激光诱导荧光检测器系统的构建1.doc

激光诱导荧光检测器的研制与性能评价CONFIGURATION OF LASER INDUCED FLUORESCENCE DETECTOR AND EVALUATION OF ITS PERFORMANCE 内容摘要激光诱导荧光检测器（LIFD）是目前用于检测化学及生物样品的最灵敏检测器之一，广泛用于高效液相色谱（HPLC）、微柱液相色谱（Micro-LC）及毛细管电泳（CE）等分离领域。为提高LIFD的检测灵敏度，必须最大限度降低背景源，同时尽可能提高荧光信号的采集效率。本研究以固态二极管激光器为激发光源，构建了基于共聚焦光学配置的LIFD。通过在检测池中设置反射镜，使背离荧光接收光路的荧光信号经反射返回到荧光采集系统，以提高荧光信号的采集效率。长通及带通滤光片的组合使用，最大限度的降低了背景源。构建了适合于HPLC的LIFD检测系统，论文主要包括以下研究工作：第一章对荧光检测的发展过程进行了回顾，讨论了荧光检测技术的原理、荧光分子的激发及去激过程、荧光检测的定量基础，在分析LIFD目前的研究及应用现状基础上，提出论文研究工作的主要内容。第二章采用共聚焦光学配置设计了LIFD的光学系统。对所研制LIFD的基线噪声、漂移、灵敏度、检测限及线性范围等性能指标进行了测试，结果表明，总体性能指标优于Backman公司的MDQ P/ACETM LIF、Unimicro 公司的TriSepTM-2100 LIF及Picometrics公司的ZETALIF等产品的性能指标。对异硫氰酸酯荧光素（FITC）的检测灵敏度大于1012mV/mol/L，而浓度检测限低于10-14 mol/L。第三章在剖析激光诱导荧光检测器各组成光学元件功能的基础上，确定了所研制LIFD的光学元件，包括MBL-蓝光激光器、DM490二色镜、GCO-2112聚光及荧光采集物镜、LP 510长通滤光片及BP 525带通滤光片、GCL-0106622双胶合消色差透镜、CR131光电倍增管。第四章针对普通检测池只能采集所发射单侧球面荧光信号，而另半球面荧光信号未被采集的缺点，设计了反射式Z-型检测池，使与采集光路反方向的荧光信号经反射镜反射而进入到荧光采集系统，从而提高了荧光信号的采集效率，进而使LIFD的检测灵敏度大幅提高。第五章构建了LIFD的光学系统及电路系统，以FITC为衍生化反应试剂，采用柱前衍生化方法，通过对氨基酸样品的检测，考察了HPLC-LIFD检测系统的检测限、线性范围及系统重复性。结果表明所研制LIFD对氨基酸FITC衍生产物的检测限低于10-13 mol/L；线性范围大于104；17种氨基酸衍生物重复测定的结果表明，保留时间的RSD值均小于0.5，LIFD系统具有良好的重复性。关键词：激光诱导荧光检测器，高效液相色谱，共聚焦光学，二极管激光器， Z-型反射式检测池ABSTRACTLaser-induced fluorescence detector (LIFD) is one of the most sensitive detection modes in chemical and biological separations. In addition, it is well-suited for detection in small volumes, and is widely used in high performance liquid chromatography (HPLC), micro-column liquid chromatography (Micro-LC), capillary electrophoresis (CE) and other separations. The key to achieve the best sensitivity is the ability to maximize signal while minimize background sources. In this study, solid-state diode laser was used as the excitation source, and confocal optical configuration was applied. Furthermore, a reflective mirror was installed in the flow cell, which could reflect the deviated fluorescent signal to the optical collection system, so as to improve the collection efficiency of fluorescent signal. Meanwhile, a long pass filter coupled with a band pass filter was applied to minimize background sources. Finally, a LIFD detection system suitable for HPLC was established. The main researches and conclusions are as follows.In chapter, the development of the fluorescence detection was reviewed, and principle of fluorescence detection technique was discussed. Moreover, the process of the excitation and de-excitation of fluorescent molecules, and the quantitative basis of