水稻茎部内生细菌及根际细菌群落结构多样性研究.doc

水稻茎部内生细菌及根际细菌群落结构多样性研究胡桂萍1,2 尤民生1* 刘波2* 朱育菁2 郑雪芳2 林营志2 (1福建省农林大学应用生态研究所，福建省福州市，350002；2福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建省福州市，350003)摘要：为探讨水稻茎部内生细菌和根际细菌群落结构组成，及其与水稻品种特性的关系。2008年7月从5个品种水稻茎部和根际土分离内生细菌和根际土壤细菌，并进行脂肪酸鉴定。结果表明，内生细菌有13个种，隶属于9个属，根际细菌有13个种，隶属于10属，两群落的优势菌均为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。以品种为样本，以根际细菌、内生细菌和水稻生物学特征参数为变量，进行相关分析得到，根际细菌和内生细菌与水稻穗粒数，千粒重，亩产存在正相关，与有效穗呈负相关。关键词：水稻，内生细菌，根际细菌，群落多样性植物内生细菌（Endophytic bacteria）是指能够定殖在植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内，并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物1。植物内生细菌长期生活在宿主体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中形成了共生的关系，一方面内生细菌可以从宿主吸收营养供自己生长的需要，另一方面内生细菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。感染内生细菌的宿主往往具有生长速度快2、增加产量3,6，抗逆境5、抗病害3等优势。植物根际是一个复杂的生态系统，栖息着各种各样的微生物，其中，细菌是这些微生物中的组要组成成员8，细菌的组成及其生命活动对于植物的生长，产量以及整个生态系统的物质转化和能量流动均有着重要的作用9。研究表明大量的根际有益微生物具有固氮、解磷、产生植物激素等促进植物生长和防治病害的能力，对植物的益处主要表现在，提高根、茎、叶、穗等氮的含量，增加分蘖数、根长、根面积；提前孕穗期及开花期；增加穗粒数及粒重；提高叶绿素含量及种子萌发率等，提高作物产量等作用。 水稻是世界上最重要的谷类作物之一，是世界上50%以上的人口的粮食之源。目前，水稻的产量的提高主要依靠化肥和农药的大面积的施用，虽取得一定的效果，但是也产生了极大的环境问题，所以寻找另外一种新的环保的增产途径尤为重要。2006年我国学者报道利用内生菌技术培育出优质高产水稻，所以从微生物角度来研究水稻增产工作将是一个新的方法和新的研究领域。目前，国内外主要是集中于单个内生细菌或根际细菌对水稻的固氮、抗收稿日期：基金项目：国家863项目“高产优质多抗水稻分子品种创制”（2006AA100101），国家863项目“农作物重大病害多功能广谱生防菌剂研究和创制”（2006AA10A211）；福建省财政专项福建省农业科学院科技创新团队建设基金(STIFY03)。 作者简介： 胡桂萍 （1985-），女，福建省长汀人，硕士研究生，研究方向为有害生物的检验检疫。E-mail：hugp_2007*通讯作者：尤民生（1954-），教授博士生导师，研究方向为昆虫生态及害虫综合治理. E-mail：msyou 刘波（1957-），博士, 研究员, 研究方向为微生物生物技术与农业生物药物. E-mail：fzliubo病、促生等作用的研究，而对水稻内生细菌和根际细菌群落结构相关性研究及两者与植物相互作用的研究甚少。本研究通过分离不同品种水稻茎部内生细菌和根际土壤细菌，了解它们的群落结构组成，探讨在相同栽培条件下，水稻茎部内生细菌和根际细菌群落结构间的相互关系及其与水稻品种特性，试图通过内生细菌或者根际细菌群落结构特点为指标来指示水稻品种特性，从微生态学角度上分析水稻生长特性，为水稻品种特性研究开辟新的思路，同时也为进一步研究和开发利用有益内生细菌和根际细菌资源开发新的方法，为水稻增产工作奠定研究基础。1 材料与方法1.1 供试水稻水稻由福建省农业科学院稻麦研究所提供，水稻品种为：航1号，航2号，优航1号，优航2号，汕优63。1.2 方法1.2.1 田间试验设计和性状调查本试验于2008年在福建省农业科学院沙县水稻试验站2号田块进行，5月16日播种，大棚旱育苗，6月26日插秧。田块面积2亩，随机区组设计，重复3次，单行区，行长10m，行距30cm，穴距13cm，每穴一棵苗，正常大田管理，生育期间调查抽穗期。9月23日收获，收获时每品种取10株，调查其穗数，计算10株穗数的平均数，选取与平均数相近的3株，风干后进行室内考种，考种项目有株高，穗数，总粒数，结实率等，并计算亩产。1.2.2 采样方法随机采样，每品种采3株，水稻连根带土掘起，把掘出的水稻植株土壤部分严密的用塑料袋包住，并用细线扎好，带回实验室。去除水稻植株根外部土壤，取粘在水稻根际的土样视为根际土，距根部10cm-15cm水稻植株为水稻茎基部。1.2.3 水稻内生细菌分离采用表面消毒研磨法及平板稀释分离法。称取水稻茎部组织5g，置于75%乙醇中浸泡1min后，于0.1%升汞中消毒23min，立即用无菌水漂洗3次（除去剩余升汞）。将样品移入无菌研钵中，用灭菌剪刀剪碎后加入10mL无菌水，充分研磨。