水稻抽穗期QTL DTH2的图位克隆和功能分析.doc

水稻抽穗期 QTL DTH2 的图位克隆和功能分析吴玮勋1，江玲1，钟铮铮2，陆广文1，万建民1*51015202530（1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）摘要：开花时间（作物中指抽穗期）是决定生长季节和植物适应特定自然环境的地区适应性的重要生态性状。水稻是起源于热带地区的短日作物。本文鉴定了一个在长日照条件下促进抽穗的微效数量性状位点 DTH2，并对其进行了分子克隆。互补和 RNA 干扰实验证实 DTH2编码一个 CONSTANS-like 蛋白。DTH2 蛋白定位在细胞核内并具有转录自激活活性，并且DTH2 的表达受节律钟调控。我们发现通过诱导成花素基因 Heading Date 3a (Hd3a) 和 RICEFLOWERING LOCUS T 1 (RFT1) 来促进抽穗，并且独立于已知的开花集成子 Heading date 1(Hd1) 和 Early heading date 1 (Ehd1)，体现了微效 QTLs 在作物育种中起重要作用。关键词：水稻；DTH2 克隆；抽穗期；功能分析中图分类号：S511.S330.2+5Map-based cloning and function analysis of QTL DTH2 forheading date in rice (Oryza sativa L.)WU Weixun1, JIANG ling1, ZHONG Zhengzheng2, LU Guangwen1, WAN Jianmin1(1. State Lab of Crop Genetics and Germplasm Ehancement, Nanjing Agricultural University,NanJing 210095;2. Cro Science Institute, CAAS, Beijing 100081)Abstract: Flowering time (heading date in crops) is an important ecological trait that determinesgrowing seasons and regional adaptability of plants to specific natural environments. Rice (Oryzasativa L.) is a short-day plant that originated in the tropics. We report here the molecular cloningand characterization of DTH2, a minor-effect quantitative trait locus (QTL) that promotes headingunder long-day conditions (LDs). Complementary test and RNA interference assay confirmed thatDTH2 encodes a CONSTANS (CO)-like protein. DTH2 protein is targeted to the nucleus and hastranscriptional activation activity and DTH2 expression is regulated by the circadian clock. Weshow that DTH2 promotes heading by inducing the florigen genes Heading Date 3a (Hd3a) andRICE FLOWERING LOCUS T 1 (RFT1), and it acts independently of the known floralintegrators Heading date 1 (Hd1) and Early heading date 1 (Ehd1), demonstrating an importantrole of minor-effect QTLs in crop adaptation and breeding.Keywords: Rice; DTH2 cloning; Heading date; Function analysis350 引言成功的现代农业依赖于作物更好地适应于当地的环境和栽培范围的扩张，主要取决于合适的开花时间（在水稻中开花时间指抽穗）1。光周期敏感性使营养生长和生殖生长适应当地的气候被认为是使作物适应特异的生态条件和环境变异从而决定开花时间的最重要的因40子1,2。在合适的生长条件下，延迟抽穗使作物拥有更长的营养生长期，从而促进更多资源的积累和分配至种子生产，然而短的或不可预知的生长季节则对生育期短的物种有利3。资源分配和压力避免之间的权衡对于作物的产量和质量是特别重要的3。