根癌农杆菌介导转化AtNHX1基因甘蓝型油菜的研究毕业论文.doc

根癌农杆菌介导转化AtNHX1基因甘蓝型油菜的研究Research of AtNHX1 Gene transformation in Brassica napus by Agrobacterium tumefaciens 所在系（院）：生物化工与环境工程学院学 生 姓 名： 指 导 教 师： 研究起止日期：二一一年三月至二一二年五月二一二年五月 根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化甘蓝型油菜的研究 摘要：以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体，通过根癌农杆菌介导法，将Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1基因转入甘蓝型油菜中。结果表明，外植体经浓度OD600为0.4的菌液中侵染8-10min，卡那抗性绿苗率达3.75，经过对抗性植株的PCR检测证明外源基因已经整合到油菜基因组中，为提高甘蓝型油菜的耐盐能力提供了新的途径。关键词：根癌农杆菌；带柄子叶；卡那霉素；转基因甘蓝型油菜；Research of AtNHX1 Gene transformation in Brassica napus by Agrobacterium tumefaciens Abstract： Chosen cotyledon petiole as the recipient for transformation. AtNHX1 gene was transferred into Brassica napus by Agrobacterium tumefaciens transferring system. The results showed that the best physiological and transforming condition was in OD600 0.4 liquid bacterium for 8-10 min, 3.75 kan-resistant green seedings were obtained. It was proved that NHX gene was inserted into the genome of oilseed by the methods of PCR.It could provide a new way to improve the salt tolerance about Brassica napus. Keywords：Agrobacterium tumefaciens;Cotyledons with petiole; Kanamycn；Transgenic Brassica napus; 目录引 言41 实验材料51.1 植物材料51.2 菌种及质粒51.3 抗生素51.4 培养基的种类51.4.1植物培养基51.4.2细菌培养基51.5 农杆菌菌液的制备62 实验方法62.1 无菌苗的培养62.2 油菜基因型的筛选62.1.2预培养62.1.3分化培养62.1.4继代培养62.1.5生根培养62.1.6再生苗的移出62.3 植物表达载体PX6- AtNHX1转化甘蓝型油菜62.3.1预培养62.3.2外植体的侵染72.3.3共培养72.3.4筛选培养72.3.5继代培养72.3.6抗性苗的获得72.3.7生根培养72.4 转基因植株的检测72.4.1甘蓝型油菜DNA的提取72.4.2PCR基因扩增82.4.3基因条带的检测93 实验结果93.1 不同基因型对甘蓝型油菜外植体分化率的影响93.2 芽苗的生根培养103.3 再生苗的移出113.4 植物表达载体PX6- AtNHX1转化得到的油菜123.5 芽增殖的培养143.6 转基因甘蓝型油菜的检测结果144 讨论15参考文献：17致 谢18引 言 土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性问题，土壤盐渍化严重影响着农业的产量，尤其是使灌溉农业作物减产。同时盐分过高还可使土壤盐渍化，限制土壤的利用。目前，世界上大约20%的耕种土地和接近一半的灌溉土地都遭到了盐胁迫的危害1。