Zn2 对大肠杆菌蛋白表达的影响毕业论文.doc

Zn2+对大肠杆菌蛋白表达的影响 摘要：随着社会的发展，环境污染越来越严重。现在，人们已经把它提升到了一个重要的高度。环境污染包括许多方面，其中很重要的一项就是重金属盐的污染。本文中重点介绍了不同浓度重金属盐离子（Zn2+）对大肠杆菌的影响，以及对大肠杆菌蛋白表达的影响。希望可以通过研究它对大肠杆菌的影响，大致了解其对自然环境中各种生物的影响。关键词：大肠杆菌；Zn2+浓度；蛋白表达；电泳；灰度扫描；色谱分析1 引言 随着人类社会的进步与发展，人类的活动空间逐渐增大，对环境的影响也越来越大，环境就随着人类活动的增加而逐渐的衰退。目前，环境污染已经是一个很重要的话题，当然，它也包括很多方面，例如，空气污染、水资源污染、噪音污染、土地污染等。污染源也是方方面面的，如我们都知道的气体（主要是H2S、SO2、NO、NO2、CO等）污染、农药化肥污染以及粉尘飞沫污染等等。然而，还有一项比较重要的污染一直被大家给忽略了，那就是重金属污染。目前，对于重金属污染的研究比较少，这方面的研究成果也都不太完善。现在，在国外有些实验室已经致力于这方面的研究，国内的现状却令人担忧。本项目就是在此基础上随之而生的。本项目选用了经济实用的锌离子来进行这次实验，它具有性质简单、容易得到、结果容易分析等特性，【1】这些使本次实验变得简单易行。本项目中所有的实验都是研究重金属盐离子（Zn2+）对生物生长的影响，重点研究的是微生物（大肠杆菌）的生长。通过不同浓度的Zn2+的对比试验，我们可以直观的发现微生物生长的变化，得到Zn2+对其生长的影响。自然界是相通的，我希望大家可以通过重金属对微生物的影响，大致了解其对其他物种的作用。2 环境变化对生物的生长影响的理论2.1蛋白质的不稳定性生物体中的大分子物质有很多种，其中最为重要的就是核酸和蛋白质，生物的生长发育都离不开它们，本文中重点介绍的是蛋白质。蛋白质大多都不稳定，很多不适宜的条件（如高温、强酸、强碱等）都会引起它们的形状与功能发生变化，直接影响生物体的正常生长，导致很严重的后果。蛋白质的这种不稳定性被称之为变性，它是指天然蛋白质受物理或化学因素的影响，分子内部原有的高度规则性的空间排列发生了变化，致使其原有的性质与功能部分或全部丧失的作用。 当然，蛋白质的变性不是单向的，在一定程度上它是双向的，也就是说蛋白质的变性如果不超过一定限度，经适当处理后，可以重新变为天然蛋白质。例如，血红蛋白经酸变性后加碱中和可恢复其原有性状的2/3；经水杨酸钠变性后，如果水杨酸钠的浓度不大，将水杨酸离子除去后，血红蛋白的天然性质可以全部恢复。胰蛋白酶在酸性溶液中经70100。C短时间热变性后，如果适当冷却，仍可以恢复其原有性质。虽然这些例子都证明蛋白质的变性为可逆的，但卵蛋白经酸变性后，即使再将酸中和亦不能恢复性状，鸡蛋的蛋白热变性后也同样不可逆。总而言之，变性的可不可逆与导致因素、蛋白质种类和蛋白质分子结构的改变程度等都有关系。【2】在这众多的不适宜条件中，尤为重要的就是重金属盐离子。在碱性溶液中，蛋白质带负电荷，可以与重金属离子如Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+等作用，产生重金属蛋白盐沉淀，如铅盐及汞盐在氢氧化钠溶液中皆可使蛋白质沉淀。铅中毒或汞中毒时服用蛋白质解毒正是这种原理。已经沉淀了的蛋白质不再具有其原有的结构与功能，也就是说这个已经变性的蛋白质是一个废旧的物质，再也无法正常的实施其作用与功能，机体就会主观的判定它是无用的，将其降解成它的组成部分氨基酸。显然，变性的蛋白质无法正常的实施它的生理生化功能，那么这部分的化学反应就会受到影响，细胞首当其冲，机体自然难以幸免。2.2 生物的逆境生理逆境是指对生物生长和发育不利的各种环境因素的总称，又简称为胁迫。逆境的种类是多样的，根据环境的种类，逆境又分为生物逆境与非生物逆境，这些因素之间相互交替，共同作用。【3】生物对逆境的适应能力叫做生物的适应性。生物对逆境的适应方式也是多种多样的， 如避逆性与抗逆性等。其中，避逆性是指生物整个生长发育过程不与逆境接触，而是在逆境到来之前就结束自己的生活史。抗逆性是指生物对逆境的抵抗能力或耐受能力，包括御逆性与耐逆性等等。自然界的生物总是处于一个较稳定的环境内，当环境发生变化时，自身也会产生一些变化，使自己适应新的环境。但是，当环境的变化超出生物的适应范围时，就会对它产生重要的影响，甚至使它失去生命活力，结束其生命历程。2.3 重金属盐离子的定义在日常生活中，我们常把一些密度较高，俗话说比较重的金属称之为重金属（如Mn、Zn、Cu、Fe 等），物理学界把密度高于4.5g/cm3的金属定义为重金属。显然，含有重金属的盐类就是大名鼎鼎的重金属盐，重金属盐在液体环境中多以离子形式存在，这就是重金属盐离子。本次实验就是基于这一理论展开的，通过不同浓度的对比试验、SD分光、电泳、灰度扫描、以及色谱分析等手段，得到Zn2+对微生物生长的影响。3 材料与方法3.1菌株 大肠杆菌pop2136 (C600 衍生株, 含C1857 基因,编码温度敏感的阻遏蛋白) 3.2 试剂1.凝胶储备液（Acr/Bis）2.