静止2030min后，吸取1mL进行梯度稀释，取后三个稀释度涂板，每个浓度3个重复。为了检查表面消毒效果，将表面消毒过的材料与培养基接触5min，在相同条件下培养4872h。如果平板没有菌落长出，那么表明消毒彻底，若平板有菌落长出，那么该菌不是内生细菌，弃之。1.2.4 水稻根际细菌分离 称取10g水稻根际土稀释在90ml无菌水中，震荡，稀释为10-2，10-3，10-4，各取200L稀释液涂布于NA平板上，然后将NA平板倒置于30暗培养箱中培养2天，并计数、纯化、保存分离得到的菌株。1.2.5 细菌的脂肪酸鉴定细菌鉴定通过美国MIDI公司开发的全自动微生物鉴定系统Sherlock MIS鉴定。脂肪酸提取过程和方法参照J.Heyrman4。1.4 数据处理内生细菌和根际细菌数量分析采用单因子方差分析（Fishers LSD test）；相关分析采用，以5个水稻品种为样本，以内生细菌数量，根际细菌数量和水稻品种特性参数（包括生育期、穗瘟率、最高分蘖数、有效穗、成穂率、穗粒数、结实率、千粒重、亩产、株高）为变量，进行Pearson相关分析，所用软件为SPSS12.0（SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA）。2 结果与分析2.1 不同品种水稻茎部内生细菌和根际细菌总量试验结果见表2，总体上看，不同品种茎部内生细菌和根际细菌含量差异很大，根际细菌的含量远大于内生细菌含量。且水稻品种间根际细菌含量差异很大，其中优航1号的根际细菌含量最高为，25.0×104cfu/g；其次为品种优航2号，根际细菌含量为25.0×104cfu/g；接下来依次为：汕优63，航1号，航2号，根际细菌含量分别为16.0×104cfu/g、12.0×104cfu/g、11.5×104cfu/g。品种间内生细菌含量有差异，含量最高的为品种优航1号和优航2号，其次为品种汕优63，接下来为航1号和航2号。表2不同品种水稻茎部内生细菌和根际细菌总量Table 2 The content of the endophytic bacteria and rhizosphere bacteria of different rice cultivars品种Variety根际细菌(×104cfu/g)Rhizosphere bacteria(×104cfu/g)内生细菌(×104cfu/g)Endophytic bacteria(×104cfu/g)航1号 Hang 1hao12.0±1.73b0.25±0.09b航2号 Hang 2 hao11.5±1.26b0.21±0.06b优航1号youhang1hao25.5±2.25a0.67±0.03a优航2号youhang2hao25.0±4.36a0.67±0.14a汕优63 shanyou6316.0±1.53b0.31±0.09b注：表中数值为平均值±标准误，同一列中不同字母表示在5%水平上差异显著（Fishers LSD test）。Note: Values are mean±SE. Different letters in the same column indicate that are significantly different at P<0.05(Fishers LSD test) .2.2 水稻茎部内生细菌和根际细菌的脂肪酸鉴定2.2.1 内生细菌 从水稻茎部分离到的25株内生细菌中与MIDI数据库比较相似性指数大于0.500，可确定其菌种名称的有23株，属于13个种，隶属于10属（见表3）分别是：芽孢菌属、假单胞菌属、食酸菌属、寡养单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、微杆菌属、不动杆菌属、克雷伯氏菌属、伯克霍尔德菌、肠杆菌属。其中，芽孢杆菌有4个种，其余9个属包含1个种。同时，芽孢杆菌属为优势菌属，占内生细菌总数的56.5%。2.2.2 根际细菌 33株根际细菌脂肪酸鉴定结果见表4，分别属于10个种，隶属于8个属，分别为芽孢杆菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、光杆菌属、肠杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、金黄杆菌属。其中，芽孢杆菌属为优势菌属，占根际细菌总数的42.4%。表3 水稻茎部内生细菌Table 3 Endophytic bacteria isolated from the stems of rice编号number属名genus name种名Species name中文名Chinese name相似系数Similarity Index菌株数Strain number1芽孢杆菌属Bacillus cereus蜡状芽孢杆菌0.85492待添加的隐藏文字内容2芽孢杆菌属Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌0.88423芽孢杆菌属Bacillus atrophaeus萎缩芽孢杆菌0.76514芽孢杆菌属Bacillus megaterium巨大芽孢杆菌0.63725假单胞菌属Pseudomonas fluorescens荧光假单胞菌0.53216食酸菌属Acidovorax konjaci魔芋食酸菌0.76317寡养单胞菌属Stenotrophomonas maltophilia嗜麦芽糖寡养单胞菌0.64918鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas yanoikuyae矢野口鞘氨醇单胞菌0.62619微杆菌属Microbacterium barkeri巴氏微杆菌0.538110不动杆菌属Acinetobacter calcoaceticus乙酸钙不动杆菌0.714111克雷伯氏菌属Klebsiella-pneumoniae pneumoniae肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种0.672112伯克霍尔德菌Burkholderia gladioli唐菖蒲伯克霍尔德菌0.678113肠杆菌属Enterobacter hormaechei霍氏肠杆菌0.6561注：微生物自动鉴定系统对细菌的鉴定判别依赖于相似性指数（Similarity Index），当相似性指数大于0.500，说明匹配性很高，为典型种；大于0.300小于0.500，说明匹配性较低，为非典型种；小于0.300：说明数据库没有此菌种的数据，给出的是最接近的种。表4 水稻根际细菌Table 4 The rhizosphere bacteria of rice 编码Number 属 Genus name种Species name 中文名Chinese name相似系数Similarity Index菌株数Strain number1芽孢杆菌属B. cereus蜡状芽孢杆菌0.837112芽孢杆菌属B. megaterium巨大芽孢杆菌0.71653芽孢杆菌属Bacillus sphaericus球形芽孢杆菌0.79345芽孢杆菌属B. subtilis枯草芽孢杆菌0.80626假单胞菌属P. fluorescens荧光假单胞菌0.53228寡养单胞菌属S. maltophilia嗜麦芽糖寡养单胞菌0.52939光杆菌属Photorhabdus luminescens 发光光状杆菌0.518110肠杆菌属Enterobacter cloacae阴沟肠杆菌0.664111鞘氨醇单胞菌S. yanoikuyae矢野口鞘氨醇单胞菌0.626113金黄杆菌属Chryseobacterium indologenes产吲哚金黄杆菌0.6931注：微生物自动鉴定系统对细菌的鉴定判别依赖于相似性指数（Similarity Index），当相似性指数大于0.500，说明匹配性很高，为典型种；大于0.300小于0.500，说明匹配性较低，为非典型种；小于0.300：说明数据库没有此菌种的数据，给出的是最接近的种。2.4 水稻茎部内生细菌和根际细菌联系及其与水稻品种特性的相关性为了深入分析水稻茎部内生细菌和根际细菌相互关系及其与水稻品种特性的影响，对表1中水稻各品种特征参数包括（生育期、穗瘟率、最高分蘖数、有效穗、成穂率、穗粒数、结实率、千粒重、亩产、株高）与内生细菌数量和根际细菌数量进行Pearson相关分析。结果见表7，从表中可以得到水稻茎部内生细菌和根际细菌与水稻有效穗存在负相关，与穗粒数，结实率，千粒重，理论亩产存在极显著正相关，但与水稻的株高，生育期，穗瘟相关不显著。表1 水稻品种特性Table 1 Biological charateristics for rice varieties品种Variety全生育期（天）穗瘟()最高分蘖数（个）有效穗（粒）成穗率（%）穗粒数(个)结实率（%）千粒重（g）亩产(kg)株高(cm)航1号133.6731.1612.138.9173.44122.2978.5228.11485.44117.67航2号133.677.6614.409.3064.49126.6376.8128.23519.93116.67优航1号130.6784.2614.038.3059.51127.5583.2829.22564.80114.00优航2号130.6714.2112.278.4068.34139.5483.8929.17563.54115.67汕优63128.6730.3213.709.2867.99112.5779.1828.43495.06100.00表7 水稻茎部内生细菌和根际细菌与水稻生物学特性间的相关系数Table7 Correlation coefficient between microbe groups and biological charateristics of rice微生物类群microbe groups生物学特征biological charateristics全生育期稻瘟最高分蘖数有效穗成穗率穗粒数结实率千粒重亩产株高内生细菌Endophytic bacteria-0.4620.517-0.164-0.931*-0.4650.6410.987*0.986*0.894*0.122根际细菌Rhizosphere Bacteria-0.5640.526-0.094-0.881*-0.5040.5670.980*0.993*0.880*0.002Pearson相关分析Pearson correlation analysis，* 和* * 分别表示在0.05和0.01水平上相关显著(双侧检验)indicate the corelation is significant at 0.05 and 0.01 level(2-tailed)3 讨论Fisher PJ等10认为在植物内生微环境中，不同的微生物相互作用，并建立一种平衡，从而形成一种相对稳定的细菌菌群。从分离出的内生细菌来看，有些菌的分离率较高，为优势菌，如芽孢杆菌属，而有些菌相反，为稀有属。