利用拟南芥（长日照植物）和水稻（短日照植物），开花时间的分子机制已经进行了深基金项目：教育部博士点基金（20090097110011）作者简介：吴玮勋，（1985-），男，博士研究生，水稻分子遗传学。通信联系人：万建民，（1960-），男，教授，水稻遗传育种。E-mail: wanjm-1-入的研究。在对拟南芥的开花相关研究发现有四种主要途径参与开花调控，分别是光周期途4550556065707580径，春化途径，自主开花途径和赤霉素途径4，其中最重要的是光周期途径。在拟南芥中，GIGANTEA (GI) CONSTANS (CO) FLOWERING LOCUS T (FT)是一条主要的长日照促进开花通路5-10，这些基因在水稻中分别有相应的同源基因，组成水稻中的促进开花的通路为OsGIHd1Hd3a11-15。与拟南芥不同，该通路在水稻中仅在短日照下促进开花，因为在长日照条件下，Hd1 抑制 Hd3a 的表达，导致开花延迟14。目前的研究表明水稻的抽穗由 Hd3a（水稻短日照下的主要成花素）和 RFT1（Hd3a 的同源基因，水稻长日照下的主要成花素）促进16,17。在这些成花素基因的上游基因中，Hd1和 Ehd1 作为两个主要的开花信号集成者，接受来自其它基因的多种信号，如 OsGI, RID1,Ehd3, OsMADS50, OsMADS51, Ghd7, 和 DTH8，来调控成花素基因的表达2,12,14,18-27。这些开花时间基因的克隆为进一步深入了解水稻的开花途径具有重要的借鉴意义。在本研究中，我们克隆了一个微效 QTL，DTH2，在 LD 下诱导开花而在 SD 下没有效应，研究发现该基因对于促进水稻在长日照下开花起重要作用。1 材料与方法1.1 水稻材料和生长条件以 Asominori（Aso，粳稻）为背景亲本和 IR24（籼稻）为供体亲本的染色体片段置换系 CSSL23，携带有来源于 IR24 的 DTH2 基因。为了进一步减少 CSSL23 中的来自 IR24 的插入片段，我们筛选出了一个以 Aso 为背景，包含 DTH2 位点的 9.6-cM（厘摩）来自 IR24片段的 nearly isogenic line (NIL)。该 IR24 片段限定于第二染色体 SSR 标记 RM318 和 RM240之间。Aso 和 NIL 种植在北京自然长日照条件(Natural long-day conditions, NLDs, 116.4° E,39.9 ° N, day length > 15 h), 海南自然短日照条件(Natural short-day conditions, NSDs, 110.0°E, 18.5° N, day length < 12 h), 光照培养箱控制的短日照条件（Controlled short-day conditions,CSDs, 10h 光, 30°C/14h 暗, 25°C），光照培养箱控制的长日照条件（Controlled long-dayconditions, CLDs, 14h 光, 30°C/10h 暗, 25°C）。光照培养箱用荧光灯照明（300mol m-2 s-1），湿度为 70%。1.2 种子成熟度统计在 NLDs 和 NSDs 条件下，Aso 抽穗后 60 天后，取 Aso 和 NIL 的穗子脱粒后根据种皮的颜色来判断种子的成熟度。即统计黄色糙米在所有糙米中的比例，统计两个穗子，取平均值作为该单株的成熟度。1.3 载体构建和植物转化根据预测的候选基因序列，以 Aso 序列为模板，设计引物，扩增 DTH2 全基因组（引物见附表 1）获得了一个 7867bp 的 DNA 片段，该片段包括 4049bp 的上游启动子序列，全长编码区，1543bp 下游序列。使用日本 Takara 公司的 In-FusionTM Advantage PCR CloningKits（ pCAMBIA1305.1 的 Sma I位点，构建 pDTH2-a:DTH2-a 质粒。pDTH2-a:DTH2-a 质粒的翻译起始位点处正好有一个Nco I 酶切位点，1305 质粒的 GUS 基因翻译起始位点处也有一个 Nco I 酶切位点，因此用Nco I 酶切 pDTH2-a:DTH2-a 质粒移除 DTH2 的编码区和 CaMV 35S 启动子，之后用 T4 DNA连接酶使载体自连以形成 pDTH2-a:GUS 载体。通过引物（附表 1）使用 Warthmann 等28-2-报道的方法扩增一段包含 DTH2 人工 miRNA 序列的 261bp 片段，通过同源重组的方法把该片段重组至 pCAMBIA2300 的 Xma位点来构建 RNAi 载体。通过电转的方法将上述构建的双元载体转化入农杆菌菌株 EHA105，然后通过农杆菌介859095100105110115导的方法进行水稻遗传转化。把 pDTH2-a:GUS 载体，干扰载体和干扰空载体转化入 Aso 的愈伤中，把全长互补载体和全长互补空载体转入 NIL 的愈伤中。阳性的 pDTH2-a:GUS 转基因植株筛选后进行 GUS 染色29，用体视镜(Leica DFC420)拍照。1.4 亚细胞定位和转录自激活活性分析首先用引物（附表 1）扩增没有终止密码子的 DTH2-a CDS 片段，然后通过同源重组的方法把该片段重组至 pAN580 的 Bam HI位点。