silva 等26将 Aspergillus niger 脂肪酶通过简单的 吸附固定，载体为 Accurel EP-100( 疏水性聚丙烯颗 粒) 、Amberlite MB-1( 疏水性离子交换树脂) ，Celite( 硅藻土) ，Montmorillonite K10( 蒙脱土) 和 Silica gel( 硅胶) ，发现具有疏水性的离子交换树脂载体具有 最高的选择性( E = 19) ，而脂肪酶吸附在亲水的硅 藻土( E = 1 5) 和硅胶上选择性较差。原因可能有: 在亲水性载体上酶固定量少; 吸附后酶构象变化而 失活; 减少了疏水性底物靠近酶活性位的能力; 载体 基 质产生的立体位阻限制了脂 肪 酶 的 柔 性。 Wang27等从 10 种不同脂肪酶选出活性和选择最 高的 Candida rugosa lipase，将其分别固定于同类 型 的离子交换 树 脂、天然高分子载体等，发 现 其 中 以 DEAE-Sephadex A-25( 二乙基氨基功能化改性交联 葡聚糖，一种阴离子交换剂) 为载体拆分薄荷醇选 择性最高，ee = 95% ，且重复使用性好。3 2共价结合法此法往往固定化牢固，稳定性好，对一些底物表 现出很好的选择性，但操作复杂，对脂肪酶结构变化 影响较大，还易使其变性，改变立体专一性，应用受 到一定限制。Fernandez-Lorente 等28 对脂肪酶 Ba- cillus thermocatenulatus ( BTL2) 进行氨化改性，通过 多点共价结合，固定在环氧琼脂糖上，活性保持原来 的 65% ，但稳定 性 得 到 大 大 提 高，在水解拆分消旋 体中，S 构型对映体选择率 E 100。Bhushan 等29 自制了一系列大孔珠状共聚物( 甲基丙烯酸缩水甘 油酯与二甲基丙烯酸乙二醇酯 ) 作 载 体，通 过 共 价 结合方法( 载体上环氧基团与脂肪酶上氨基形成共对映体选择率 Novozym 435( E 200) Amano AK( E = 115) Amano PS-C I( E = 109) Lipozyme TLIM( E = 15 ) Lipozyme RL IM ( E = 10 ) 。 Yadav等24选用 5 种 脂 肪 酶 ( 其 中 3 种 商 用 固 定 化 脂 肪 酶) 催化 合成月桂酸香茅醇酯，发 现 催 化 活 性 No-vozym 435 Lipozyme IM 20 Lipozyme TL IM AK。在 这 些 比 较 中，NovozymeLipase PS Lipase435 都保持有最好的选择性( 对映体选择率 E 值大都在 100 以上) 和 活 性，原 因 从 Mei 等25 的 研 究 中 可知，Novozyme 435 中 脂 肪 酶 ( CALB) 固 定 在 大 孔树脂上，同步加速红外显微光谱显示，CALB 的二级 结构不因固定化而发 生 变 化，Novozyme 435 颗 粒 的 孔径从扫描电镜图可知比 CALB 大 10 倍，故对酶和 底物的进出没有障碍，从而仍可表现出好的选择性 和活性。其它几种商品化的固定化脂肪酶，如 LipozymeRM IM、Lipozyme TL IM、Amano lipase PS-C I、Amanolipase AK 在手性拆分应用中也较多，其中 Amano li- pase PS-C I 还作为动态动力学拆分 ( DKR) 中 的 催 化剂，在文献21-22中，对映体过量值 ee% 99，表现 出很好的选择性。目前，尽管一些固定化脂肪酶已商业供应，且有 些在手性拆分中表现出很好的性 能，如 Novozym435，然而商品化固定化脂肪酶的价格相对还是较 高，很难应 用 于 工业化催化拆分制备手性化合物。 因此，对于固定化脂肪酶的研究仍吸引了众多研究 者。价 键 结 合 ) 固 定 脂 肪 酶Arthrobacter sp lipase( ABL) ，发现中等疏水 性载体含环氧基团分别为 80% 和 70% 固定脂肪酶后活性最高，比其它两类超 疏水性载体和亲水性载体脂肪酶结合量高，主要是 因为脂肪酶是一种疏水活性酶，易于吸附在疏水性 载体上。将其用于拆分药物中间体，乙基-3-羟基-3- 苯基丙酸酯对映体过量 值 达 到 98% ，转 化 率 为45% ，相应的自由酶 ee = 80% ，转化率 35% ，选择性 得到了提高，并且重复使用 15 次酶活性和选择性下 降很小。3 3包埋法固定此法可较少改变酶的结构，且条件温和，故在手3脂肪酶固定化方法对手性拆分的影响脂肪酶固定化后它的微环境发生改变，选择性性拆分的应用中具有较好的研究前景。Han 等30将脂肪酶 Candida antarctica lipase B ( CALB) 采用加 压的方法固定在疏水性介孔氧化硅载体上，传统的也会发生改变，因此，可以通过设计固定化载体和方法来研究固定化脂肪酶手性拆分机理。方法是通过搅拌包埋，新型的固定化方法是将脂肪酶包埋在多 孔 硅 酸 介 孔 泡 沫 ( MCF) 上，压 力 为 21 35 MPa，负载量达到 275 mg /g 氧化硅，可重复使 用性 和对温度稳定性高于 商 业 购 买 的 Novozyme435，应用于催化拆分 1-苯乙醇，底物为乙酸乙丙烯 基酯，ee 99 7% ，与自由酶相似。