the fluorescence detection were investigated. The main content of this study was proposed based on the analysis of researches and applications of LIFD.In chapter , the LIFD optical system was established based on confocal optical configuration. Subsequently, some parameters of the performance, such as baseline noise, baseline drift, sensitivity, limit of detection and dynamic range, were tested systematically. The results showed that the overall performance of the LIFD developed was better than that of some commercial detectors, such as MDQ P/ACETM LIF of Backman, TriSepTM-2100 LIF of Unimicro and ZETALIF of Picometrics. The detection sensitivity and limit of the LIFD developed could be over 1012 mV/mol/L and lower than 10-14 mol/L, respectively, when fluorescein isothiocyanate (FITC) was used as the sampling.In chapter , the optical components of the LIFD developed were determined, based on the analysis of the function of optical components in LIFD. These components include a MBL-II blue laser, a DM-490 dichroic mirror, GCO-2112 objective, a LP-510 long pass filter, a BP-525 band pass filter, GCL-0106622 doublet achromatic lens, and a CR131 photomultiplier. In chapter , the Z-type reflective flow cell was designed because of the defect that the general flow cell could only collect unilateral spherical fluorescence signal while lose the fluorescence signal of the other hemispherical. With this flow cell, the fluorescence signal in the opposite direction could enter the fluorescence acquisition system by the reflection of a mirror. Accordingly, the collection efficiency of the fluorescence signal and the detection limit and sensitivity of LIFD were improved.In chapter , the optical and electrical system of LIFD was configurated, and overall performance of the LIFD was evaluated. Pre-column derivatizated amino acids were applied in the HPLC-LIFD system，FITC used as the derivatization reagent. According to the detection of amino acids, some parameters of the HPLC-LIFD were tested, which included the limit of detection, the dynamic range and the reproducibility of the system. As the results, the limit of detection and the dynamic range of the LIFD could achieve 10-13 mol/L and more than 104, respectively. The detection of 17 kinds of amino acid derivatives represented that the reproducibility of the LIFD system was good and the RSD of retention time was less than 0.5%.Keywords: laser induced fluorescence detector, high performance liquid chromatography, confocal optics, diode laser, Z-type reflective flow cell 第一章 激光诱导荧光检测仪器进展生命科学的迅速发展对分析仪器的检测灵敏度提出了更高的要求，对生命现象的研究必须深入到单细胞或单分子水平。