皖北麦田土壤解磷菌筛选及解磷能力初步研究毕业论文.doc

本科生毕业论文（设计）题 目:皖北麦田土壤解磷菌筛选及解磷能力初步研究 姓 名: 学 院: 城建与环境学院 专 业: 农业资源与环境 班 级: 2010级2班 学 号: 2204100223 指导教师: 职称: 教授 2014年5月25 日 安徽科技学院教务处制目录摘要2关键字2引言21 材料和方法21.1 材料21.1.1 土样21.1.2 培养基21.1.3 磷源物质31.2 方法31.2.1 解磷菌筛选31.2.2 解磷菌在固体培养基上溶磷能力的测定31.2.3 解磷菌在液体培养基上溶磷量的测定32 结果和讨论32.1 菌落形态观察32.2 菌株在不同磷源固体培养基上的生长活力32.3 菌株在三种液体培养基上的溶磷量42.4 三种液体培养基中的pH与溶磷量的关系53 结论6致谢6参考文献7英文翻译8皖北麦田土壤解磷菌筛选及解磷能力初步研究 摘要：采用Pikovskay培养基从临泉麦田中筛选出具有高效解磷能力的菌株四株，将筛选出的菌株在三种不同磷源（磷酸三钙、磷矿粉、卵磷脂）的固体培养基和液体培养基中培养。在Pikovskay平板3天后测量解磷菌D/d为1.271.65，在液体摇瓶培养中，其解磷率为0.1320.20mg/L。其中3101对三种磷源都有较高的解磷效果，有较高发展潜力。而3033和3103分别对磷酸钙和卵磷脂有较高解磷率，可作为专性解磷菌株配合单一磷肥施用。关键字: 解磷菌；不同磷源；溶磷能力引言：磷是作物生长必不可少的营养元素之一，在作物生长的各个阶段都扮演重要角色。根据报道我国约75%的耕地土壤缺磷。土壤中95%的磷以无效态形式存在，植物难以直接利用。根据报道，土壤中平均含磷量约0.12%，而其在土壤溶液中的含量仅为0.0051.0mg/kg。作物当季磷肥利用率仅为5%10%，大部分磷作为无效态在土壤中累积1,2。由于长期施用磷肥，土壤磷库充足而磷流不足是目前耕地土壤的现状。土壤中含磷化合物以有机态和无机态的形式存在。无机态磷约占30%50%，主要分为闭蓄态磷和非闭蓄态磷。闭蓄态磷是指磷酸铁和磷酸铝被氧化铁形成的酸膜包敝，活性较低，难以被植物利用。非闭蓄态磷主要指铁铝钙的三种磷酸盐，在一定条件下他们可以被释放出来供植物利用3。土壤中有机态磷约占30%50%，主要包括肌醇类，核酸，磷脂，磷蛋白，磷糖等。土壤中的有机态磷5%10%存在于微生物体内，30%50%以植酸钙镁的形式存在。土壤很多因素影响磷的利用，其中微生物对磷的有效化影响很大。事实上土壤中存在大量的解磷微生物，能够将无效态磷转化为有效态磷（可溶性磷）。我国旱地土壤的解磷菌平均为107cfu /g,约占总微生物的27%82%58，其中根际土壤的解磷菌数量要比非根际土壤的解磷菌数量高一到两个数量级解磷菌的分布表现出强烈的根际效应。研究表明不同解磷微生物对不同磷源的喜好不尽相同911。目前科学家已经筛选出许多高效菌株开发出解磷菌制剂，并成功用于生产有效提高作物产量。如东北农科所将巨大芽孢杆菌制成菌剂在黑钙土和非黑钙土上施用，不同的作物增产幅度不同，平均增产黑钙土为13.5%，非黑钙土为 11.7%3。本文尝试从另一方面出发，利用改良的Pikovskaya培养基筛选麦田土壤解磷菌，来探讨其对三种磷源磷矿粉，磷酸钙，卵磷脂的解离能力的差异。1 材料和方法：1.1 材料1.1.1 土样：临泉小麦土壤。1.1.2 培养基：分离培养基（改良的Pikovskaya培养基）:葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母膏0.5g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，0.4%溴酚蓝（pH6.7）6ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.07.2。液体培养基：Pikovskaya培养基：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，氯化镁5g，硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000ml，pH7.0。1.1.3 磷源物质：无机磷为磷酸三钙(Ca3(PO4)2)，磷矿粉: 主要成分为氟磷灰石。有机磷为卵磷脂。上述均为市售分析纯试剂。1.2 方法1.2.1 解磷菌筛选：称取新鲜土壤10g置于内含玻璃珠和90ml无菌水的250ml的三角瓶中，170r/min振荡30min，然后按10-5、10-6、10-7梯度进行稀释，各取0.1ml涂布于分离培养基上，每个梯度重复3次，于30培养35d，挑取有较大溶磷圈的菌落进行纯化保存。用接种环将上述纯化保存的生长良好的解磷菌，使用平板划线法分别接种于pikovskaya培养基中，培养3d，选取生长良好溶磷圈明显的菌落，观察记菌株菌落特征及生长情况。1.2.2 解磷菌在固体培养基上溶磷能力的测定：用灭过菌的牙签将上述菌株点接在分别以磷酸三钙、磷矿粉和卵磷脂为唯一磷源的培养中，磷源为卵磷脂时，不加溴酚蓝，卵磷脂为2g/L，并补加碳酸钙5g/L。