使用 PEG 介导的方法将 DTH2-a-GFP 融合蛋白和核 marker OsMADS3-mCherry 共定位于水稻叶片原生质体中30,31。GFP 检测用激光共聚焦显微镜（Leica TCS-SP4）进行观察。转录自激活实验用 Matchmaker GAL4 Two-HybridSystem 3 (Clontech)进行。首先用引物（附表 1）扩增 DTH2-a CDS 和各种缺失片段，然后通过同源重组的方法把该片段重组至 pGBKT7 的 Eco RI位点，并使各片段分别与 GAL4 DNA结合结构域完全融合，最终构建如下 5 个载体：BD-DTH2-a，BD-ZF，BD-MR，BD-CCT和 BD-ZF/CCT。所有 5 个载体和空载体都转化入酵母菌株 AH109。转录自激活活性分析使用 Clontech 公司的 Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 进行。-半乳糖活性的测定根据 Clontech 的 操 作 手 册 进 行 ( 略 有 修 改 ) ， 用 液 体 培 养 的 方 法 ， 使 用 chlorophenolred-D-galactopyranoside (CPRG; Roche Biochemicals) 作为反应底物。1.5 节律表达材料的种植与取样为了研究 DTH2 在 Aso 和 NIL 中的节律表达情况，在光照培养箱控制的长日照条件（Controlled long-day conditions, CLDs, 14h 光, 30°C/10h 暗, 25°C）和光照培养箱控制的短日照条件（Controlled short-day conditions, CSDs, 10h 光, 30°C/14h 暗, 25°C）下都种植 Aso 和NIL，每种条件下种植 3 盆。每盆分两半，使每盆都有 Aso 和 NIL，保证种植条件一致。在CLDs 下 68 天，CSDs 下 36 的时候，开始取样，每四小时取一次样，取水稻植株的次新叶，每次取三株，取完后迅速装袋然后放入液氮中速冻使材料保持新鲜，一共取 48h。用第一天取 的 材 料 来 研 究 其 它 基 因 如 Hd3a, RFT1, Hd1, Ehd1, OsMADS14, OsMADS15,RID1/OsId1/Ehd2, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51, Ghd7 和 DTH8 在 Aso 和 NIL 中的表达情况。各种用于节律表达分析的开花时间 NILs，或野生型和相应的突变体材料包括 Hd1 的NILs，Ehd1 的 NILs，Tohoku IL9/ehd2 突变体，Tohoku IL9/ehd3 突变体，Dongjin/osmads50突变体，Dongjin/osmads51 突变体，Ghd7 的 NILs 和 DTH8 的 NILs 种植在 CLDs。在第 49天的暗期后 2h 取样，分别收集 3 株苗的次新叶。RNA 提取使用 QIAGEN 公司的 RNeasy PlantMini Kit，略有修改。RT-PCR 用 QIAGEN 公司的 QuantiTect® Reverse Transcription Kit，略有修改。Quantitative RT-PCR 用 TaKaRa 的 SYBR® Premix Ex TaqTM Kit，20l 反应体系。在 Applied Biosystems 的 ABI PRISM 7900HT Real-time PCR 仪上进行反应。水稻 UBQ 基因(LOC_Os03g13170)作为内参。Quantitative RT-PCR 的引物序列见附表 1，数据用相对定量的方法进行统计32。-3-2 结果与分析1201251301351401452.1 DTH2 的精细定位本实验室之前的研究利用一个来源于 Asominori（Aso，粳稻）和 IR24（籼稻）的重组自交系（RILs）群体，连续 5 年在第二染色体长臂末端标记 C601 附近检测到一个微效抽穗期 QTL33，名为 qDTH-2（QTL for Days to heading on chromosome 2, 在此研究中命名为DTH2）。为了研究 DTH2 在抽穗期中的遗传效应，我们开发了一个以 Aso 为背景，包含DTH2 位点的 9.6-cM 来自 IR24 插入片段的 NIL。在北京自然长日照条件下（NLDs，日长>15 h），和 Aso 比相比，NIL 延迟 7.4 天抽穗，但在海南自然短日照条件下（NSDs，日长<12 h）差异不显著（图 1A,B）。在受控制的长日照条件下(CLDs，14 h light/10 h dark) NIL也比 Aso 晚抽穗，而在受控制的短日照条件下(CSDs，10 h light/14 h dark)差异也不显著（图1B）。另外我们发现在 NLDs 下，当种子收获的时候，有 81.5%的 Aso 种子能成熟，而只有28.6%的 NIL 种子能成熟，71.4%的种子都是青的。