通过对单分子光谱性质的测量，可以实现对化学反应的途径进行实时监测，特别是对生物大分子进行探测，以提供分子结构与功能之间的信息。单分子检测（single molecules detection，SMD）是分析化学家长期以来一直梦寐以求的一项富有挑战性的前沿领域，达到了分子检测灵敏度的极限，是超低含量物质检测技术的最后一个里程碑。以分子荧光作为检测工具，研究物质的结构及动力学规律获得了巨大的成功，其主要原因在于荧光检测技术具有灵敏度高、荧光性质专一及可为判定分子结构提供的信息量大等特点。传统的分析方法与手段对于检测超低含量如fg（10-15g）、ag （10-18g）是一个极大的挑战，而激光诱导荧光检测（1aser induced fluorescence detection，LIFD）可以满足检测fg及ag水平在灵敏性和选择性等方面的要求，已经被证明是目前灵敏度最高的检测技术之一。近年来LIFD在超痕量生物活性物质的单分子检测方面得到了广泛的应用，尤其是在测定生物样品中的超痕量活性物质和环境污染物等方面，取得了令人瞩目的成就。生物芯片技术的蓬勃发展更为LIFD 提供了良好的发展契机，如毛细管凝胶电脉-激光诱导荧光检测系统已经是DNA序列分析的首选方案，并被用于人类基因组计划。与其他现有的检测技术相比，LIFD具有极高的灵敏度，其检测灵敏度比通常使用的紫外-可见吸收检测高出23个数量级，对于某些荧光效率高的荧光试剂甚至可以实现单分子检测。本章将对荧光检测技术的发展过程进行回顾，详细阐述受激分子的荧光激发和去激过程。在对荧光分子的寿命、量子产率、荧光强度及其影响因素、荧光定量基础等方面进行论述的基础上，系统分析LIFD目前生产厂家及其研究现状，同时对LIFD的应用进行系统综述，进而提出博士后论文研究工作的主要内容。1.1荧光检测技术回顾1565年，西班牙内科医生Nicolas Monardes首次报道了，在一种被称为“Lignum Nephriticum”的木头浸取液中，观察到奇特的蓝光现象。随后，Boyle、Newton及其他科学家对这种木头的浸取液进行了进一步研究，但对产生蓝光现象的机理尚不清楚。直到1852年，Stokes对产生蓝光现象的原因进行了系统考察，发表了著名的文章“On the refrangibility of light”1，他将这一现象解释为蓝光是由于样品吸收入射光导致随后的发射光线所致，且发射光波长大于入射光波长，这就是随后被公认的Stokes定律。1853年Stoks将所观察到的发射光线定义为荧光（fluorescence）2。表1.1给出了早期研究荧光及磷光的主要科学家及其主要贡献3,4。20世纪初，有更多科学家对荧光现象进行了系统研究，在理论及实验技术上得到长足发展，表1.2给出了二十世纪初期对荧光及磷光的研究作出突出贡献的科学家及其有代表性贡献5。近几十年来，随着激光、计算机和电子技术的新成就等一些新的科学及技术的引入，极大推动了荧光分析法在理论及实验技术等方面的发展，出现了许多新的理论和新的方法6-9。在我国，二十世纪五十年代初期仅有少数分析化学工作者从事荧光分析研究工作。目前，已逐步形成一支活跃于此研究领域的工作团队，研究内容已从经典的荧光分析方法拓展到新技术和新方法的应用10-19。1.2 荧光检测原理1.2.1受激分子的荧光发射过程当分子吸收光子被激发到激发态后，在返回到基态的同时伴随着荧光的发射，也可能通过其他去激（de-excitation）途径而返回到基态但不发射荧光，如图1.1所示。可能的去激途径主要包括：内部转变（即直接返回到基态，但不发射荧光）、系统间窜跃（有可能同时伴随有磷光现象）、分子内的电荷转移及构象转变等。分子在激发态时，与其他分子相互作用同样可导致的去激过程包括：电子迁移、光子迁移、能量迁移、形成受激二聚体或复合物等。Fig. 1.1 Possible de-excitation pathways of excited molecules如上述这些去激过程所发生的时间与激态分子的寿命接近，则去激过程将和荧光发射过程相互竞争20,21。激态分子的寿命代表了用于观测动态过程的实验时间窗口12。包括基态分子与环境间相互作用在内的任何基态过程都会对荧光的性质如光谱、量子产率、寿命等产生影响，从而给分子结构提供了一定的信息。1.2.1.1 电子态间的激发和非激发跃迁每个分子中都具有一系列严格独立电子能级，而每个电子能级中又包含有一系列的振动和转动能级。描述分子中电子的运动状态，除了电子所处的能级外，还包括电子的多重态。电子的多重态用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1 。根据Paul不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0、M=1，表示该分子处于单重态（或单重线），用符号S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态，基态分子吸收能量后跃迁至激发态，若跃迁过程中电子不发生自旋方向的变化，这时M仍为1，表示该分子处于激发单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1、M=3，表示分子处于激发的三重态，用符号T表示。Perrin-Jablonsik图（图1.2）给出了分子吸收光子后所发生的各种光物理过程，包括：吸收光子、内转变（Internal conversion, IC）、发射荧光、体系间窜跃（Intersystem crossing, ISC）、发射荧光及磷光等过程。