30培养3天，测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）及其比值。初步确定各菌株解磷能力的强弱。1.2.3 解磷菌在液体培养基上溶磷量的测定：将上述筛选菌株按1%的接种量分别接入以磷酸三钙、磷矿粉和卵磷脂为唯一磷源的液体培养基中，并分别以不接种菌的三种培养基作空白对照，30，170r/min摇床培养7d。发酵液经10000r/min离心机离心10min，取上清液稀释适当倍数，分别用钼蓝比色法和pH计测可溶性磷含量和pH值。2.结果和讨论2.1菌落形态观察表1 解磷菌的菌落特征Table 1 Characteristics of colony菌株Strains菌落特征Colony characteristics生长情况Growth303-1 菌落乳白色，圆形，菌落很大，溶磷圈较明显2天后观察到生长303-3 菌落乳白色，圆形，菌落较大，溶磷圈很明显2天后观察到生长310-1 菌落黄色，椭圆形，菌落较大，溶磷圈很明显2天后观察到生长310-3 菌落淡黄色，圆形，菌落很大，溶磷圈很明显1天后观察到生长经过筛选得到4株生长良好的菌株303-1、303-3、310-1、310-3。菌株菌落特征见表1。四菌株菌落都比较大，溶磷圈明显。与310-1相比，其他三种菌株都为圆形，303-1与303-3为乳白色，310-1与310-3分别为黄色和淡黄色。从生长速度来看，310-3生长相对于其他3株较快，平板培养1d就能看到菌株生长，其他3株两天后才能看到生长。2.2菌株在不同磷源固体培养基上的生长活力将筛选菌株分别接种在以磷酸三钙、磷矿粉和卵磷脂为唯一磷源的培养基上，30培养3天，测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）及D/d值。测量结果见表2。表2 固体培养基上解磷菌D、d和D/d值Table 2 The D, d and D/d values of the phosphate-solubilizing bacteria in solid medium菌株Strains溶磷圈直径Diameter of circle of dissolved phosphorusD（mm）解磷菌菌落直径Diameter of the colony待添加的隐藏文字内容1d(mm)D/d磷酸钙Calcium phosphate磷矿粉Phosphate rock powder卵磷脂Lecithin磷酸钙Calciumphosphate磷矿粉Phosphate rock powder卵磷脂Lecithin磷酸钙Calciumphosphate磷矿粉Phosphateerockpowder卵磷脂Lecithin303-14.35.95.03.33.73.01.301.591.67303-34.74.65.03.53.42.91.341.351.72310-16.23.73.04.82.32.01.291.611.50310-33.25.25.02.14.44.01.521.181.25由表2可以看出不同培养基下不同菌株长势不同。生长最好和生长最差的菌株均在磷酸三钙培养基上。其中310-1在磷酸三钙培养基上生长最旺，D和d分别达到6.2mm和4.8mm。但该菌株在磷矿粉和卵磷脂培养基上长势均比其他三菌株长势弱。 310-3在磷酸三钙上生长最弱，D和d分别仅达到3.2mm和2.1mm，而在磷矿粉和卵磷脂培养基上长势第二高。所以磷酸三钙对菌株选择性较强。除310-1外，菌株在卵磷脂培养基长势均超过磷酸三钙培养基，除310-3外，菌株在磷矿粉培养基上生长均超过卵磷脂培养基。可能是由于不同菌株对不同营养磷源要求不同，而不同培养基提供不同磷源。另外，不同解磷菌在不同磷源培养基上D/d值也不尽相同。303-3和310-1在卵磷脂培养基上D/d值比其他两种培养基都大，分别达到1.72和1.67。在表明这两种菌株对有机磷具有较高的固体溶磷能力，其中尤以310-3突出。310-1和310-3分别在磷矿粉固体培养基上D/d值达到最大，分别为1.61和1.52。表明310-1对磷矿粉具有较高的固体溶磷能力，而310-3对磷酸三钙具有较高的固体解离能力。2.3菌株在三种液体培养基上的溶磷量将筛选的菌株按1%的接种量接种于不同的磷源培养基，30，170r/min摇床培养7d。发酵液经10000r/min离心10min，钼锑钪比色法测上清液含磷量。结果见图1。图1 菌株在不同液体磷源培养基中的溶磷量Figure 1 The amount of dissolved phosphorus in diverse liquid phosphorus medium由图1可以看出不同菌株对不同液体磷源的溶磷能力差异极为显著（P0.01）。四种菌株对磷矿粉的溶解能力相比磷酸钙和卵磷脂较小，溶磷量分别仅达到0.11、0.12、2.1和0.03mg/L。当以磷酸钙为唯一磷源时，303-1和310-3的溶磷量仅不足1mg/L，分别为0.47和0.31mg/L。