毕业设计（论文）不同种树莓叶片中粗黄酮和抗氧化活性比较.doc

毕业论文不同种树莓叶片中粗黄酮和抗氧化活性比较化工与环境学院11学生姓名： 学号：生物工程学 院： 专 业：指导教师：2015年6月不同种树莓叶片中粗黄酮和抗氧化活性比较摘要：本研究以不同品种的树莓叶片为实验材料，用乙醇和水作为提取溶剂，利用辅助超声法，分别提取澳洲红、刚果红、黄树莓和智利黑四种不同品种树莓叶片中的粗黄酮物质。最终确定最佳提取工艺为70%(v/v)的乙醇作为提取溶剂，料液比1:10(mg/ml)，超声温度50，功率360400w，超声时间30min，再加入氯仿去除杂质。结果显示：澳洲红叶片中的粗黄酮物质提取量显著高于其它三个品种，存在显著差异。比较它们对DPPH自由基的清除作用，结果显示澳洲红中粗黄酮物质抗氧化活性明显优于其他三个品种。关键词：树莓，黄酮，响应面法，超声波辅助，抗氧化活性Different kinds of raspberry leaves crude flavonoids and antioxidant activity compare Abstract：In this study,different varieties of raspberry leaves as the materials, with ethanol and water as the extraction solvent, using the auxiliary method of ultrasonic.Total flavonoids were extracted from four different varieties of raspberry leaves，including the Australian red, Congo red, yellow raspberry, Chile black.The best extraction process is 70% (v/v) of ethanol as the solvent, the ratio of material to liquid was 1:10 (mg/ml), and the ultrasonic temperature is 50, power is 360400w, ultrasonic time is 30min. Then adding chloroform to remove the chlorophyll.The results show: the extraction rate of crude flavonoids in Australia leaves was significantly higher than that of the other three varieties. Comparing their DPPH radical scavenging activity.The results showed that the Australian red rough flavonoid antioxidant activity was significantly better than the other three species.Keywords: raspberry leaves, crude flavonoids, ultrasonic assisted, antioxidant activity目录1 前言11.1树莓的生物学特性和价值11.2黄酮类化合物11.3黄酮类化合物的提取方法21.3.1 水浸提法21.3.2 有机溶剂提取法21.3.3 超声辅助提取法31.3.4 微波萃取法31.4 植物叶片提取中几种杂质的去除方法41.4.1 叶绿素41.4.2 蜡质41.4.3 蛋白质51.4.4 鞣质51.4.5 其他杂质51.5 黄酮化合物抗氧化活性测定方法51.6 研究目的及意义62 材料与方法72.1 实验材料72.2 主要药品及试剂72.3 主要仪器82.4 实验方法82.4.1 芦丁标准曲线的绘制82.4.2 总黄酮含量的测定方法82.4.3 树莓叶片粗黄酮提取液中杂质的处理研究92.4.4 树莓叶片总黄酮的提取工艺流程92.4.5 提取溶剂的研究92.4.6 