高盐环境是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对盐逆境胁迫的耐(抗) 性机理，从而通过基因工程手段改良植物耐(抗) 盐性。随着分子遗传学和植物转基因技术的快速发展，采用生物技术提高作物的耐盐性，使作物在盐胁迫环境中能够正常生长并提高产量，正受到越来越多的关注，并取得了一定的成果。提高作物耐盐性的方法有很多，如改造生物合成途径，在作物体内表达耐盐相关基因或改变基因对胁迫的反应特性等2-3。NHX（Na+/H+ antiporter）为液泡膜中的一种Na+/H+反向运输体4，可促进离子在液泡中的分室效应，同时还可减少细胞毒性。在转基因拟南芥和转基因西红柿中过量表达AtNHX1，可在液泡膜中积累大量的运输体，并且极大地提高了它们的耐盐性5,6。这些结果显示出AtNHX 家族在钠离子的液泡分室效应中起着关键的作用。油菜是我国主要的油料作物之一，随着农业生物技术的发展，人们越来越重视基因工程技术改良油菜品种，成功的基因转化主要依赖于良好的植物受体系统的建立。从整体上看，油菜遗传转化的效率均不是太高，这主要与油菜低频率的再生有关。因此，建立高效的再生体系是油菜遗传转化研究的焦点之一。近几年的研究表明，油菜再生频率与外植体类型、基因型、生长调节剂、外植体生理状态以及AgN03有关7-9，通常的激素组合为生长素类与6-BA组合，未见使用苯基脲类细胞分裂素噻苯隆(TDZ)的研究报道。自1974年KarthaL首次从甘蓝型油菜的茎切片诱导出小植株以来，国内外对甘蓝型油菜的体细胞和组织培养技术相继进行了研究。在再生体系的建立中，已从甘蓝型油菜的不同外植体如幼茎、花茎等诱导产生了植株10-11，但这些外植体的再生途径多具有周期长、再生率低，而且种质易产生变异的特点。在油菜的离体培养试验中发现，子叶柄、下胚轴就具备再生周期短、再生率高、培养程序简单等特点，此外，油菜子叶、下胚轴易被农杆菌感染和转化，因此一般作为再生和转化体系的首选外植体。pX6-GFP是Zuo等对Cre/lox系统进行改进选择标记载体，并应用于模式植物拟南芥，成功地获得了去除卡那霉素抗性标志，只表达目的基因GFP的拟南芥转基因植株10。PX6-GFP载体与其他载体有所不同：此载体在转化过程中以雌二醇诱导，可以剔除插入的选择标记基因12。目前，几乎所有的植物遗传转化都要通过使用选择标记基因，如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子。 虽然没有研究结果表明选择标记基因影响人类健康或环境安全，但近年来也引发了人们对转基因产品安全性的担心。为了消除人们对转基因食品的安全性顾虑，无选择标记的转基因植物是一种比较好的选择。本试验，采用根癌农杆菌介导法，应用cre/lox植物表达载体，研究了Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1基因对甘蓝型油菜进行转化。1 实验材料1.1 植物材料油菜种子（N336,N370,N206,N115），在冰箱-20中保存。1.2 菌种及质粒农杆菌菌株为PBI 121，质粒为PX6- AtNHX1 。1.3 抗生素卡那霉素（Kana），氨苄青霉素（Ap），利福平（Rif）、壮观霉素（Spel）。1.4 培养基的种类1.4.1植物培养基预培养基：MS+1.0 mg/l 2,4-D共培养基：MS+2mg/l 6-BA+0.2 mg/l NAA 分化培养基：MS+3mg/l 6-BA+0.05mg/l NAA+1.0mg/l TDZ 筛选培养基：MS+3mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+10mg/l KANA+500mg/l AmP增殖培养基：MS+1.0 mg/l BA+0.1mg/l NAA继代培养基：MS+0.02mg/lNAA+5mg/L6-BA生根培养基：MS+0.05mg/lNAA注： 以上培养基均附含30g/L蔗糖,4.5g/L琼脂,pH 5.8,若培养基中需加抗生素的，要在培养基冷却到60后再加入。且各培养基中所用的Ap,kana等均采用过滤灭菌,其它则在121下进行高温高压灭菌。1.4.2细菌培养基 根癌农杆菌培养基为LB 液体培养基(10 g/L 胰化蛋白胨, 5 g/L 酵母提取物,10 g/L 氯化钠, PH 7.0)，在121下进行高温高压灭菌。