而303-3和310-1的溶磷量明显高于前者，分别为14.32和7.00mg/L。而以磷矿粉为唯一磷源时，仅310-1有相当程度的解磷能力，溶磷量能达到2.06mg/L，其他三中菌株都最高的不过 0.12mg/L。以卵磷脂为唯一磷源时，310-3菌株溶磷量达到20.20mg/L。而该菌株对磷矿粉和磷酸三钙的溶磷量分别为0.03和0.31mg/L。可见，303-3对有机磷源的溶磷能力较高，而对无机磷源的溶解能力则远远低于前者。结果表明，303-3、310-1和310-3的优势磷源分别磷酸三钙、磷酸三钙和卵磷脂，而303-1对三种液体磷源都没有明显的溶磷能力。以上结果表明，不同菌株对不同磷源的溶解能力差异很大。同一菌株对不同磷源的溶解效果也很不一致。钟传青等12,13研究比较了细菌、霉菌、酵母菌等对不同难容性磷源的溶磷效果发现，不同微生物对不同磷源的亲和解磷能力不同，可能是由于微生物本身复杂的溶磷机制、磷源物质的化学成分和结构差异等多种因素引起的。Illmer等人报道了11四株菌株对Ca-P、Al-P、磷矿粉的溶磷效果差异认为这种差异是由微生物不同的溶磷机制造成的，并认为Al-P是通过形成络合物而溶解的。2.4三种液体培养基中的pH与溶磷量的关系图2 液体培养基中pH与溶磷量的关系Figure 2 The relation between PH and the amount of dissolved phosphorus in liquid medium相对于原培养液（不接种菌株）pH值为7.25。接种解磷菌后，培养液pH值下降，在4.347.20之间。说明解磷菌在溶磷过程中分泌出致酸物质，导致pH值下降，使难容性磷溶解。图2是培养7天的液体培养基pH与可溶性磷增量的关系。由图看出，溶磷量越高，则pH值越低，但pH值低溶磷量未必高。这可能与磷源物质以及菌株的解磷机制差异有关。综合分析四株解磷菌在三种液体培养基中溶磷量与pH值的关系，pH降低可增加液体培养基中可溶性磷量，但当pH相近时，溶磷量差异较大。由表3、表4看出，卵磷脂培养基中pH值下降较多，在6.034.34。且pH与溶磷量没有线性关系。如303-1和303-3的溶磷量分别为0.5889和1.095mg/L，而pH分别为5.75和5.94。这一结果与赵晓蓉等的研究结果一致1。而有一些研究发现，许多溶磷菌溶磷量与pH值有一定的线性相关。本实验的磷酸三钙培养基恰可以证明这一点。有效磷量增加，pH值降低。席林桥等人的研究表明解磷菌在溶解难容性磷的过程中会分泌有机酸4，使溶液pH值下降，分泌有机酸的种类取决于解磷菌种类，pH值下降和有机酸生成是解磷菌重要溶磷机理。从表中还可以看出，磷矿粉培养基中pH值下降较小，最低不过6.23，这可能是因为磷矿粉培养基中溶磷量较小。表3 液体培养基下解磷菌株pH值Table 3 The pH in phosphate-solubilizing strains liquid medium菌株Strains磷酸三钙Calcium phosphrus磷矿粉Phosphorus powder卵磷脂Lecithin303-17.206.535.75303-35.026.235.94310-15.796.566.03310-36.927.194.34表4液体培养基下解磷菌株溶磷量Table 4 The amount of dissolved phosphorus in liquid medium菌株编号Strains磷酸三钙Calcium phosphate(mg/L)磷矿粉Phosphoresce powder(mg/L)卵磷脂Lecithin(mg/L)303-10.160.110.59303-314.320.121.10310-16.952.013.08310-30.310.1320.203 结论3.1通过对解磷菌的筛选，解磷菌在不同磷源培养基的生长状况、溶磷圈的观察，解磷菌在三种液体磷源培养基上溶磷能力的测定，可以得出不同菌株对在不同磷源的固体培养基上生长状况以及在不同液体培养基中溶磷效果各有不同，这可能与解磷菌复杂的溶磷机制、不同磷源物质的化学组成和结构差异等多种因素有关。3.2解磷菌溶解难溶性磷时会分泌酸性物质使pH值下降，分泌的酸性物质的种类与数量却不尽相同，这可能也是导致溶液pH与解磷菌溶磷量没有线性关系的原因。3.3从临泉麦田中筛选出具有高效解磷能力的菌株四株，将筛选出的菌株在三种不同磷源（磷酸三钙、磷矿粉、卵磷脂）的固体培养基和液体培养基中培养。得到结果3101对三种磷源都有较高的解磷效果，有较高发展潜力。而3033和3103分别对磷酸钙和卵磷脂有较高解磷率，可作为专性解磷菌株配合单一磷肥施用。致谢本文在汪建飞老师的指导下完成，在实验设计，实验过程及写作过程中，承蒙汪老师的精心指导，值此论文答辩之际，向尊敬的汪老师致以最真诚的感谢。同时段立珍老师也在我的试验完成提供了诸多便利，我在此表示衷心的感谢。并感谢左静、李雪峰、江杰等的热心帮助，使我的论文顺利完成。最后向帮助过我的其他同学和老师表示由衷的谢意！参考文献：1 赵小蓉,林启美,李保国.溶磷菌对4种难溶性磷酸盐溶解能力的初步研究J.