图中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态；T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态；V=0、1、2、3、表示基态和激发态的振动能级。Fig. 1.2 Perrin-Jablonski diagram and illustration of the relative positions of absorption, fluorescence and phosphorescence spectra物质中的分子吸收光能量后，电子从较低能级跃迁至较高能级，而处于激发态的分子是不稳定的，可通过辐射跃迁或非辐射跃迁等去激过程而返回到基态。辐射跃迁的去激过程，伴随有荧光或磷光的发射；而非辐射跃迁的去激过程，使电子的激发能转变为振动能或转动能，主要包括振动松弛、内部转变、系间跨越及外部转变等过程。表1.3给出了各种光物理过程所对应特征时间的量级 10,11。1.2.1.2 内转变（Internal conversion，IC）当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射形式跃迁至低电子能级23-25。如图1.2中，S2和T2中的低振动能级与S1和T1中的高振动能级重叠，电子可以通过振动能级的重叠从S2跃迁至S1，或从T2跃迁至T1，此过程即为内部转变，内转变的时间为1091011s。振动松弛及内部转变的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动松弛及内部转变而跃迁至第一激发单重态的最低振动能级。内转变过程是指相同多重态（相同自旋状态）的两个电子态间的非辐射跃迁（如S1S0，T2T1）。在溶液中，内转变之后将发生振动松弛，趋于最终电子态的最低振动能级。而剩余的能量，通过激发分子与环境溶剂分子间的碰撞传递给溶剂。当分子被激发到较高的能级时，振动松弛将使受激分子向S1单重态的零振动能级跃迁，振动松弛所需的时间为：10131011s。1.2.1.3荧光发射（Fluorescence emission，FE）处于激发单重态的电子经振动松弛及内部转变后到达第一激发单重态（S1）最低振动能级（V=0）后，以辐射的形式跃迁回基态（S0）的各振动能级，此过程即为荧光发射14,15，发射的荧光波长为。电于经过振动松弛和内部转变的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量小，荧光发射的波长比分子吸收的波长长，即。第一激发单重态最低振动能级的平均寿命为109104s，因此荧光寿命也在这一数量级。根据Stokes定律，由于分子在激发态时的振动松弛而损失能量，荧光发射光谱的波长大于吸收光谱的波长。然而，在许多情况下，一小部分低波长的荧光发射光谱与吸收光谱部分重叠，此种“能量背离Stokes定律”的现象是由于温度的补偿效应所致，而当温度较低时，则不会发生背离Stokes定律的现象。总的来说，振动能级间的差别与基态和激发态类似，所以荧光光谱类似于第一吸收带。最大荧光波长与最大第一吸收带之差为Stokes位移。1.2.1.4系间跨跃（Intersysitem Crossing，ISC）系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，涉及到受激发电子自旋状态的改变24。如由第一激发单重态S1跃迁至第一激发三重态T1，导致原来两个自旋配对的电子不再配对。通常这种跃迁是禁阻的，但如果两个能级有较大重叠时，如图1.2中S1的最低振动能级与 T1的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道偶合等作用实现这一跃迁。1.2.1.5磷光发射（Phosphorescence emission, PE）激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过振动松弛而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，此过程为磷光发射26-28。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为106100s，因此，外部光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1中振动松弛丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长。 必须指出T1可能通过热激发而重新跃回S1，即，然后再由S1经辐射跃迁回S0，即，从而发射荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光波长短。1.2.1.6 迟滞荧光迟滞荧光主要包括热激发迟滞荧光及三重态-三重态猝灭。当S1和T1间的能带跨度较小，且处于T1的受激分子的寿命较长时，可以发生T1S1的反向系统间窜跃，所导致的发射光谱类似于通常的发射荧光，但由于分子在由S1发射前，受激分子滞留在三重态，致使发射光谱具有较长的衰变时间常数29-30，此类荧光发射为热激发荧光，其荧光效率随温度升高而增大。对于高浓度溶液，位于T1态的两个分子间由于碰撞所提供的能量，足以使分子返回到S1态，此类三重态-三重态猝灭将导致迟至荧光发射。1.2.3 激发光谱与发射光谱1.2.3.2 激发光谱荧光激发光谱是通过测量荧光物质的发光强度随激发光波长变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。