分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl,pH8.8）3.浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl,pH6.8）4.质量分数为10%十二烷基硫酸钠（SDS）5.样品缓冲液（2倍还原缓冲液）6.电极缓冲液7.标准蛋白质溶液8.质量分数为10%过硫酸铵9.质量分数为1.5%琼脂10.染色液11.脱色液12.待测相对分子质量的样品3.3 仪器1.高压灭菌锅2.干燥鼓风机3.恒温培养箱4.超净工作台5.摇床培养箱6.UV-9100型紫外可见分光光度计7.直流稳压电泳仪8.垂直平板电泳槽9.烧杯、试管、滴管、直尺、移液管、涂布环、容量瓶、试剂瓶、培养皿等4 实验步骤4.1 微生物的培养与对比试验微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。他们是一些个体微小、构造简单的低等生物，包括属于原核类的细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体；属于真核类的真菌、原生动物和显微藻类；以及属于非细胞类的病毒与亚病毒。【4】人们大多以为微生物生命力很强，几乎没有不存在它们的“净土”，其实，这是一种误解。事实上，微生物只有在一个比较适宜的环境下才能够生长的旺盛，这样的环境包括温度、湿度、氧气、酸碱度、营养成分等等。我们可以通过在同一条件下培养微生物，然后给出唯一的变量做对比实验。其后，根据所得到的不同的微生物的数量、质量、蛋白质含量等指标来分析这一变量带来的影响。本次实验就是在这一理论基础上进行的。4.1.1 实验前的准备 4.1.1.1 玻璃仪器的清洗与灭菌 将本次实验要用到的三角瓶、试管、移液管、容量瓶、溶剂瓶、培养皿、玻璃棒等清洗干净。晾干后，用报纸将移液管、培养皿包扎好，置于高压灭菌锅内灭菌30分钟。取出，干燥箱内保存。4.1.1.2 培养基的选择、配置、分装与灭菌培养微生物的培养基有很多种，最常用的是牛肉膏蛋白胨（MS）培养基，它能够满足微生物生长的一切需要，若仅仅用来培养微生物，它就足够了；假若你要用来挑选一些比较特殊品种的话，你就要另作他选了，比如伊红美兰培养基等。【5】本次试验只是用来培养微生物而已，所以，我选择最常用的MS培养基。MS培养基的配方如下：牛肉膏0.3g；蛋白胨1g；氯化钠 0.5g；琼脂1.5g； H2O 100ml；pH 7.2-7.4。配置50ml的固体培养基和200ml的液体培养基；将固体培养基放置于三角瓶中，用棉塞封好，包扎；液体培养基分装到试管内，每只试管内8ml，用棉塞封好，每十只一组用报纸包扎好。在高压灭菌锅内加入适量的水，将培养基放置于其中，盖好盖子，灭菌30分钟，取出。将固体培养基倒于已经灭菌了的培养皿内，静置至其凝固。液体培养基静置降温后，冰箱内-4。C保存。4.1.1.3 无菌水的准备在已经清洗干净的三角瓶中加入适量（小于2/3）的蒸馏水，用棉塞、报纸包扎后灭菌锅灭菌30分钟。取出，降温后放置冰箱内保存。4.1.1.4 Zn2+母液的配置称取硫酸锌晶体（ZnSO4 ·7 H2O）0.2880 g溶解于蒸馏水中，制备成100ml的溶液，即溶液的浓度为1umol/ml。灭菌后冰箱内保存。4.1.2 微生物的培养本次实验是以微生物为载体的，所以在对比实验前需要将微生物培养到处于同一阶段，尽量减小因微生物生长状态的不同而产生的误差。本次实验考虑到微生物的生存能力、所需营养物质、结果分析的难易程度等因素，选用了较常见的大肠杆菌。 图一：显微镜下的大肠杆菌 图二：大肠杆菌结构示意图4.1.2.1微生物的复活久置的微生物活性会降低，因而影响实验结果。【6】所以，实验前要对其进行复活实验。取冰箱内久置的大肠杆菌，在超净工作台内无菌操作，用划线法将其接种到两个固体培养基内，恒温培养箱中倒置培养1824h。4.1.2.2 微生物的液体培养将复活后的菌株接种到液体培养基内，接种5*2支试管，棉塞塞好，做好标记（a、b、c、d、e）后置于大烧杯或广口瓶中，摇床培养1824h。4.1.3 对比实验将培养好已经处于同一生长阶段的微生物进行对比实验，在超净工作台内将每支试管内加入不同浓度的Zn2+。4.1.3.1 Zn2+处理每支试管内具体浓度如下：（单位：umol/ml） 表一：Zn2+ 浓度梯度abcdeZn2+浓度00.0250.0500.1000.200对每支试管内的细菌作如下处理。每支试管内加入的物质如下：(单位：ml) 表二：大肠杆菌处理实况abcdeZn2+溶液00.250.501.002.00无菌水2.001.751.501.0004.1.3.2 摇床培养将已经处理完毕的试管（5支*2）放置于大烧杯内，摇床培养1824h。4.1.3.3 后继培养摇床培养后的细菌数量较少，很难得到要得的结果，这就需要后继培养。将摇床内的试管取出，分别接种于洁净的液体培养基（8ml）内，做好标记（1、2、3、4、5），摇床培养1824h。4.2 蛋白质提取 从已经培养到对数期的菌液（各8ml）中提取蛋白质以进入下一步实验：4.2.1 收集菌体用离心法收集菌体：将菌液悬浮于PBS中，加入等体积（8ml）的2倍SDS-PAGE样品缓冲液（还原型），100。