树莓叶片中黄酮类物质的抗氧化研究93 结果与分析113.1 不同提取溶剂下树莓叶片粗黄酮提取量的比较113.2 不同浓度乙醇溶剂下树莓叶片粗黄酮提取量的比较113.3 氯仿对树莓叶片中粗黄酮提取量的影响研究123.4 不同品种树莓叶片粗黄酮物质提取量的比较133.5 清除DPPH自由基活性评价研究144 讨论164.1 结果164.2 树莓叶片总黄酮含量测定方法的研究164.3 树莓叶片提取黄酮去除杂质的研究164.4 树莓叶片总黄酮提取剂的研究174.5 树莓叶片总黄酮提取过程的研究174.6 树莓叶片总黄酮抗氧化性的研究175 结论18参 考 文 献19致 谢211 前言1.1树莓的生物学特性和价值树莓（Rubus idaeus）属于蔷薇科植物，又被称为覆盆子，是多年生的小灌木，在果树分类学上属于浆果类果树，它的寿命一般是20年左右，在种植第二年结果，第三年便可进入丰产期，第四年、第五年它的产量就可达到最高。人们喜爱树莓，除了其具有鲜艳的外观外，它的果实口感独特，而且树莓本身对人体具有明显的保健作用，因此十分受欢迎。树莓的适应性比较强，在我国很多地方都有种植，主要分布在东北、东南和西南三大地区，大约有210种。根据果实成熟时候的颜色，可以将树莓分为黑树莓、黄树莓、红树莓和蓝树莓等，也可以成为称黑莓、黄莓、红莓和蓝莓等1。树莓的果实鲜嫩汁多，香甜可口，而且含有丰富的维生素和矿物质元素，特别是还有大量的黄酮类化合物、SOD、鞣花酸等活性物质,被人们称做 “生命之果”23，具有较高的食用价值。除此之外，树莓还具有重要的药用植物，它的根、茎、叶、果实均可入药。现在许多关于树莓方面研究都主要集中在它的栽培繁殖和果实的加工利用方面，对于树莓其他部位的研究还很少。有些关于树莓叶片的研究表明，树莓叶片中含有丰富的黄酮类化合物4，长期以来，在西方民间广为流传着一种方法可以治疗孕妇早期的恶心呕吐，也可以预防流产，并且能在其生产时缩短产程、减轻生产疼痛，这种药方就是用红莓叶制成茶来泡服，这种茶除了以上功效外，还可以用来治疗痛经；另外树莓叶在花开前采集,制成的草药既可以利尿,又可以作为一种放松剂。树莓叶中除了含有大量的黄酮类物质，还有维生素及微量元素等，但是起主要作用的还是黄酮类化合物5。叶片中还可以提取精油用于化妆品的添加，除此之外，树莓叶片中的提取物还具有许多其他功效值得我们去深入研究。因此树莓叶片也具有很强的研究利用价值。1.2黄酮类化合物黄酮类化合物广泛存在于自然界中，是一类重要的天然有机化合物。一般黄酮类化合物的分布主要是植物界中，并且植物的果实、根、茎及叶中均有分布，它是植物在光合作用的过程中产生的，同时也是植物在长期的自然选择过程中产生的一类次生代谢产物，主要包括黄酮、黄酮醇、异黄酮醇、黄烷酮、异黄酮等。目前发现的黄酮类物质种类已达到5000多种，它不仅可以与糖结合形成苷，而且还可以以游离体的形式存在6。据报道，黄酮类化合物具有多种生物活性和药理作用。它不仅能够清除人体中的超氧离子自由基，阻碍癌细胞增殖，同时还能够强化免疫系统、改善血液循环、降低血压等 7，主要表现为抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌症、保护神经系统，抑制高血脂及预防心血管疾病等。除此之外，黄酮类化合物还可以延缓衰老、提高免疫力、降低化疗引起的毒副作用的功效8。因此黄酮类化合物在食品、保健品、医药以及化妆品的领域都有广阔的应用前景9。1.3黄酮类化合物的提取方法黄酮类化合物大多具有游离的酚羟基，溶于极性较大的有机溶剂。大多数是以黄酮苷的形式存在的，只有少数的是以黄酮苷元的形式存在。黄酮苷能够溶于水、含水乙醇、甲醇和乙酸乙酯等，但是不溶于非极性强的有机溶剂。因此黄酮类化合物的提取方法主要有热水提法、有机溶剂（乙醇）提取法、超声波辅助提取法等10。1.3.1 水浸提法水浸提法相对于其他提取方法是比较简便的一种提取方法，试剂无毒，提取成本低廉，颇受一些中小型的乡镇企业青睐。但是植物为了降低蒸腾作用，通常在其叶片表面会生成一层蜡被（单子叶植物蜡质层更多、更厚），这层蜡质化学成分是高级脂肪酸和高级一元醇的酯类化合物的高分子量的热塑性固体。正是由于这层蜡质的存在，影响了水浸提黄酮类化合物的含量，使提取得到的黄酮化合物含量较少，得率低。