1.5 农杆菌菌液的制备从划线培养平板中挑取单菌落，制成可转化的菌液，吸取100ul菌液于50ml LB中，28，150rpm 震荡培养2天（即菌种的活化）。活化之后，从活化的菌液中吸取100ul菌液于另一瓶LB中，28，180rpm震荡培养6h至OD600值到0.30.4（细菌进入对数生长期），待用。为防止有杂菌产生，以上LB培养基中均要加入抗生素50mg/l Rif 和50mg/l Spe。在超净工作台上进行，待灭菌过的LB培养基低于60，用已灭菌过的枪头将抗生素加入到培养基中。2 实验方法2.1 无菌苗的培养1.将超净工作台的紫外灯打开，紫外杀菌20min。2.种子的灭菌：选取籽粒饱满、大小均一的油菜种子, 用75%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞处理5-8min，无菌水反复冲洗8-10 遍。3.将已灭菌的种子，播种于MS 培养基上，置25、16h 光照/8h 黑暗的光照周期下培养一个星期左右,得到无菌苗。2.2 油菜基因型的筛选2.1.2预培养取无菌苗放于无菌纸上，取其带柄子叶和下胚轴，以每瓶8-10的数目分别将带柄子叶和下胚轴接入到预培养基中，培养2天。2.1.3分化培养将培养了两天的外植体转入到分化培养基中培养。2.1.4继代培养待分化培养基中的外植体有再生芽长出，将再生芽转到继代培养基中进行培养（图1）。2.1.5生根培养待再生芽长有7-10cm时，转到生根培养基中，直至有根长出（图2和图3）。2.1.6再生苗的移出将长出根的再生苗移到花盆中长成大的植株（图4）。2.3 植物表达载体PX6- AtNHX1转化甘蓝型油菜2.3.1预培养取一周龄的无菌苗，切取其带柄子叶接种于含1.0mg/L 2,4-D 的MS0 预培养基中, 预培养3d。叶柄切口朝下，外植体切口处刚刚开始膨大时即可用于侵染。2.3.2外植体的侵染将预培养的带柄子叶浸入到装有OD600=0.4左右的锥形瓶中摇晃8-10min，取出放入垫有数层无菌滤纸的培养皿中，以吸去子叶表面多余的菌液并在超净工作台上充分吹干。在预培养基上也垫上一层滤纸，将侵染好的叶片放回预培养基上进行共培养10。2.3.3共培养 将经过预培养之后的外植体接入到共培养基中，以第一片叶片上肉眼看出菌体时所需时间（d或h）作为最佳共培养时间。2.3.4筛选培养 将共培养后的外植体转移到附加卡那霉素10mg/L，氨苄青霉素500mg/L的培养基上筛选培养，(25±1)，16h光周期，大约4-5周后分化出芽，培养过程中注意观察生长状况。2.3.5继代培养选择有绿芽等分化出来的外植体转入到继代培养基中继代培养，继代要进行4次，培养基分别为：继代培养基（JD）+ 10mg/l KANA+500mg/l AmP (继代2-3周)继代培养基（JD）+250mg/l AmP（继代2-3周，进行两次）继代培养基（JD）2.3.6抗性苗的获得约四周以后即可看到抗性苗（图5）、假阳性的白化苗（图6）和未转基因的苗（图7）。2.3.7生根培养将长势良好的抗性苗转至生根培养基中培养，待生根长苗后，保存此苗，即为对卡拉霉素有抗性的苗。2.4 转基因植株的检测2.4.1甘蓝型油菜DNA的提取 1. 取抗性苗植株组织（新鲜组织100mg或干重组织20mg），在研钵中加入液氮充分研磨成细分粉。 2. 转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加入400ul缓冲液AP1和4ulRNaseA(10mg/ml),漩涡振荡，充分混匀帮助裂解。 如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔10秒的步骤帮助裂解。大多数情况下不需离心去除未完全裂解的组织，因为后面有一个离心去除的步骤。 3. 65水浴10分钟，在水浴过程中颠倒离心管2-3次，混合样品。 4. 加入130ul缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5分钟，14000rpm离心5-10分钟，小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。5.