定化载体。其中固定在一些疏水性的载体上通常表现出更好的 活 性，这可能与脂肪酶的结构 ( 具 有 疏 水活 性 口 袋 ) 有 关。脂肪酶固定化后对映体选择 性、稳定性相比自由酶大多都得到了提高，但活性有 所下降，稳定性提高可能由于固定化后酶刚性结构增多34-35。另外，固定化后脂肪酶一般不改变原自 由酶的手性选择性，但也有文献报道固定化后酶的手性选择性发生 改 变31。关于固定化方法和载体 对脂肪酶固定化后手性选择性的影响目前仍缺乏明 确的机理解释。因此，可以通过设计功能化固定化 载体以控制脂肪酶手性拆分性能，从而进一步探讨 其拆分机理。多种方法固定Palomo 等31对不同载体固定化脂肪酶 ( Candi- da rugosa) 催化拆分不同底物进行了研究，通过表面 吸附法得到的固定化酶对于 拆分结构简单的底物 ( 丁酸乙酯) 比较有效，而离子吸附法得到的固定化酶对于复杂底物显示出更高的选择性。另外，对于 同一底物，可以通过酶固定化过程中采用不同载体 改变酶的 选 择 方 向。如 拆 分 ( R，S ) -2-苯 基-2-丁 酰 基乙酸反应中，对 Candida rugosa lipase ( CRL) 采用 吸附法固定于疏水载体上优先选择 S-对映体反应，而采用共价法固定于戊二醛 改性载体上优先选择 R-对映体反应，且 E 400，酶的立体专一性发生了 改变。Andrade 等32 采 用 3 种不同的方法将 Burk- holderia cepacia lipase 固定在超顺磁纳米颗粒上( 碱性条件下 Fe3 O4 用氨丙基三乙 氧基硅烷改性后所 得) ，分别通过物理吸附法、通过 4-羧基苯甲醛化学吸附法、通过戊二醛化学吸附法，将固定化酶用于动力学拆分( R，S) -2-溴-1-( 苯基) 乙醇，发现固定化酶 选择 性得到了很大提 高，E 200，而 自 由 酶 仅 有 E 30。其中用戊二醛化学吸附法固定脂肪酶对温 度稳定性最好，且产率最高。Chaubey 等33采用 包 埋 法、共 价 结 合 法、包 埋-共价结合 3 种方法固定脂肪酶( Arthrobacter sp) ，载 体为含磁性 F2 O3 和不含磁性 F2 O3 的氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙腈共聚产物，对氟西汀中间体进行拆分，3 种 方 法 得 到 ee 值 均 达 到 99% ，E 值 相 比 自由酶提高了 3 4 倍，固定化后立体专一性均未改 变。Yang 等34 将脂肪酶 RAL( Rhizopus arrhizus li- pase) 分别采用共价结合法固定于环氧树脂和包埋 法固定于疏 水 性 改 性 ( 乙烯基和甲基丙 烯 基) 的 凝 胶，主要的立体专一性未改变，仍 是 优 先 对 R 底 物 酰化，选择性相比自由酶得到提高，其中共价结合固定后对映体选择率达到 E = 99，但固定化后活性均 有所下降。综上可知，固定化脂肪酶采用的载体大多是聚 丙烯酸树脂、聚甲基丙烯酸、环氧树脂及带有功能基 团的共聚物，另外一些功能基团化 ( 如 氨 基、醛 基、 环氧基) 的离子交换树脂和无机材料也是常用的固3 4结束语随着医药等行业的迅速发展，利用固定化酶技 术来获得高附加值的手性分子越来越引起科研工作 者的关注。其中固定化载体材料的选择是这一技术 的关键之一。目前商业级固定化脂肪酶的载体材料 主要是一些便宜、易于工业化生产的功能化聚合物 载体( 如 Novozyme 435 采用聚丙烯酸树脂) 和 无 机 载体等。但固定化载体影响脂肪酶催化性能的机理 目前还没有明确定论，同时商品化固定化脂肪酶的 价格仍较高，还难于大规模应用于手性化合物的拆 分。载体材料的化学性质和物理结构直接影响其与 酶分子之间的相互作用，以及酶分子的催化微环境。 因此，根据脂肪酶手性拆分的机理，研究和设计新型 的功能化载体材料，从而提高固定化脂肪酶手性拆 分性能将具有重要的使用和科研意义，尤其是对于 药物合成等领域。4参考文献:1徐天闻，贾涛，许建和 非水介质中脂肪酶催化的手性拆分研究进展J 生物加工过程，2005，3( 4) : 1-8 Cabrera Z，Gutarra M L，Guisan J M，et al Highly enanti-oselective biocatalysts by coating immobilized lipases with polyethyleneimineJ Catalysis Communications，2010，11: 964-967Salgn U，Salgn S，Takac S The enantioselective hydrolysis of racemic naproxen methyl ester in supercritical CO2 u- sing Candida rugosa lipaseJ J of Supercritical Fluids，2007，43: 310-316Machadoa A C，da 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