而且该法提取的黄酮提取物中杂质过多，尤其是强极性的水作溶剂会把蛋白质、淀粉、糖类等易用于水的成分浸提出来，使得提取液存放易腐败变质，后续的过滤、干燥等操作困难。因此，在进行水浸提之前，要先用石油醚或者苯对植物叶片进行预处理。水浸提法省时又省力，但是在提取出黄酮化合物的同时还有许多其他的杂质，例如鞣质、油脂以及叶绿素等，所以水浸提法并不是最理想的方法10。1.3.2 有机溶剂提取法有机溶剂提取法是提取黄酮类化合物中最常使用的一类方法，这里常用的有机溶剂主要有乙醇、乙醚、甲醇和乙酸乙酯等，而且在植物提取方面乙醇是最常用的有机溶剂。用有机溶剂进行提取时，主要用到的提取方式有浸泡提取、索氏抽提、回流提取、摇床振荡提取等几种，提取一定时间之后再进行抽滤和浓缩即可得黄酮化合物的的粗提液。甘秀海等利用醇提法得到火棘果中黄酮类化合物的最佳提取工艺是以70%乙醇为提取溶剂，料液比为1:20(g/ml)，提取温度70，提取时间4 h，最后得到的提取率为1.316%11。采用乙醇作为提取剂具有选择性简单，产品得率高等优点，但是采用乙醇来作为提取溶剂进行大规模提取黄酮类化合物进行工厂生产就需要较高的技术和成本，因此该应用在工业上食用将受到一定的限制。1.3.3 超声辅助提取法超声波辅助提取法相对于独自使用水或有机溶剂作为提取溶剂来提取黄酮类化合物具有操作方便，缩短提取时间等优点，是目前作为提取药用植物中的黄酮类化合物广泛采用的一种方法。超声波辅助提取法是应用超声波来强化提取植物中的有效成分，是一种物理破碎过程。浸提过程中没有涉及到化学反应，被浸提的生物活性物质在短时间内会保持不变，大大缩短了破碎的时间，并极大地提高了提取效率。超声波辅助提取的作用机制主要有机械粉碎机制、热学机制和空化作用12三方面。超声辅助提取时所用的超声提取仪产生超声波，超声波在样品介质中传播，从而引起介质质点间的相互作用。虽然这种相互作用对于改变质点的相对位置、使其具有的速度变化都不大，但却可以使其具有很快的加速度，从而使得整个提取过程更加容易，加快目标物质的提取；超声波在介质中传播时，震动能够产生热，使介质内部温度升高，从而加快提取速度和提高提取效率；至于空化反应则是由于大能量的超声波作用在液体里，使液体内部产生很大的压强，从而细化各种物质以及制造乳浊液，可以加速待测物中的有效成分进入溶剂，因此进一步提取便可以增加有效成分的提取率13,14,15。卞杰松利用超声波法测定马鞍草中黄酮类化合物总量时所得结果为8.36 mg/g，回收率为99.56%16。此外，醇提法与超声波提取法联合使用，效果也较理想。杨静等人利用响应面法确定超声波与醇提法相结合的方法得出树莓果实中黄酮类化合物的最佳为超声波功率360 w，乙醇浓度51.83%，料液比1:10（g/ml），超声时间42.30 min，其提取率为3.88%17。Guowen Zhang等人利用超声提取夏枯草中总黄酮的提取结果表明，采用超声波辅助提取黄酮得率最高可以得到3.62%，提取条件以41%（v/v）的乙醇浓度作为溶剂，料液比为1:30（g/ml），在79提取30.5 min 18。1.3.4 微波萃取法微波萃取法是利用微波设备加热提取的一种方法，具有操作简便、选择性高、加热效率高、穿透力强、副产物少和产率高等优点，近年来该法被广泛应用于天然产物的提取中。微波萃取法提取黄酮类化合物，主要是通过微波辐射浸没在待提取液中得到样品，使其超微结构特性遭到破坏，使物料中的有效成分能快速有效的溶解出来。由于所用的提取剂是微波容易穿透的，因而微波可透过提取剂使提取的化合物自由的流入未被加热的提取剂中。该法适用面广，能大大提高提取物中黄酮类化合物含量，同时大大缩短了提取时间19。张青峰等便是利用微波萃取-醇提取法提取蓝树莓叶和黄树莓叶总黄酮，得到最佳提取工艺条件为50%乙醇、微波7min、固液比1:25、中火微波提取率分别为8.26%、8.382%20。除了上述几种方法，还有成本较高，操作复杂，需要借助大型仪器的高速逆流色谱法、亚临界水提法等多种方法10。1.4 植物叶片提取中几种杂质的去除方法相对于植物果实的提取应用研究来说，有关植物叶片提取研究会更加困难繁杂，原因是植物的叶片在提取的过程中会产生一系列的杂质，这些杂质对后期的处理和测量工作造成很大的困扰和影响，所以在进行后续研究之前必须对植物叶片提取物进行除杂处理。