计算上清量，加入1.5倍体积的AP3/E（请先检查是否已经加入无水乙醇！），立即吹打混匀。 加入AP3/E可能会出现沉淀，但不影响DNA的提取。注意将AP3/E直接加入到上清并立即混匀。 6.将上一步所有混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rmp离心30-60秒，倒掉收集管中的废液（先加入650ul）离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。7.加入700ul漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000rmp离心30秒，弃掉废液。8.加入500ul漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃掉废液。 9.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。10取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部分加100ul洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液可事先在60-70水浴中预热），室温放置3-5分钟，12000rmp离心1分钟。将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rmp离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度少，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50ul，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。11.DNA可以存放在2-8，如果要长时间存放，可以放置在-20.2.4.2 PCR基因扩增2.4.2.1 取1ml的离心管进行灭菌，为缓冲体系的配置做准备。2.4.2.2 PCR反应体系 10×buffer 2ul Mgcl2 1.6ul dNTP 0.4ulRedTag 1.5ul NP-5 1ul NP-3 1ul ddH2O 11.7 ul 样品 DNA 0.8ul 注：每管共20ulPCR反应体系 Template 1ug NP-3 1ul NP-5 1ul 2×Master Mix 12.5ul ddH2O 补充至25ul 注：每管共25ul2.4.2.3 PCR反应程序 将盛有已配好的缓冲体系的1ml离心管放入PCR仪中，并设定扩增程序。扩增程序如下： 95 3 min30次循环94 30 s 55 30s 72 1min 72 5min2.4.3基因条带的检测2.4.3.1 琼脂糖凝胶的制备1.称琼脂糖0.2g，放于锥形瓶中，用20mlTAE混匀并加热至琼脂糖全溶，取下锥形瓶放置实验台上，冷至30-40。取EB0.3ul加入混匀，并倒入插有梳子的制胶板，待凝！2.琼脂糖凝胶凝好后，拔出梳子，将胶和制胶板一起取出，放入电泳槽中病固定好。3.向电泳槽中加入缓冲液（TAE），直至缓冲液淹没琼脂糖凝胶的打样孔。d.向打样孔中加入样品。在1号打样孔中打入5ul Market（作为阴性对照），在2-7号打样孔中加入8ul已扩增的不同样品基因，在8号打样孔中加入8ul已带有目的基因的样品基因作为阳性对照。4.打开电泳仪的电源，调电压到65V，电泳30-40分钟。2.4.3.2 凝胶电泳成像系统的检测取出电泳后的胶片，放入凝胶电泳成像系统中检测，并将结果拍摄下来（图8）3 实验结果3.1 不同基因型对甘蓝型油菜外植体分化率的影响 下表比较了不同基因型甘蓝型油菜分别以带柄子叶与下胚轴作为外植体培养对于分化率的影响，不同基因型油菜的带柄子叶接种了40，下胚轴接种了50个，经预培养两天后接种到分化培养基中，分化培养两周后，比较各基因型两种外植体的分化率。由表可知N336，N370，N115，N206带柄子叶的分化率明显高于下胚轴的分化率；N 206的外植体培养所得到的再生苗数目都比其他基因型油菜的再生率高。通过表分析比较，选用甘蓝型油菜N206的带柄子叶作为本实验的转化受体最为适宜。