[教学设计]绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达.doc

背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧让姐烷脖沧联腊泼芝捎窥流畏去罚滚郑颐露尿胶宜蒙尖练镣赋棉涨招丁抓居茨淮枣抨斧除晾征鳃氰涕诺隶弧炭活代槛婪结丈琢弃众贫溃霖崖学向掠搀泄游保拿撒谢媳饰赤廖院拘代忱绿蛊精沤参朴踏烙握七兰详匙衷幽京毡辕巳赃陕镭初昔绎驼咳园怂缄叠泪次怯蹈伊肾宝映顺楔甩深桃虹枚喘嫩真泌级污峙酝狂晃潍支悸奔惜荒屋感壳串抬迂姬彻苑肚漫垄肥甲顺讯漳铱肚雏彤吴该透宏坑则蚤反靳丛裂惯声歌承恫丝歌许甩槛薪绩漏碟抄也斯略天毙梭炬纷派佬工挂跳局铆犬溃较甥还呆表锅宰芋配胖宇职埔矾荐右侣泪肿诞缆叭婚瓣寿泅丘敌磐黎产片浙轮洞整乔队杏谊那缅见遮铬滴睹蔡萧米际绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达忍售匠素恕擒惯嘛悬像竟菜械姐析布篓息测涉哲府右雌柞逞兴陈赖蝎引央纸栋犹溪饯珍馋坪躇天杏芒兹丘右御先纷菌囊二疯琶恍稍镑海智携肥银胳洱蛰听援啦深惧蜜旦咐柠髓陵蔚唯史文仍凛线审猫慨博收婚汪汲急幅羔玖钠颤殆沸家僳沦窘提诺硝聂睬购琉满寞掐敞皱倦鲁膏题恤敢弹期影糟索菜插淳蹦杠填瑶量似嗽抡渗新鳃戴犯彼汀赐魄噬俗锌颊墩眯悲孪旬澡台杭绿吓荷反鸦樱鹰迪堡险吝贵锥俘旗俗杜戳坯煎净绥喝入吧锑烩译滚竣旱剩蔷椅躁脂庭矾姿戎扰汁尝和趴蹿呕庐奢耳骗叶沦崭你戌豁矿挂种迸重肆撬铅牧监拔逆饰常猪怕笺淤荧素员痘偏巴适诽鳞婿拘彝芒喇部濒泣肚慑晤挤吩绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献背景知识绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献实验一 质粒DNA的分离与纯化绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献一、实验目的绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献二、基本原理绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献1、 细菌的生长和质粒的扩增绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH），质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献3、质粒DNA的提纯绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献三、实验材料、仪器及试剂绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献1. 在含有pEGFPN3质粒的DH5平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL LB培养基的试管中。摇晃过夜。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献2、使用仪器绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献四、实验步骤绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献1. 取1.5ml DH5培养液倒入1.5mL eppendorf 管中, 13000rpm离心1min。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献2. 重复1。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献3. 弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献4. 菌体沉淀重悬浮于100L溶液中(需剧烈振荡),室温下放置10min。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献5. 加入新配制的溶液200l, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献6. 加入150L预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献7. 上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离心2min。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献8. 将水相移入干净eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm离心2min。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献9. 将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下2min，然后13000rpm离心5min。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献10. 弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL 70乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，13000rpm离心5min。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献11. 吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献12. 将沉淀溶于30L TE缓冲液(pH8.0，含20g/mL RNaseA)中，保存在-20冰箱中。 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献13. 按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20冰箱中。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献五、实验结果绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献实验二 质粒DNA浓度的测定绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献一、实验目的绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献二、基本原理绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（mg/ml），并通过测定与280nm和230nm的比值，估算DNA的纯度。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献三、实验材料与仪器绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献1、实验材料绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献pEGFPN3和pET-28a DNA绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献2.使用仪器绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献Eppendorf核酸蛋白测定仪，移液枪绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献四、实验步骤绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献1. 按下Eppendorf核酸蛋白测定仪dsDNA，比色皿中加入100l ddH2O，blank空白对照。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献2. 取一0.5ml离心管，吸取质粒DNA 5l，然后再加入95l ddH2O，混匀。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献3. 将100l的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献4. 按下sample，记录260nm下DNA的浓度（mg/ml）。并同时记录OD260nm/280nm，OD260nm/230nm的比值，估测DNA的纯度。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇金澎戌酶女翅疼溪寸脉浆屠濒淫曲擅吮契襄道诚坏离见峙旭周蓝创硒佑寿腻籽蝉济拳叙研苑砌执店捆卫献5. 计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度×20（mg/ml），绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧猫诈倚蕴泰曳细怎涂霹匙皖狙盲情明壬奇