然而每种杂质都有自己的性质，因此在在除去杂质的时候要针对性地采用不同的方法。下面是几种常见杂质极其去除的方法介绍。1.4.1叶绿素如果叶片提取研究不是研究叶绿素，那么首先要考虑叶绿素的去除，因为叶绿素对所研究物质的测量有很大影响。叶绿素不溶于水但可以溶于有机溶剂，因此在去除叶绿素的时候可以考虑采用有机溶剂来去除，不同的提取方式也可采用不同溶剂。叶绿素不容于水，在水浸提法中则用有机溶剂去除叶绿素，常用的有机溶剂有苯或氯仿，对提取物进行抽提即可；铅盐也可以除去叶绿素，但过程较复杂；如果使用乙醇作为提取剂的话，则可以直接将提取物浓缩后加水放置在冰箱来等待叶绿素沉淀出来，这个方法较方面简单，但是去除叶绿素很困难，往往还是需要加入氯仿离心以达到去除叶绿素的目的。1.4.2蜡质植物在适应大自然的环境时为了保护自己会用一些特殊的方式，叶片表层蜡质就是一种自我保护的体现。随着植物自身的生长，水分会出现供应不足的现象，为了防止干旱，植物在其叶片表面生成一层脂类化合物来减少叶片的蒸腾作用。同时也可以防止某些微生物的侵袭。但是这层脂类化合物对我们的提取研究造成了一定的困难，特别是在提取物过滤的时候，因此我们研究时必须清除它们以方便研究。一般是在提取研究之前将植物叶片进行预处理，即用苯或者石油醚浸泡然后抽提来达到除去蜡质、油脂等的目的，这个操作比较方便完成的。除了石油醚之外，还可以用乙酸乙酯进行预处理，或者将石油醚与乙酸乙酯进行比例融合，具体的配比需根据预处理的样品量来设定。蜡质的去除在植物提取研究中比较重要，尤其是用水作为提取溶剂的研究。1.4.3蛋白质关于植物叶片提取物中蛋白质的去除只有在用水作为提取溶剂时才会被用到，因为有机溶剂作为提取剂不会提出蛋白质。由于蛋白质具有特殊的性质，可以通过加热煮沸使其变性，然后将沉淀分离出来，这个方法最简便快速；当然，蛋白质的性质很多，除去的方法相对也很多，也可以用铅盐法让其变性析出以达到除去蛋白质的目的。因为植物提取大多采用有机溶剂进行，因此很少用到这些方法。1.4.4鞣质在植物提取的过程中，不管是用水作为提取剂还是乙醇作为提取剂，都会产生大量的鞣质。鞣质是一类多酚性化合物，它可以与蛋白质产生不溶于水的沉淀物质。这类化合物本身能够溶于水和乙醇，但是不溶于苯、氯仿等有机溶剂，因此再去除这类化合物时不能采用有机溶剂去除法。根据鞣质的酸碱性质可以采用氨水沉淀法和生物碱沉淀法，然后过滤除去沉淀物质。1.4.5其他杂质除了上述几种杂质外，还有几种杂质，例如无机盐、糖、淀粉等，这些杂质在用有机溶剂提取时都不会被提取出来，因此不用特意去除它们，而且它们本身的影响也不是很大。1.5黄酮化合物抗氧化活性测定方法目前，关于抗氧化活性测定的方法非常多。其中，抑制脂质的氧化降解、清除自由基、抑制促氧化剂和还原能力等几方面的研究方法21是体外非酶类方法中使用最多、最广泛的。清除自由基的方法是基础测定抗氧化能力的方法，因为它比较简便、快捷，所以是目前是使用最广泛、最多的方法。根据自由基的种类，这种方法又可以分为两大类22 。生物体中存在的自由基有：超氧自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)、过氧自由基(ROO-)、羟自由基(·OH)、单线态氧(1O2)和过氧化氮自由基(ONOO-)等。人工合成的自由基，目前，人工合成的自由基主要有ABTS和DPPH两种自由基，这两种自由基是测定抗氧化活性中使用最广泛的两种人工合成自由基。相对与ABTS法，DPPH自由基清除的方法则操作操作更加简单、快速以及高通量等优点23。体外进行抗氧化活性测定的两种自由基，其中DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine, 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基，它是氮族自由基，在它的氮氮连接键上含有不对称价的电子，所以它能稳定存在，在517 nm处有最大吸收值，并且能够与具有氢键供体的化合物发生电子转移的反应。在DPPH自由基清除实验中，受测物给出的氢原子与DPPH自由基发生结合，使反应溶液的吸光度改变，通过比较实验组与空白组溶液吸光度的变化来评价受测物的抗氧化活性25。