表1不同基因型对油菜外植体分化的影响Table 1 Effect of genetype on inoculated explants differentiation of Brassica napus油菜的名称接种带柄子叶的数目（个）接种下胚轴的数目（个）带柄子叶培养得到的再生苗的数目（2周）下胚轴培养得到的再生苗的数目（2周）带柄子叶培养得到的再生苗的再生率（）下胚轴培养得到的再生苗的再生率（）N336N370N115N20640404040505050509112232013422.527.55580026待添加的隐藏文字内容18 3.2 芽苗的生根培养分化出的正常芽苗在继代培养基（MS+0.02mg/lNAA+5mg/L6-BA）中长到2 cm左右，切下幼芽到生根培养基（MS+0.05mg/lNAA）上培养，15 d左右开始生根，在生根培养基上，80以上的芽苗能够生根，并正常生长，不同处理之间无明显差异。图1 继代培养基中的幼芽Fig. 1 Bud in subculture culture图2 培养瓶中的油菜N206植株Fig.2 The plants of N206 in culture flasks图3 生根培养基中油菜N206的根Fig. 3 The root of N206 in root medium3.3 再生苗的移出 将生根的幼苗从生根培养基移出后，栽在花盆中，培养一个月左右后得到具有适应天然环境生长的幼苗，见图4。图4 移出的N206再生苗Fig. 4 The regenerated plants out of the medium 3.4 植物表达载体PX6- AtNHX1转化得到的油菜表2 N206经农杆菌感染得到抗性苗的情况Table 2 The result of resistant case about N206 infected by Agrobacterium油菜的名称The genetype of Brassica napus外植体的数目（个）The number of explants假阳性白化苗的数目（个）The number of Albinism sprout未转基因苗（个）The number of Wild type产生卡那霉素抗性芽（个）The number of transgenic seedlings转化率Conversion rate油菜N206320642123.75%表2中甘蓝型油菜N206带柄子叶经植物载体PX6-GFP-ThNHX1转化得到的抗性苗经四次继代培养后，分化出芽，分别得到12株卡那霉素抗性苗 （图5），6株假阳性的白化苗（图6）及42株未转基因的苗（图7）。卡那霉素抗性苗叶茎都呈绿色，这种苗被转入的抗kana基因表达使其对培养基中的kana具有抗性从而能在筛选培养基中正常生长；假阳性的白化苗，这种苗未转进基因但因为本身抵抗力强在起初是绿色的，但后经继代培养后逐渐变白；未转基因苗不能在含有kana的培养基上正常生长存活所以一直都呈白色。比较这三种苗，再结合接种的总外植体数，可知：卡那霉素抗性苗的转化率为3.75%。图5卡那霉素抗性苗 Fig.5 Kanamycin resistance in Brassica napus图6 白化苗Fig.6 Albinism sprout 图7 未转基因苗 Fig. 7 Wild type on kanamycin medium3.5 芽增殖的培养由于转化得到的抗性苗很少，所以需要进行芽的增殖，以免苗全部被染菌而导致实验失败。抗性苗在芽增殖培养基中培养3周后，可长出多个小芽，再将小芽再次接种到增殖培养基中进行增殖，以便实验需要（芽增殖培养基：MS+1.0 mg/l BA+0.1mg/l NAA）。图8 芽增殖Fig.8 Bud proliferation3.6 转基因甘蓝型油菜的检测结果设计一对特异性引物：NPT-5: 5-TGACCGCTTCCTCGTGCTTT-3， NPT-3： 5-CCTAGTTTGCGCGCTATATT-3，挑选最有代表性的6棵卡那霉素抗性植株和对照植株叶片提取DNA， 进行PCR扩增，图9为琼脂糖凝胶电泳结果，从6株转基因油菜植株DNA中均获得6条长度为688 bp的扩增片段，而阴性对照则无条带，表明目的基因已经转入甘蓝型油菜植株中。 