相反的，在 NSDs 下，收获后所有来自Aso 和 NIL 的种子都能成熟（图 1C,D）。这些结果也证明来自 Aso 的等位基因能更好地适应 NLDs 以形成生殖适应。遗传分析表明，Aso 和 NIL 杂交形成的 F2 群体中早抽穗和晚抽穗的分离比大约为 3:1（3213:1099, 2 = 0.55, P = 0.46），表明 DTH2 是一个单孟德尔因子。我们用 F2 衍生家系（F2:3）的平均表型值来鉴定抽穗期，我们选择了 1099 个晚抽穗的纯合家系，最终将 DTH2 定位在 dcaps3 和 dcaps5 之间的 37.6Kb 的区间内（图 1E）。图1 两个亲本的表型和DTH2的图位克隆。（A）Aso和NIL在北京NLDs下的表型，照片拍摄于Aso抽穗的时候。（B）两个亲本在四种不同条件下的抽穗期。数据用平均值±标准误差显示。（C）NLDs下，Aso抽穗后60天时收获的来自Aso和NIL的糙米。（D）Aso和NIL在NLDs和NSDs下的种子成熟百分率。（E）DTH2的图位克隆。底部显示DTH2编码区结构及Aso (DTH2-a)和NIL (DTH2-i)等位基因之间的自然变异。长方形和线分别代表外显子和内含子。P代表双尾T测验的P值，实验所用的植株数显示在柱子中。数据用平均值±标准误差显示。Fig. 1 Phenotypes of the parental lines, map-based cloning of DTH2. (A) The phenotype of Aso and NIL under NLDs in Beijing.Photo was taken at the Aso heading stage. (B) Days to heading of the parental lines under four different conditions. (C) Thebrown rice of Aso and NIL from panicles sampled 60 days after Aso heading under NLDs. (D) Seed maturity percentage of Asoand NIL under NLDs and NSDs. (E) Map-based cloning of DTH2. The bottom diagram shows the coding region structure ofDTH2 and natural variation between the Aso (DTH2-a) and NIL (DTH2-i) alleles. Rectangles and lines represent exons andintrons, respectively. P represents P value from two-tailed t-test. Numbers of the plants used in the study are indicated in thecolumns. Data are presented as mean ± standard error (s.e.m.).-4-2.2 转基因功能验证150155160165170175为了证明 ORF5 是目的候选基因，我们构建了一个包含 7867bp（包括 4049bp 上游序列，ORF5 全长，1543bp 下游序列）来自 Aso 的片段的载体 pDTH2-a:DTH2-a，转入 NIL 中。我们进行了两次独立的转化，分别获得了 25 和 60 株独立的 T0 转基因植株，种植在北京 NLDs下。通过转基因鉴定其中分别有 23 和 39 株转基因阳性植株。结果显示和空载体相比，转基因植株的抽穗期明显提前。于是我们经过转基因拷贝数检测随机挑选两株单拷贝的 T0 植株，收种后种植成两个 T1 家系，随后我们又种植了两个纯合 DTH2-a 转基因的 T3 家系（#18-7-2和#26-1-4），发现这两个家系的平均抽穗期比空载体提前，种子成熟度也比空载体显著提高（图 2A）。另外，我们构建了 RNA 干扰（RNAi）载体，准备干扰 Aso 中的 DTH2-a。经过转基因检测，我们找到了两个纯合的 T3 干扰家系（#5-4-2 和#38-37-4）。和空载体相比，转基因植株的抽穗期明显延迟，种子成熟度也明显降低，表型和空载体-NIL (EV-N)相似（图2B）。因此我们认为 ORF5 就是 DTH2。图2 T3互补和干扰转基因植株的表型和分子鉴定。T3转基因家系包括空载体-NIL (EV-N)， 互补 (#18-7-2和#26-1- 4)，空载体-Aso (EV-A)， 和 RNAi (#5-4-2和#38-37-4) 在NLDs下的照片（A），抽穗期（B）和种子成熟度（C）。P1 和P2分别表示互补和EV-N植株之间，RNAi和EV-A植株之间的双尾T检验和Wilcoxon符号秩检验。实验中用到的植株数在柱子中显示，数据用平均值±标准误差显示。