此法最早是由Blois提出26，后经过大量实的验改进，现已成为评价天然产物抗氧化活性的一种较常用的方法27。1.6研究目的及意义现代的国内外食品加工业发展特别迅速，因此只有品质优良，天然营养丰富的商品才具有较大的发展空间。树莓作为一种风味独特、品质优良、营养价值高的小浆果，不仅在欧美等国家受到普遍欢迎，而且它已经逐渐发展成为第三代的新兴水果，具有很高的市场价值和经济效益。树莓除了果实中含有丰富的营养物质外，其叶片中也含有丰富的黄酮类化合物、维生素等物质，值得我们去深入地提取并进行研究。本文就是以水和乙醇作为提取剂，与超声波辅助提取方法相结合，比较不同提取剂、不同品种树莓叶片中粗黄酮类化合物的提取量；运用DPPH法体外测定提取的黄酮类化合物的抗氧化活性并进行比较。目的在于发掘黄酮类物质新的植物资源，为生产树莓副产物树莓叶片的加工品提供有效的参考。并且通过比较不同叶片中粗黄酮的含量以及其抗氧化活性，为以后有关树莓的全面应用研究提供有用的数据，并为树莓生理生化研究及药用资源开发利用提供理论依据和新资料。2 材料与方法2.1 实验材料树莓叶片：采自实验田种植的四种不同品种的树莓叶片，分别是智利黑、澳洲红、黄树莓、刚果红，晾干后用万能粉碎机将一定量的树莓叶片粉碎至粉末状存放于常温干燥处备用。2.2 主要药品及试剂表2.1 主要药品及试剂一览表药片或试剂名称纯度规格生产厂家芦丁标准品分析纯中国药品生物制品检定所盐酸分析纯天津市耀华化学试剂有限责任公司氢氧化钠分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司亚硝酸钠分析纯天津市申泰化学试剂有限公司硝酸铝分析纯天津市申泰化学试剂有限公司无水乙醇分析纯北京化工厂95%乙醇分析纯北京化工厂1,1-二苯基-2-三硝基苯肼分析纯上海伊卡生物技术有限公司石油醚分析纯西陇化工股份有限公司氯仿分析纯天津市申泰化学试剂有限公司乙酸乙酯分析纯西陇化工股份有限公司2.3主要仪器表2.2 主要仪器一览表名称规格型号产地/品牌精密电子天平YP202N上海天平仪器厂玻璃仪器气流烘干器KQ-12北京中兴伟业仪器有限公司循环水式真空泵SHZ-D()巩义市予华仪器有限责任公司数字恒温水浴锅HH-8金坛市杰瑞尔电器有限公司漩涡混合器XW-80A上海精科实业有限公司紫外可见分光光度计721E上海光谱仪器有限公司超声波提取仪JOYN-15AL上海乔跃电子有限公司2.4 实验方法2.4.1 芦丁标准曲线的绘制称取25 mg芦丁于250 ml容量瓶中，用60%(v/v)乙醇溶液稀释定容。分别准确移取定容好的溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml于10 ml容量瓶中，各加入60%(v/v)乙醇至6 ml，加10%亚硝酸钠溶液0.3 ml，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 ml摇匀，放置6 min，加8%氢氧化钠试液2 ml，最后用60%(v/v)乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以第1瓶为空白，在510 nm波长处测其吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。所测数据采用回归法计算得出标准曲线的回归方程为：A=13.344C+0.0011（R2=0.9996）由R2的值可以看出吸光度与芦丁浓度具有相当好的相关性，可以应用。式中：A为吸光度值；C为溶液浓度；R2为相关系数。2.4.2 总黄酮含量的测定方法将四种不同品种树莓叶片的粗黄酮提取液摇匀，分别取0.3ml至于10ml容量瓶中，加入5ml的60%乙醇，然后按照2.4.1中的硝酸铝显色法分别加入10%亚硝酸钠、10%硝酸铝和8%氢氧化钠，最后用60%乙醇定容至10ml，摇匀静置15min后测其吸光光度值。根据所绘制的标准曲线来计算粗提取液中的黄酮含量，计算总黄酮的提取率公式如下：总黄酮提取率=nCV/m×100%式中：n为提取液稀释倍数；C为提取液中总黄酮浓度，单位mg/ml；V为提取液体积，单位ml；m为树莓叶片粉末的质量，单位mg。