激发光谱的具体测绘办法，是通过扫描激发单色器以使不同波长的入射光激发荧光物质，所产生的荧光通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，由检测器检测相应的荧光强度，最后通过记录仪记录荧光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。激发光谱可供鉴别荧光物质，在进行荧光测定时供选择适宜的激发波长3840。1.2.3.3 发射光谱如果保持激发光的强度和波长恒定，将所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各波长下所对应的荧光强度，所记录的荧光强度对发射波长的关系曲线即为荧光发射光谱。荧光发射光谱表示所发射的荧光中各种波长的相对强度，可用于鉴别荧光物质，在荧光测定时可作为选择检测波长或滤光片参数的依据40。1.2.6提高荧光检测灵敏度的关键高灵敏荧光检测器的关键是在获得最大信号的同时，使背景源减至最低。在高灵敏LIF检测器中，荧光信号是由于分子和原子吸收光子同时发射，这一过程一直重复直至分子被破坏。发射过程即为激发态分子的去激过程，因而，高灵敏荧光检测必须从激发态分子中提取出所有可能的光子，使在给定的时间段内所测得的光子数超过背景的光子数，并使之进入到检测器中。Mathies 等50,51及 Larson等52对信号的产生和光子进入检测器的过程进行了非常精辟的描述。Goodwin等也对该过程进行了优异的论述43。从上述文献中得到的策略是，尽可能使分子坚固（即具有高强度，仅低于饱和状态），同时调荧光分子流经检测窗口的时间（过境时间），使其稍高于荧光基团光漂所需的平均时间。对于CE，过境时间由荧光物质的流速和通过探测体积所经过的距离决定，荧光物质的流速通常由最优化的分离过程限定52，除非在峰测量过程中区带速度改变53-55。而探测体积通常由光学元件限定，这也是高灵敏度检测器设计时所必须重点考虑的影响因素。虽然已有测量光漂数据或其他光物理常数的实例53，但实际测量时通常非常困难，因此，最简单的策略是优化信噪比（S/N），S/N依赖于激发光强度。在过境时间恒定的条件下，增大激发光功率，当饱和或光漂发生时，将导致信号跌落，S/N将在靠近起始跌落的某一点上达到最大值。Dovichi在一篇重要的文章中讨论了关于优化LIFD的这一策略56，Hernandezd等在论述毛细管共聚焦检测时也讨论了这一策略57。当满足下列条件时，将导致荧光分子产生饱和58： （1.12）式中，为聚焦的激发光束的半径，m；是测得的荧光素的寿命，ns；为摩尔吸收率；为激发波长，nm；P为激发功率，mW。对于多数具有强吸收的荧光团，当辐照度（在单位时间、单位面积上所接受的辐射能量）超过105W/cm2时，将达到此点（即满足式（1.12）。对于任意给定的系统，个别荧光素的行为可能差异很大，最大信号依赖于分子的光物理性质59,60、在给定激光波长在的吸收率、荧光量子产量、荧光受命、光漂量子产量及系统间过渡速率等因素。使激光波长与溶质分子的吸收谱带相匹配通常是困难的，而对于常规的分离过程，由于分离不同的分子，将使困难加剧。因此在分离过程中，检测限会发生很大变化61,62。相反，如在分离过程中，用同一荧光团对分子进行标记，将使问题简化。1.3 LIFD的主要生产厂家及性能指标目前LIFD的主要生产商包括Picometrics、Beckman、 ABI及Unimicro等公司。ABI公司的LIFD可用于毛细管电泳、微流控系统等，所采用的光源为气体激光器。Fig. 1.5 ZETALIF of PicometricsPicometrics公司是LIFD的专业生产商，以固态二极管激光器为激发光源，其光路系统采用共线型设计，所生产LIFD的激发波长范围300900nm，可用于高效液相色谱、毛细管电泳、微流动分析系统等分离领域。目前Agilent 3D CE及Beckman PACE 5000等荧光检测系统均可配置的Picometrics公司ZETALIF产品。ZETALIF由光电模块、激光模块、显示模块及辅助模块等四部分构成，可立式和卧式配置，如图1.5所示，表1.5列出了Picometrics公司ZETALIF产品可以提供的激光器及激发波长范围93。Table 1.5 Available lasers of PicometricsUnimicro公司所生产的TriSepTM-2100LIF激光诱导荧光检测器，采用最新的激光激发技术，以高能量、高稳定性的固体激光器为激发光源，采用独特的光路设计，保证了激发光的强度和信号的稳定，大大降低了噪声和基线漂移，具有极佳的灵敏度和超强的稳定性能，最低检测浓度可达1×10-12M，较之常规紫外/可见光检测器的最低检测浓度（1×10-7M），灵敏度要高100,000倍。TriSepTM-2100LIF激光诱导荧光检测器采用高灵敏度，大动态范围的光电倍增管，可实现单光子计数，可用于HPLC、CE及微芯片等分离领域的荧光检测。图1.6及表1.6分别给出了TriSepTM2100的装置图及主要技术指标94。Fig. 1.6 TriSepTM-2100LIF of Unimicro TechnologiesTable 1.6 Performance index of TriSepTM-2100LIF of Unimicro Technologies相对荧光单位（RFU）01000动态范围（1000 RFU范围时）>104灵敏度（mol FITC/L）10-12基线噪声（RFU）<0.005基线漂移（RFU/h）<0.01激发光波长（nm）473 发射光中心波长（nm）530 (510550)激光类型10mW DPSS 激光 473 nm波长可选范围（nm）激发光    300700发射光    350750滤光片类型473 nm窄带滤光片505 nm分色片530 nm带通滤光片供电电源要求AC，110/220V，50/60Hz工作温度范围（°C）1535相对湿度<75%检测窗口尺寸75300 µm毛细管Beckman公司所生产的LIFD主要为其毛细管电泳仪器配套，所用光源为气体激光器，表1.7给出了Beckman公司PACE MDQ LIF的主要特性参数95。