Fig. 2 The phenotype and molecular identification of T3 transgenic plants of complementation and RNAi. Thephoto (A), days to heading (B), and seed maturity percentage (C) of T3 transgenic lines including emptyvector-NIL (EV-N), complementation (#18-7-2 and #26-1-4), empty vector-Aso (EV-A), and RNAi (#5-4-2 and#38-37-4) under NLDs. P1 and P2 indicate two-tailed t-test and Wilcoxon signed-rank test results between co-mplementation and EV-N plants, RNAi and EV-A plants, respectively. Numbers of the plants used in the study areindicated in the columns. Data are presented as mean ± standard error (s.e.m.).2.3 DTH2 的亚细胞定位和转录自激活活性分析为了确定 DTH2 蛋白的亚细胞定位，我们融合了 DTH2-a 的全长 CDS 和 GFP，DTH2-a-GFP 融合蛋白和一个核标签共定位在水稻叶片原生质体中（图 3A-D）。说明 DTH2蛋白定位在细胞核中。进一步，转录自激活活性实验表明 DTH2 在酵母中有很强的转录自激活活性（图 3E）。缺失分析表明存在于锌指结构域和 CCT 结构域中间的区域对于转录活性是必须的（图 3E）。这些结果表明 DTH2 在细胞核中的基因表达调控中存在重要作用。-5-180185190195200205210图3 DTH2的亚细胞定位。（A）DTH2-a-GFP融合蛋白在细胞核中，（B）核标记（OsMADS3-mCherry），（C）明场，（D）融合图片。比例尺为7.5 um。（E）DTH2在酵母的GAL4系统中的转录自激活活性实验和缺失分析。BD是GAL4-DNA结合结构域；ZF，MR和CCT分别表示DTH2的锌指区域，中间区域和CCT结构域；EV表示空载体负对照。-半乳糖(-gal)活性通过液体培养的方法测定。数据用平均值±标准偏差显示，三次独立实验。Fig. 3 Subcellular localization of DTH2. (A) DTH2-a-GFP fusion protein in the nuclei, (B) a nuclear marker(OsMADS3-mCherry), (C) bright field, and (D) the merged image. Scale bar represents 7.5 um. (E)Transactivation activity assay of DTH2 and its deletion derivatives in the yeast GAL4 system. BD is GAL4-DNAbinding domain; ZF, MR, and CCT indicate the zinc finger region, the middle region, and the CCT domain ofDTH2, respectively; EV denotes empty vector negative control. The -galactosidase (-gal) activity was measuredusing a liquid culture assay. The mean ± standard deviation (s.d.) was collected from three independentexperiments.2.4 DTH2 的时空表达模式分析为了检测 DTH2 的时间和空间表达模式，我们用实时定量 PCR（qRT-PCR）对来自 Aso的各组织中检测 DTH2 的表达水平。在所有组织中都检测到 DTH2 的表达，但在叶片和叶鞘中的表达最丰富（图 4A）。另外 qRT-PCR 的结果也表明 DTH2-a 和 DTH2-i 表现相似的表达水平和模式。在 CLDs 和 CSDs 下，它们的表达在黎明后 8 小时开始积累，黄昏后 2 小时达到高峰，之后开始降低（图 4B,C）。图4 DTH2的时空表达模式分析。(A) DTH2-a在自然长日照条件下的组织特异表达模式。在CLDs (B)和CSDs(C)下，DTH2-a 和DTH2-i 等位基因节律表达模式的qRT-PCR分析。开放和封闭的柱子分别代表光期和暗期。表达水平用水稻Ubiquitin (UBQ)基因作内参。数据用平均值±标准偏差显示，三次技术重复和两次生物学重复。