2.4.3 树莓叶片粗黄酮提取液中杂质的处理研究树莓叶片表面含有一层蜡质，所以本实验在超声辅助提取之前要先对四种不同品种树莓叶片粉末样品进行预处理。按照1:10的料液比加入石油醚进行预处理，摇匀，在水浴锅是上蒸干后提取。叶片中还有大量的叶绿素等，因此在得到的粗提液中也还有大量的杂质，本实验对未进行杂质的处理和进行杂质处理的样品液关于黄酮提取量进行了研究。未进行氯仿处理的粗提液可以直接按照2.4.2中所示的硝酸铝显色法测量吸光度；用氯仿除去杂质则是要需将粗提液和氯仿按2:1的比例混合，然后震荡混合均匀后放置数分钟后取上层澄清样品进行吸光度测量。比较两次测的的吸光光度值的大小，然后来确定杂质对其的影响。2.4.4 树莓叶片总黄酮的提取工艺流程采集四种不同品种的树莓叶片晾干粉碎机粉碎样品预处理超声辅助提取减压过滤60%乙醇定容硝酸铝显色法测粗提液的OD值取5.00g的树莓叶片干粉于容器中，按1:10的料液比加入提取溶剂，50超声辅助提取30min后冷却抽滤，待测。2.4.5 提取溶剂的研究本实验分别用水和70%的乙醇作为提取溶剂来提取四种树莓叶片中的黄酮类化合物，然后根据2.4.3中树莓叶片总黄酮的提取工艺流程分别提取黄酮类化合物，并利用2.4.2中的总黄酮含量的测定方法来分别计算出水提取和70%的乙醇提取的总黄酮得率，做比较确定较适合的一种提取溶剂。三组平行试验。2.4.6 树莓叶片中黄酮类物质的抗氧化研究本研究采用的是DPPH法来评价黄酮粗提物的抗氧化活性。具体操作方法如下：准确秤取DPPH20mg，用95%的乙醇定容至250ml，配置成2×10-4mol/L的溶液，存放于棕色瓶中放入冰箱中备用。分别抽取四种不同品种树莓叶片黄酮粗提液10ml置于大试管中，然后加入5ml氯仿除去杂质，充分震荡混匀静置。待上层溶液澄清后，分别取1ml上层粗黄酮样品液和1mlDPPH溶液加到同一个具塞试管中，混匀，30min后在517nm处测量样品吸光度即A样品。同时测1mlDPPH溶液和1ml95%的乙醇混合后的吸光度A对照，以及1ml上层粗黄酮样品液和1ml 95%的乙醇溶剂混合后的吸光度A空白， 实验平行3次，以95%的乙醇作为空白计算清除率E（%）：其中A样品表示实验样品对DPPH作用的吸光度；A空白表示实验样品自身对吸光度的贡献；A对照表示DPPH本身在测定波长处的吸收3 结果与分析3.1不同提取溶剂下树莓叶片粗黄酮提取量的比较为了更明显的比较出用水和乙醇作为提取溶剂提取树莓叶片中黄酮类化合物提取量的不同，将实验所得数据绘制成图3.1。由图3.1可以看出，对于四种不同品种树莓叶片中粗黄酮类化合物的提取，用乙醇作为提取剂得到的提取量要远远高于水作为提取剂得到的提取量。对所得数据进行单因素方差分析，得出结论是：利用水作为提取剂的澳洲红品种与其他三个品种提取量上存在显著差异，刚果红、黄树莓和智利黑三个品种之间提取量差异并不明显；而用乙醇作为提取溶剂则四个品种分了三个梯度，澳洲红与其他三种提取量差异明显，刚果红与黄树莓差异不明显，与智利黑差异明显，黄树莓与智利黑差异不明显。相比较之下乙醇的实验则更加可靠。同时水作为提取剂会导致许多不溶的杂质产生尤其是脂质类物质，在减压过滤的时候会大大增加了黄酮粗提物的损失，使得最后的粗提液的黄酮类化合物减少；同时黄酮类化合物在水中的溶解度比在乙醇中的溶解度小。因此在此实验中将采用乙醇作为提取溶剂来超声辅助提取四种不同品种树莓叶片中的粗黄酮类化合物并对它们的总黄酮含量以及抗氧化活性进行比较。CbBCbBbAaa图3.1两种溶剂黄酮提取量比较3.2不同浓度乙醇溶剂下树莓叶片粗黄酮提取量的比较由于在进行树莓果实中黄酮类化合物的提取时，确定的最佳提取工艺中，选用的提取溶剂是50%的乙醇17，所以对这个方面进行简单的研究。根据实验整理数据得到如下数表：根据两个表格中的数据做出图3.3，从图中我们可以看出70%的乙醇作为提取溶剂，四个品种树莓叶片的提取量要比50%的乙醇作为提取溶剂的高，所以通过简单比较后还是选用70%的乙醇来作为叶片中黄酮类化合物的提取溶剂更加合适。