图9 转基因甘蓝型油菜的检测 Fig.9 The result of PCR of transgenic Brassica napusM：DNA分子量标准； 1号: 阴性对照组（从未转基因的油菜N206中提取的DNA）； 2-7号均为实验的检测对象（相应的卡那霉素抗性植株DNA）；8号：阳性对照（带有 AtNHX1基因的质粒）4 讨论在农杆菌介导的转基因实验中首先遇到的比较难解决的就是伴随整个实验过程中的杂菌污染，还有农杆菌浸染植株后农杆菌污染的问题。实验初期因为一些不成熟不规范的实验操作，杂菌污染非常严重，在寻找其中可能的多种主要、次要原因并尽量把染菌率降低，耗费了相当长的时间。对于实验所用的器皿，必须经过严格的121高温高压灭菌；实验材料的灭菌处理上，比如种子灭菌时选用合适的置物器皿，既要方便操作，又要最大程度地防止杂菌污染，适当延长升汞灭菌的时间；保持实验室无菌超净工作台干净整洁；严格的规范操作等等，杂菌污染的问题是在整个实验过程中都需要小心注意的，这就需要求实验者具有严谨仔细的实验态度。在子叶侵染的过程中会出现农杆菌过度繁殖造成抑菌困难或因农杆菌毒性过强而使外植体褐化死亡的状况，提高抗生素浓度会抑制转基因植株的生长。因此在本实验中对浸染后如何用简单有效的方法来抑制农杆菌的生长进行了摸索。在不增加抗生素浓度的情况下，降低浸染菌液的浓度，延长浸染时间到10min，并且保持培养基的干燥，浸染完成后充分吸干外植体上残留的菌液，然后在超净工作台中吹干，这样就比较有效地解决了农杆菌污染的问题。2,4D对芽器官具有很强的诱导作用7,12,14，在含10mgL 2,4-D的MS培养基上短时间地预培养，可明显地提高甘蓝型油菜下胚轴的再生频率，并且使外植体处于最佳的生理和转化状态。据Cardoza和Stewart14的研究，外植体在含有2,4-D的培养基中合成了一种含酚的化合物，它可以激活农杆菌的vir区，利于外源基因的转移和整合，可大大提高转化效率。除此之外根据新疆大学郝东风、兰海燕、陈邦党、张富春等人的实验结果表明: 带柄子叶在含有2,4-D 的培养基上经过短时间的预培养，再作侵染处理，能有效地提高卡那抗性绿苗的转化率。植物表达载体PX6- AtNHX1转化油菜的过程中，共培养的目的是所使外植体细胞在分裂、增长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，从而使细菌有足够多的数量、时间附着外植体，并将T-DNA整合进外植体细胞，完成整个转化过程。经农杆菌感染后的外植体要先放在滤纸上沥一下，以免使外植体沾有太多菌液影响实验效果。共培养之后将外植体接入到筛选培养基（MS+3mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+10mg/l KANA+500mg/l AmP）7，筛选培养基中的KANA用于筛选卡那霉素抗性苗，Amp则主要抑制农杆菌生长。经筛选培养基培养，一个多月出现再生苗，将卡那霉素抗性苗接种到继代培养基中进行继代培养，继代培养基中需加入卡那霉素和氨苄，在抑制农杆菌的生长的同时，进一步检测再生芽是否真的是卡那霉素抗性苗，随着继代次数的增加Kana和Amp使用量逐次减少。随着含有卡那霉素的继代培养基的继代培养，一些不具有卡那霉素抗性的苗会逐渐变白。在凝胶电泳的实验结果中，通过图10可以看出实验组2-7号在688bp均有明弱不同的条带，从而可以确定2-7号相应的植株已经转入耐盐基因。从图中我们亦可看出4、5、6、7号的条带比2、3号的条带弱，很有可能是因为在植株的DNA提取过程中，取的抗性苗植株组织的量太少（新鲜组织未达到100mg）。目前，植物基因转化主要使用农杆菌介导法，应用农杆菌介导法需要借助于抗生素等标记基因淘汰非目标植株，常用的抗生素标记基因有抗四环素基因、抗卡那霉素基因、抗潮霉素基因、抗新霉素基因、抗氯霉素基因等，这些标记基因不仅为多个基因的转移设置了障碍，近年来也引发了人们对转基因产品安全性的担心，虽然目前还未有研究结果表明这种担心是否必要。为了消除人们对转基因食品的安全性顾虑，无选择标记的转基因植物是一种比较好的选择。PX6-GFP载体与其他载体有所不同：此载体在转化过程中以雌二醇诱导，可以剔除插入的选择标记基因，本实验过程中，我们将AtNHXl基因插入到植物表达载体PX6-GFP构建了AtNHXl基因的表达载体12，并将其导入甘蓝型油菜中，得到卡那霉素抗性苗，现在我们正在对其进行雌二醇激素的诱导处理，期望得到去除卡那霉素抗性基因的甘蓝型油菜，然后对其幼苗进行盐胁迫处理，用不同浓度的含盐培养基对其进行培养，最后筛选出生长最为良好的油菜苗，此为甘蓝型油菜耐盐性检测的最终目标。