C煮沸3min，然后104r/min离心1min。74.2.2 收集蛋白质溶液离心后的离心管里分成上下两层，取上清液，即为蛋白质溶液。4.3蛋白质含量测定4.3.1紫外分光法测定蛋白质浓度 在紫外分光光度计上，将未知蛋白质溶液（2、3、4、5组）小心的盛于石英比色皿中，以1组为对照，由于本次实验中的蛋白质样品为混合蛋白质，故用A280nm处的吸光度来计算。8计算公式为：C=0.75*A280nm实验结果如下： 表三：蛋白质浓度实验组与对照组280nm处吸光度蛋白质浓度C11.35231.014221.41241.051831.55381.165441.45021.087651.00740.7756 在Excel中，蛋白质浓度对Zn2+浓度作图，得到图像如下： 图三：蛋白质浓度变化示意图由图像得知，蛋白质浓度随Zn2+浓度的升高而升高，但是到达一定程度时，蛋白含量急剧下降。4.3.2 SDS-PAGE取蛋白质溶液作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（120V，电泳1-1.5h），考马斯亮蓝染色，通过凝胶扫描确定蛋白质的表达水平。4.4 凝胶条带的分析和数据检索4.4.1 蛋白质的分子质量使用BandScan 软件对凝胶条带进行分析，找出实验组（2、3、4、5）与相应对照组（1）中表达存在差异的蛋白质条带，计算出差异表达蛋白质的分子质量。实验结果：使用BandScan软件分析后，除去那些基本相同的条谱外，找到的不同条带的情况如下： 表四：灰度表1234520537512394258312596420123101927012电泳图谱分析得到灰度值变化明显，在12.1KDa的地方灰度明显增加，即差异表达蛋白质的分子质量为12.1KDa。4.4.2 蛋白质种类与作用根据得到的数据在NCBI蛋白质数据库中进行比对，确定该蛋白质的种类在NCBI蛋白质数据库中找到相对分子质量为12.1KDa的蛋白质为硫氧还蛋白家族，它们是一类约12 kDa的小分子蛋白质，含有高度保守的活性反应位点WCG/PPC，催化硫醇键二硫键之间的相互交换，调节细胞内的氧化还原作用。很多实验表明硫氧还蛋白与生物环境胁迫有一定的相关性，尤其是氧化胁迫时，能够增强生物对逆境的耐受力。5 结束语通过本次Zn2+对大肠杆菌的蛋白质表达的影响实验，我们可以知道，Zn2+对大肠杆菌中硫氧还蛋白的表达有促进作用，这是生物对不适环境的自我调节在起作用。但是一旦超过一定的限度时，就会使它的生长受抑制。如此，就可以根据大肠杆菌内硫氧还蛋白的量来检测环境中Zn2+的浓度，监测环境被重金属污染的程度。待添加的隐藏文字内容2The effect of Zn2+ to the E.colis protein expression Abstract: Along with the development of the social, the environment pollution becomes more and more serious. Now, people have stepped it up to a height of concern. The environment pollution involves a lot of facets, in the facets, the heavy metals pollution is very important. In this text, I tell you something about the effect of the heavy metals ion (Zn2+), in the different thickness, to the E.colis growth, and to the E.colis protein expression. I hope we can almost realize the effect of heavy metals ion to all kinds of species in the environment, though the study of the effect to the E.coli.Key words:E.coli; Zn2+ thickness; protein expression; electrophoresis; the scan of ash degree; chromatogram analyse参考文献1 Effect of Cu and Ni on Growth,Mineral Uptake,Photosynthesis and Enzyme Activities of Chlorella vulgaris at different pH Values and Toxicity of heavy metals Cu,Zn and Hg to the gammarid amphipod Parhalella natalensis (Stebbing) D. Taylor1，B.G. Maddock12 郑集.