Table 1.7 General specification for PACE MDQ LIF detector of BackmanSpecificationDescriptionRelative fluorescence units range(RFU)01000Dynamic range (at a dynamic range setting of 1000)>104Sensitivity (mol sodium fluorescein/L, S/N>2)10-11 Baseline noise (RFU)<0.005, peak to peakBaseline drift (RFU/h)<0.2488 nm laser module dimensionsHeight: 63.5 cm; Width: 26.3 cm; Depth: 36.0 cm; Weight: 37.3 kg635 nm laser module dimensionsHeight: 19.2 cm; Width: 13.2 cm; Depth: 17.7 cm; Weight: 2.3 kgWavelength RangeExcitation: 300700 nm; Emission: 350750 nmFiber cable length1.83 mPower requirements 100/120 V, 12 A, 50/60 Hz;220/240 V, 6A, 50/60 HzAmbient temperature operating range ()1540Recommended best performance range ()1530Relative humidity<95% non-condensing at 351.4 LIFD目前的研究现状分析1.4.1 LIFD的主要研究课题组LIFD作为一高灵敏度检测技术近年来得到了快速发展。与其它现有的检测方式相比，LIFD是目前灵敏度最高的检测技术之一，浓度检测限可达nmol/Lpmol/L，对某些荧光效率高的荧光试剂甚至可以实现单分子检测。激光光束的高汇聚性使其非常适合于微区检测，因此，LIFD 是微型化仪器和电泳芯片中应用最为普遍的检测手段。另外，许多环境样品和生物样品能发自然荧光或通过衍生技术达到荧光检测的目的，因而LIFD 的高灵敏度使其成为检测痕量环境样品和生物样品的首选技术。由于激光诱导荧光检测可以满足检测fg及ag水平在灵敏性和选择性等方面的要求，在测定生物样品中的超痕量活性物质和环境中有机污染物等方面，取得了令人瞩目的成就，近年来引起了众多研究课题组的关注。表1.8列出了LIFD的主要研究课题组及其研究领域。Table 1.8 The main research groups of laser induced fluorescence detection研究课题组主要研究领域及成就Zare R. N.首次将ILFD用于CE63-66Dovichi N. J.发明了壳流检测池，随后的LIFD单分子检测都是在此基础上完成的，对LIFD的应用作出了卓越贡献67-79。Soper S. A.主要研究领域包括：荧光探针、分子生物学、微分析仪器等，较多采用近红外激光诱导荧光监测器80-83。Issaq H. J.毛细管电泳协会的创始人之一。在激光诱导荧光检测方面主要从事紫外激光诱导荧光检测84。Sweedler J. V.领导Biotechnology Center，同时是Beckman Institute客座教授。主要研究波长分辨激光诱导荧光检测技术85-90。Mathies R. A.毛细管电泳装置的先驱，发明了“fluorescent energy-transfer labels used to sequence the human genome”91。关亚风主要研究以固体激光器为激发光源的LIFD12-17。1.4.2 LIFD的主要应用分析LIFD在生物工程中的应用领域正不断深入开展，目前已经取得了丰硕成果，表1.9列出了近年来LIFD的主要应用，衍生试剂的缩写见表1.10。随着激光技术、探测技术和电子技术等关键技术的不断提高，激光诱导荧光技术将在生物分析的各个领域中发挥更大的作用。可以预见，随着高性能荧光探针的开发，LIFD必将进一步拓宽其应用领域，解决生命科学中的重大问题，特别是单分子检测技术将是其今后的重点发展方向。1.5 选题思想及工作简介LIFD作为一种高灵敏度检测技术在生物技术等诸多领域显示出其它检测方式所不可比拟的优越性。电子技术及相关技术的飞速发展极大的改善了LIFD系统所用光学元件的精密度，虽然已出现多种商品化LIFD仪器，但多以气体激光器为激发源，其发射波长单一、价格昂贵、维护费高和寿命短等缺点在很大程度上制约了LIFD的推广和普及。激光二极管技术的快速发展，使固态二极管激光激光器具有线宽振荡窄、振幅稳定性高、输出功率稳定性高、价格低及使用寿命长等特性，因此，以固态二极管激光器为荧光检测激发源，可以提高检测生物基质中超低量溶质的能力，使LIFD装置的检测能力超过传统荧光仪所能达到的检测水平。以二极管为激发光源的检测技术有望取代传统的气体激光器而得到广泛应用，这对延长LIFD使用寿命，降低成本具有重要的意义。本文以半导体二极管激光器为激发光源，采用共聚焦光学配置，以减小雷利散射和拉曼散射所引起的背景噪声；在发射通路上以长通滤光片及带通滤波器配合使用，以消减进入光电倍增管的激光散射，提高检测器的信噪比；对聚光物镜的数值孔径进行优化，以使物镜的工作距离和其聚光能力相匹配，在不影响光路设计（大数值孔径的物镜，会给检测器的光路设计带来一定的空间位阻效应）的基础上，尽可能采用大数值孔径的物镜，以增加物镜