若实验成功，在接下来的时间里我们仍继续用雌二醇激素诱导，以盼能得到较多去除卡那霉素抗性基因的甘蓝型油菜苗，为接下来的耐盐性研究以及甘蓝型油菜能更好地适应盐碱地生长做出更大的成绩。参考文献：1 Rhoades JD, Loveday J. Salinity in irrigated agriculture. In:Steward BA, Niesen DR (eds).American Society of Civil Engineers, Irrigation of Agricultural CropsM. American Society of Agronomist, 1990,1089-1142.2 张新春,庄炳昌,李自超.植物耐盐性研究进展J.玉米科学,2002,10(1):50-56.3 梁慧敏,夏阳,王太明.植物抗寒冻、抗旱、耐盐基因工程研究进展J.草业学报,2003,12(3):1-7.4Zhu J K. Plant salt tolerance J.Trends in Plant Science ,2001,6(2) :66-71.5石淑稳, 周永明. 甘蓝型油菜下胚轴培养和高频率芽再生技术的研究J.中国油料作物学报, 1998, 20( 2) : 1-6.6 Cardoza V, Stewart CN. Increased Agrobacterium- mediated transformation and rooting efficiencies in canola (Brassica napus L.) from hypocotyl segment explantsJ. Plant Cell, 2003, 21: 599-604.7刘晓庆,沈源,蔡小宁,浦惠明等.甘蓝型油菜下胚轴离体培养再生植株研究J.安徽农业科学,2008,36(31):1354713548,13582.8 McKeronta Yangsf.Biosythesis and merabolish of ethylene.In:Davies P J ed.Plant Hormones and Their Role in Plant Hormones and Their Role in Plant Growth and DevelopmentJ.Dodrecht,the Netherlands:Martinus Nijhoff Publ,1989:94-112.9 高武军,王景雪,卢龙斗,孙毅,段红英.硝酸银在油菜基因转化中的影响作用J.中国农学通报,2002.8,18（4）:43-45.10 Karthak K,Gamborg O L,Constabl F. In vitro plant formation from stem explants of rape(Brassica napus cv.'Zephyr') J. Physiol Plant,1974,31:217-220.11刘峻,于红霞,林汉华.-雌二醇微球状分子印迹聚合物优化合成条件J.南通大学学报:自然科学版,2008,7(3):72-74.12杨平,蔡小宁,钟小仙,贲爱玲,续晨,王敏.拟南芥AtNHX1基因克隆和cre(lox)植物表达载体构建J.江苏农业科学,2007.6:348-350.13石淑稳, 周永明, 孙学成, 张献龙.甘蓝型油菜遗传转化体系的研究J.华中农业大学学报,1998,17(3):205-210.14王燕, 曾幼玲, 贺宾,秦丽,李金耀,高燕,张富春.农杆菌介导NHX基因转化甘蓝型油菜的研究J.作物学报,2005,16：278-282.致 谢首先，感谢我的导师 ，从实验设计到论文的撰写，蔡老师在整个实验过程中悉心教导谆谆教诲，蔡老师为人可亲、实事求是、认真负责，是值得我们所有学生学习的榜样。同时，由于本实验工作量大，难度较高，过程也较烦杂，我在实验及论文撰写过程中遇到不少瓶颈，很多认识的不认识的同校同学都给予我莫大帮助，在此对所有给予我帮助的同学们表示由衷的感谢。最后衷心感谢南京晓庄学院生命科学系的领导与老师们的关心与指导！