陈钧辉主编.普通生物化学（第三版）.北京：高等教育出版社,2006：1171193 王宝山主编.生理学.北京：科学出版社，2004：2742794 周德庆主编.微生物学教程（第二版）.北京：高等教育出版社，1999：23265 谢正杨.吴晓枫主编.现代微生物培养基和试剂手册.福州：附件科学技术出版社，19946Maxam,A.M.and Gilbert,W.:A new method for sequencing DNA.Proc.Natl.Acsd.sci.,USA V.1997: 5605647 卫保杨主编.微生物生理学.北京：高等教育出版社，2004：368 陈钧辉.陶力等编.生物化学实验（第三版）|.北京：科学出版社，2006：6165附录1紫外光吸收法测定蛋白质浓度一、目的1.了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理。2.熟悉紫外分光光度计的使用。二、原理蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸收度成正比，故可以用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。由于核酸在260nm波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处。如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此，如溶液中存在核酸必须同时测定280nm及260nm的吸光度，方可计算测得溶液中的蛋白质浓度。三、实验器材1.UV-9100型紫外可见分光光度计2.容量瓶50ml（*1）3.试管1.5cm*15cm(*9)4.吸管0.50ml(*1)、10ml(*3)、2.0ml(*2)、5.0ml(*2)四，实验试剂牛血清蛋白标准液：约1g牛血清蛋白溶于100ml0.9%NaCl溶液中，离心，去上清液，用克氏定氮法测定蛋白质的含量。根据结果，用0.9%NaCl溶液稀释牛血清蛋白溶液，使其蛋白质含量为1mg/ml。未知浓度蛋白质溶液：用酪蛋白配置，浓度控制在1.0-2.5mg/ml范围内。五、操作在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得280nm与260nm两种波长的吸光度（A260nm及A280nm） 将280nm与260nm两种波长的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度 C= 1.45A280nm 0.74A260nm式中的C：蛋白质质量浓度（mg/ml）； A280nm：蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度； A260nm：蛋白质溶液在260nm处测得的吸光度。本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还实用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往比较困难。为方便其见，对于混合蛋白质溶液，可用A280nm乘以0.75来代表其中的蛋白质的大致含量（mg/ml）。附录2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳一、目的1.了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。2.会用这种方法测定蛋白质的相对分子质量。二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带有电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子去污剂，能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，也就消除或减低了不同蛋白质之间电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白的相对分子质量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。三、实验器材1.直流稳压电泳仪。2.垂直平板电泳槽。3.移液器（1.0ml、200ul/20ul）。4.微量注射器（20ul）。5.烧杯。试管、滴灌、直尺。四、实验试剂1.凝胶储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加入重蒸水定容至100ml。外包锡纸，冰箱内保存。2.分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl,pH8.8）：18.15g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入80ml重蒸水，用1mol/LHCl调节pH至8.8，定容至100ml，冰箱内保存。