微生物学报,2002,42(2): 236-241.2 赵小蓉,林启美.微生物解磷的研究进展J.土壤肥料,2001, 5(3): 7-11.3 王光华,赵英,周德瑞等.解磷菌的研究现状与展望 J.生态环境, 2003, 12(1): 96101.4 席琳乔,姚拓,韩文星,等.联合固氮菌分泌IAA能力及对燕麦的促生效应测定J.草原与草坪,2005,4: 2529.5 赵小蓉,李保国.微生物溶解磷矿粉能力与pH及分泌有机酸的关系J.微生物学杂志, 2003, 23(3): 5-7.6 尹瑞玲. 我国旱地土壤溶磷微生物J. 土壤，1988，20（5）：243-246.7 张宝贵，李贵桐. 土壤生物在土壤磷有效化中的作用J. 土壤学报，1998，35（1）： 104-111.8 Pace NR. A molecular view of microbial diversity and the biosphere J. Science, 1997, 276: 734-7409 Hurek T, Handley LL, Reinhold-Hurek B, Piche Y.Azoarcus grass entophytes contribute fixed nitrogen to the plant in an uncultivable state. Molecule. Plant-Micro J. Interact, 2002, 15 (3): 233-24210 李淑高.解磷微生物的研究J.土壤通报,1981,(5):33-37.11 Paul N B, Sundara Rao W B. Phosphate-dissolving bacteria in the photosphere of some cultivated legumesJ.Plant land Soil,1971,35(3):127132.12 钟传青，黄为一.磷细菌P17对不同来源磷矿粉的溶磷作用及机制J.土壤学报, 2004,41(6): 931-936.13 钟传青,黄为一.不同种类解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的变化J.土壤学报, 2005,42(2): 286-294.Primary study on isolation and ability of phosphorus-solubilizing bacteria in soil of wheat in Northern AnhuiStudent majoring in the agriculture resource and environment Zhao JiayinTutor: Wang JianfeiAbstract: 4 phosphorus-solubilizing bacteria were isolated from soil in Northern Anhui by Pikocskay solid medium. Then put the phosphate-solubilizing bacteria in three different phosphorus source (calcium phosphate and phosphate rock powder, lecithin) of solid medium and liquid medium to cultivate. The ratio of D/d values raged from 1.27 to 1.65 after 3 days in Pikocskay solid medium and the ratio of dissolving phosphorus varied from 0.13 to 20.20 mg/L in liquid cultivate. In which, strain 310-1 showed stronger ability of dissolving phosphorus to all the medium. This strain had great potential for application. While 303-3 and 310-3 respectively showed stronger ability of dissolving phosphorus to calcium phosphate medium and to the lecithin. These two strains can be used to cooperate with the apply of solo-phosphorus fertilizer as sole phosphorus-solubilizing bacteria phosphorus fertilizer.Key words: the phosphate-solubilizing bacteria; source of diverse phosphorus ; ability of phosphorus-solubilizing