本试验中分离到的水稻内生优势菌为蜡状芽孢杆菌，与刘云霞13等（1999）从水稻（沈农319，中百4号）分离到的优势菌为巨大芽孢杆菌和杨海莲14等从水稻（越富）分离得到的优势菌为成团肠杆菌Enterobacter agglomerans不同。由于水稻品种、生长环境、土壤营养条件不同导致水稻植株内生环境中优势菌群不同，这种群落结构的差异性是内生菌与水稻共同进化形成的，是水稻的遗传性，生理、代谢产物与微生物的营养要求和生理代谢等相互适应的结果。同时比较内生细菌和根际细菌可以看出，从水稻茎部中分离到的内生细菌有很大一部分在根际微环境中也存在，但有的根际细菌在植物体内又不一定有，说明内生细菌和根际细菌之间存在一定的联系。罗明7等和孟颂东20等分别从棉花和甜玉米两种植物的根部和茎部分离出的内生细菌，其大部分分类单位与土壤常见的细菌相同，且根中细菌数量大于茎中的细菌数量。现在大量研究认为内生细菌起源于根际，并由此进入植物组织内15。且发现这些内生细菌主要为兼性内生的土壤性细菌，最常见的优势种群有假单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、土壤杆菌属Agrobacterium16。所以是否可以认为内生细菌是植物根际细菌在与植物长期适应过程中有选择性地进入到植物体内值得进一步探究。另外，大量研究表明内生菌群落结构与植株品种，自身生长环境，营养条件，遗传背景有关11,12。本实验通过相关分析得到水稻内生细菌和根际细菌与水稻生物学参数有效穗呈负相关，而与穗粒数，结实率都存在正相关，说明内生细菌和根际细菌在水稻生长发育过程中，尤其是产量形成上都起了非常重要的正效益，虽然大量资料表明内生细菌和根际有益细菌有促进水稻根系分泌有机物合成，提高叶片光合效率，促进水稻生长，提高水稻产量等作用，但在水稻生长过程中，水稻内生细菌和根际细菌如何调节水稻生长机制的，目前还不是很清楚，水稻生长机制调节是多种类群微生物作用的结果还是单个微生物起作用也值得深入研究，另外，这种调节机制是否与水稻生育期有关等问题，也是值得进一步研究探究。参考文献1 Kleopper J W, Schipper B, Bakker P A H M. 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Advances in Plant Sciences. 1999, Vol.2. pp183190, China Higher Education Press, Beijing.Study on the diversity of the endophytic bacteria and rhizosphere bacteria in riceHu GuiPing 1,2, You MinSheng 1*, Liu Bo 2*, Zhu Yuqing 2, Zheng XueFang 2, Lin YingZhi 2 (1 Institute of Applied Ecology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China ;2 Agricultural Biological Resource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)Abstract：The present paper dealt with study on the diversity of endophytic bacteria and rhizosphere bacteria isolated from the rice. Fatty-acid identification showed that the endophytic bacteria were classified into 13 species that belonged to 10 genera and rhizosphere bacteria classified into 10 species that belonged to 8 genera, Bacillus cereus was the dominant species in both communities. The correlation analysis was conducted by using the cultivars as samples and the amounts of endophytic and rhizosphere bacteria as well as parameters of biological charateristics as variables. The results showed that the relationship between the bacteria and seed setting percentage、1000-grain weight and plant production were positively correlated, whereas the relationship between bacteria and effective spikes was negatively correlated.Key words：Rice, Rhizosphere bacteria, Endophytic bacteria, Diversity of community