3.浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl,pH6.8）：6gTris,加入60ml重蒸水，用1mol/LHCl调节pH至6.8，定容至100ml，冰箱内保存。4.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：称量10gSDS，溶于重蒸水中，最后定容至100ml。5.样品缓冲液（2倍还原缓冲液）：0.5mol/LTris-HCl,pH6.82.5ml甘油2.0ml质量浓度10%SDS4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlB-巯基乙醇1.0ml6. 电极缓冲液：Tris3g,甘氨酸14.4g，SDS1.0g，加重蒸水至1000ml，冰箱内保存。7.标准蛋白质溶液：低分子质量的标准蛋白质，开封后溶于200ul重蒸水，加200ul 2倍还原缓冲液，分装20管，-20。C保存。临用时沸水水浴35min。本实验所用的是牛血清白蛋白，其相对分子质量为6.6*104。8.10%过硫酸铵：实验前称取过硫酸铵1g，溶于重蒸水内，定容至10ml。9.1.5%琼脂：称取0.45g琼脂粉加入30ml重蒸水内，加热至沸腾溶解，未凝固前使用。10.染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸。11.脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml重蒸水混合12.待测相对分子质量的样品五、操作：1.将垂直平板电泳槽装好，用1.5%琼脂趁热灌注于电泳槽平板玻璃的底部，以防漏。2.分离胶的选择和配置方法：（1）按照蛋白质相对分子质量选择分离胶浓度本次实验中的蛋白质相对分子质量为4*1041*105，所以分离胶的浓度为10%15%，选用12%的分离胶。（2）分离胶的配置方法：重蒸水/ml3.351.5mol/LTris-HCl,pH8.8/ml2.5质量浓度10%SDS/ml0.1凝胶储备液（Acr/Bis）/ml4.0质量浓度为10%过硫酸铵/ul50TEMED/ul5总体积/ml10在15ml试管内依次加入重蒸水3.35ml、1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)缓冲液2.5ml、10%SDS0.1ml凝胶储备液4.0ml、10%过硫酸铵50ul和TEMED5ul，由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心的在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约30-60min，分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去除干净。4.浓缩胶的配制与灌制：一般采用5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水2.95ml、0.5mol/L Tris-HCl（pH6.8）缓冲液1.25ml、10%SDS 0.05ml 、凝胶储备液(Acr/Bis) 0.8ml、10%过硫酸铵25ul、TEMED 5 ul,在试管内混匀，灌注于分离胶上。小心的插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约30min）。5.样品的制备：（1）标准蛋白质样品的制备取出一管预先分装好的20ul低相对质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热35min，去除冷藏至室温。（2）待测蛋白质样品的制备10ul蛋白液加10ul 2倍还原缓冲液，沸水浴加热35min，取出冷藏至室温。6.电泳（1）待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔数次，然后将电泳槽灌注满电极缓冲液。（2）用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。（3）接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至2030mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。7.染色与脱色：小心将凝胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插入一细钢丝作为标志。加染色液染色1h，倾出染色液加入脱色液，数小时换一次脱色液，直至背景清晰。8.相对分子质量的计算：用直尺分别测量出标准蛋白、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按照下式计算相对迁移率：相对迁移率=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。