Fig. 4 The temporal and spatial expression pattern analysis of DTH2. (A) Tissue-specific expression pattern ofDTH2-a under NLDs. qRT-PCR analysis of the diurnal expression patterns of DTH2-a and DTH2-i alleles underCLDs (B) and CSDs (C). The open and filled bars represent light and dark periods, respectively. The expressionlevel is shown as a ratio with the rice Ubiquitin (UBQ) gene. The mean ± s.d. was obtained from three technicalrepeats and two biological repeats.2.5 DTH2 通过上调 Hd3a 和 RFT1 的表达来促进抽穗我们通过比较一些光周期相关基因在 Aso 和 NIL 之间的表达差异，发现在 CLDs 下，两个成花素基因 Hd3a 和 RFT1，在 Aso 中的表达水平比在 NIL 中的高，但在 CSDs 下几乎一致（图 5A,B,E,F）。相似的，仅在 CLDs 下，下游开花相关基因 OsMADS14 和 OsMADS15-6-在 NIL 中的表达下降（图 5C,D,G,H）。215220225230随后我们检测 DTH2 调控 Hd3a 和 RFT1 是否由 Hd1 或 Ehd1 介导，然而在 Aso 和 NIL之间 Hd1 或 Ehd1 的表达没有显著差异（图 6A,B）。另外，在携带有无功能的 hd1 或 ehd1等位基因的 NILs 中，DTH2 的表达与其在相应的野生型植株中的表达相似（图 7A,B）。这些结果表明 DTH2 对于成花素基因的效应独立于 Hd1 和 Ehd1。同理，其它 Hd1 和 Ehd1 的调节子，如 RID1/OsID1/Ehd2, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51,Ghd7 和 DTH8 的表达也不受 DTH2 的影响（图 6A,B）。相似的，DTH2 的表达也不受这些开花调节子的影响（图 7C-H）。因此，DTH2 可能是一个新的在 LD 下诱导开花，独立于Hd1 和 Ehd1 的开花集成基因。图 5 在 CLDs (AD)和 CSDs (EH)下，Hd3a，RFT1，OsMADS14 和 OsMADS15 在 Aso 和 NIL 中节律表达模式的 qRT-PCR 分析。开放和封闭的柱子分别代表光期和暗期。表达水平用水稻 UBQ 基因作内参。数据用平均值±标准偏差显示，三次技术重复和两次生物学重复。Fig. 5 qRT-PCR analysis of Hd3a, RFT1, OsMADS14, and OsMADS15 diurnal expression patterns in Aso and NILunder CLDs (AD) and CSDs (EH). The open and filled bars represent the light and dark period, respectively.The expression level is shown as the ratio with the rice UBQ gene. The mean ± s.d. was obtained from threetechnical repeats and two biological repeats.-7-图 6 在 CLDs (A) 和 CSDs (B) 下，Hd1，Ehd1，RID1/OsId1/Ehd2，Ehd3，OsMADS50，OsMADS51，Ghd7和 DTH8 在 Aso 和 NIL 节律表达模式的 qRT-PCR 分析。开放和封闭的柱子分别代表光期和暗期。表达水235240平用水稻 UBQ 基因作内参。数据用平均值±标准偏差显示，三次技术重复和两次生物学重复。Fig. 6 qRT-PCR analysis of Hd1, Ehd1, RID1/OsId1/Ehd2, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51, Ghd7 and DTH8diurnal expression patterns in Aso and NIL under CLDs (A) and CSDs (B). The open bars and the filled barsrepresent light period and dark period, respectively. The expression levels are shown as the ratio with the rice UBQgene. The mean ± s.d. was obtained from three technical repeats and two biological repeats.-8-