对所测得的数据进行单因素方差分析可以看出50%乙醇作为提取剂，四个品种的提取量之间都存在这显著差异，数据可靠；70%的乙醇作为提取剂澳洲红与刚果红之间提取量差异不显著，与黄树莓和智利黑之间差异显著，刚果红也是与后两个品种之间提取量差异显著，而黄树莓的提取量与智利黑之间差异不显著，说明虽然整体变现出显著的差异趋势，但是还是存在误差，值得深入研究。但是70%的乙醇作为提取剂所得的提取量还是明显高于50%的乙醇，因此结论不变。aCcCbABaaA图3.2不同乙醇溶剂对树莓叶片黄酮提取量的影响3.3氯仿对树莓叶片中粗黄酮提取量测量的影响研究为了更明显的看出氯仿对四种不同品种树莓叶片中黄酮类化合物提取量测量的影响，将根据实验测的数据绘制成图3.1。由图3.1可以看出将提取得到的粗提液分别经过氯仿处理后测得的黄酮提取量比未用氯仿处理的黄酮提取量高，同时进行单因素方差分析，得出未用氯仿处理的品种之间提取量差异更明显，而用氯仿处理则表现不明显，但仍存在差异。但总体结果是氯仿处理了之后，提取量增大。这是因为杂质大多能够溶于氯仿，而黄酮类化合物不溶于氯仿，这样才能清晰的分离出来，上层澄清溶液即还有黄酮类化合物的粗提液，然后取上层澄清液进行吸光度的测量，并计算出各自的提取量。通过比较说明杂质等对于吸光度的测量有一定的影响，所以在经过提取工艺得到的粗黄酮测吸光度之前，要用氯仿除去杂质会取得更好的结果，为后续的黄酮含量比较以及抗氧化活性的研究提供更好的数据支持。同时我们将叶片与果实的粗黄酮提取量做了比较，从图3.3中我们可以看出，果实中的粗黄酮提取量要比四个品种树莓叶片粗黄酮提取量最高的澳洲红还高出许多，通过单因素方差分析，果实中粗黄酮提取量与树莓叶片的粗黄酮提取量之间存在显著差异。同时氯仿对于果实中黄酮的提取量也有一定的影响。这说明树莓果实中的黄酮类化合物相对于树莓叶片更易于提取研究，另外也说明叶片中确实存在多种杂质干扰黄酮类化合物的提取，需要我们进一步去研究探索，从而来提高树莓叶片中粗黄酮物质的提取量。这个结果与同组张田莉关于树莓叶片中SOD含量的研究有些差异，树莓叶片中提取到的SOD含量比果实中的低。说明对于黄酮类化合物在树莓体系中还是果实中提取率更好SOD的研究则是叶片更好。但是树莓的品种较多，可以选取多种叶片研究，范围更广。B dcdbcbDDCAaa图3.3氯仿处理与未处理后黄酮提取量比较3.4 不同品种树莓叶片粗黄酮物质提取量得比较根据3.1和3.2中整理的数据做出图3.4，从图中可以明显看出澳洲红、刚果红、黄树莓和智利黑四种树莓叶片在相同的提取条件以及测量条件下所得到的提取量的差异，在不同的处理条件下的提取量差异同时可以明显地看出这四个不同品种的树莓叶片中粗黄酮物质的提取量趋势，四个不同品种提取得到的黄酮含量趋势是澳洲红>刚果红>黄树莓>智利黑。因此用乙醇作为提取溶剂超声辅助提取树莓叶片中的粗黄酮类物质的时候，测得的澳洲红中的粗黄酮含量最高，刚果红、黄树莓、智利黑依次次之。同时，我们还可以看出，不管哪种方式处理，这四种叶片中粗黄酮提取量最高的一直都是澳洲红这个品种，原因是澳洲红本身是匍匐生长的，它自身不需要太多的蜡质来降低自己的蒸腾作用来防止缺水，所以其表面含有的蜡质要比其他品种叶片的蜡质低，因此粗黄酮提取量较高。CCBAcbcbaCBCBAbbba图3.4四种树莓叶片黄酮提取量趋势3.5清除DPPH自由基活性评价研究二苯代苦味酰基自由基(DPPH)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若提取物能清除它，则表示该提取物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。根据实验测得的数据得到如下的数表:表3.1四个不同品种树莓叶片中黄酮的DPPH自由基清除率品种平均清除率（%）澳洲红86.04±1.834a刚果红53.51±0.984b黄树莓52.71±0.614b智利黑45.75±0.965c澳洲红、刚果红、黄树莓和智利黑这四种不同品种的树莓叶片经过相同的提取条件后各自的黄酮类化合物含量不同，因此对与DPPH自由基的清除率也会有所区别，具体的不同可以通过表3.1看出。澳洲红叶片提取的黄酮类化合物对于DPPH自由基的清除率最高，达到了86.04%；其余三个品种树莓叶片中的粗黄酮物质对与DPPH自由基的清除率虽然偏低，但都超过了40%；通过单因素方差分析，得到三个梯度，澳洲红叶片提取的粗黄酮化合物的抗氧化活性与其他三个品种之间差异显著，而刚果红和黄树莓之间差异不太显著，智利黑与其他三个品种差异显著，但是总体还是有一定差异，还需要继续研究。4 讨论4.1 结果经过实验研究，通过对比水与乙醇作为提取剂时澳洲红、刚果红、黄树莓和智利黑四种叶片中粗黄酮物质的提取率确定了乙醇溶剂更适合；通过对比50%的乙醇提取剂和70%的乙醇提取剂对提取率的影响，确定70%的乙醇更适合树莓叶片中粗黄酮物质的提取；通过氯仿对树莓叶片的粗黄酮物质提取率的研究，确定要用氯仿对粗提物进行除去杂质的处理以减少误差，使数据更加准确。最后得出的四种不同品种叶片中粗黄酮化合物含量存在差异，澳洲红是最优的一种。抗氧化活性研究中仍是澳洲红最优。4.2树莓叶片总黄酮含量测定方法的研究树莓中总黄酮含量测定方法有：紫外可见分光光度法和高效液相色谱法（HPLC法）两种。这两种方法中的HPLC法是一种稳定的、准确的测定方法，能测定黄酮类化合物中各种主要成分的含量。由于本试验的目的是提取四种树莓叶片中的总黄酮物质，然后测定所提粗黄酮物质的总含量并进行比较，所以没有利用HPLC法对各黄酮物质的组成和含量进行测定。本试验以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定四种树莓叶片总黄酮的含量并进行了比较。在进行比色实验的过程中如果有红色絮状沉淀出现，原因可能是芦丁黄酮的酚羟基与Al3+形成的红色络合物。所以实验过程中要注意将氯仿处理后避光静置，否则在测定过程中，溶液的吸光度会降低，对实验结果造成极大影响。另外测吸光度之前要充分摇匀，特别是澳洲红这个品种，很容易产生絮状物，摇晃后可以继续测量。4.3树莓叶片提取黄酮去除杂质的研究树莓叶片表面含有一层蜡质，可以用石油醚或者乙酸乙酯进行预处理。本实验采用的是石油醚进行预处理，因为石油醚具有很强的挥发性，因此按照料液比1:10来添加石油醚后要进行水浴蒸干，在蒸干的时候要注意定时搅拌，避免在蒸干的后期样品由于石油醚的减少而迸溅出来造成的实验误差。 树莓叶片中含有大量的叶绿素、糖类等杂质，可用苯或氯仿除去。由于苯的毒性更大，所以本实验选用氯仿对树莓叶片的黄酮粗提液进行处理除去杂质。因为氯仿也是具有毒性的，所以在进行氯仿除去杂质的操作时要在通风的地方。加入氯仿的粗提液要避光放置待测。4.4树莓叶片总黄酮提取剂的研究关于提取黄酮类化合物的溶剂有许多种，除了水之外，大多是有机溶剂。本实验主要是比较水和乙醇作为提取溶剂时，树莓叶片的粗黄酮物质的提取率之间的差异。在这部分试验的过程中，除了提取溶剂的不同外，其他所有的条件都要相同。因为水提取的过程中会产生许多不溶于水的脂类物质，所以在抽滤的时候会很困难，所以在试验的时候要有足够的耐心，可以多换几次滤纸来达到快速抽滤的目的。4.5树莓叶片总黄酮提取过程的研究本实验采用超声波辅助提取，进一步缩短了分离提取的时间，效果良好。提取实验结束后，将浸提液抽滤的过程中，要注意过滤的滤纸要事先用蒸馏水浸湿，以免留有空隙，影响过滤效果。为得到清澈滤液可多加几层滤纸或者进行两次抽滤。4.6树莓叶片总黄酮抗氧化性的研究DPPH阳离子自由基清除实验所用DPPH储备液需现用现配，避光保存。实验过程中，由于整个过程需要避光反应，所以光是影响实验结果的一个重要因素，同时反应时间也是影响清除实验的因素。本实验验证了从四种品种树莓叶片中提取的黄酮类物质对于DPPH自由基的清除率趋势与四种品种所提取的粗黄酮含量是相同的，实验结果还表明了所得的粗黄酮浓度与DPPH自由基清除率的关系。由于尚未进行进一步的体内实验，因此想要从理论上支持对于树莓叶片深层次的开发利用还需要更为细致深入的研究。5 结论（1） 本文对四种品种树莓叶片中黄酮类物质进行了提取，并进行了粗提物含量的比较和抗氧化活性比较。澳洲红、刚果红、黄树莓和智利黑四种树莓叶片中粗黄酮物质的提取量差异趋势与它们中粗黄酮物质对DPPH自由基的清除率差异趋势相同。澳洲红这个品种相对于其余四个品种超声辅助提取得到的粗黄酮含量最高，同时它的粗黄酮物质清除DPPH自由基的能力也最强。所以要做大量树莓叶片中黄酮物质的提取纯化研究，可以选择澳洲红这个品种。（2） 本文对于树莓叶片中黄酮物质的提取溶剂进行了