化学发光分析法的应用研究与新进展全解.doc

化学发光分析法的应用研究与新进展摘要：化学发光分析法是根据化学反应的发光强度或发光总量确定相应组分含量的一种分析方法。同荧光法相比，化学发光法不需要外来的光源，减少了拉曼散射和瑞利散射，降低了噪音信号的干扰，提高了检测的信噪比，扩大了线性范围。并具通过特定的化学发光可以定性定量的测定微量物质，有操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。同时在实践的过程中化学发光分析法与其他方法相比较其灵敏度也较高，此外线性范围宽和仪器简单也是化学发光分析法的特点之一。正是基于这些特点，化学发光分析法在环境化学、临床医学、生物科学等领域得到十分广泛的应用和研究。本文从化学发光分析法的原理、优缺点和应用研究的新进展等方面进行了综述。关键词：化学发光分析法，化学发光体系，鲁米诺，光泽精引言化学发光是化学反应体系中的某些分子或原子中的电子，如反应物、中间体或反应产物吸收了化学反应释放出的化学能后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子所产生的光辐射2。化学发光又称为冷光，它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下由化学反应而产生的光辐射。由于不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。具有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。在生物工程学，药物学，分子生物学，临床和环境化学等各个领域正显示出它蓬勃的生机。本文主要介绍化学发光分析法的原理、优缺点，常用的化学发光试剂及其体系，和在环境化学、临床医学、生物科学等领域的应用研究和化学发光分析法的近两年的应用新进展。1 化学发光1.1化学发光的原理发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为：光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量的现象。化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本身；而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。时刻t 的化学发光强度（单位时间发射的光量子数）： 如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度Icl与该时刻的分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内的发光总强度来进行定量分析。1.2化学发光类型一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光2。反应过程可简单地描述如下：A+ B C*C* C + hv其中v为光子，C*表示C处于单线激发态；若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光2。反应过程可表示如下：A + B C*C* + D C + D*D* D + hv2 化学发光分析法化学发光(Chemiluminescence ，简称CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，是指物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态,受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光5。根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定组分含量的分析方法 11。可将化学发光分析法分为：普通化学发光分析法 ( 供能反应为一般化学反应 ) ，生物化学发光分析法 ( 供能反应为生物化学反应；简称 BCL)，电致化学发光分析法 ( 供能反应为电化学反应，简称 ECL) 等。2.1 化学发光分析法的优点化学发光分析检测具有如下优点：一、灵敏度高，灵敏度高是化学分析关键的优越性，用其进行免疫分析，其灵敏度可达11-22mol/ L（RIA为10-12mol/L），化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶免疫分析等方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义；二、宽的线性动力学范围，发光强度在4-6个数量级之间与测定物质浓度间呈线性关系；三、光信号持续时间长，辉光型化学发光信号持续时间可达数小时甚至一天，简化了实验操作与测量；四、分析方法简便快速，绝大多数分析测定仅需一种试剂（复合试剂）的一步模式；五、结果稳定误差小，样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能对分析结果带来影响的因素，例如光源稳定性，光散射，光波选择器等。2.2 化学发光分析法的缺点化学发光法不足之处是其发光在瞬间完成，发光强度峰值衰减时间短，有些发光反应时间不到10秒钟，光背景高，造成检测结果稳定性和重现性差，另外，需要发光时间，目前可以被利用的发光试剂不多，因此该法的推广应用受到一定程度的限制5。3 常用的化学发光试剂及其体系一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量（170300KJmol），第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。到目前为止，所研究的化学发光反应大多为氧化还原反应，且多为液相化学发光反应。化学发光体系主要由化学发光剂，与化学发光剂反应的试剂、催化剂、增敏剂、缓冲剂、溶剂等组成。3.1 鲁米诺化学发光体系鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-二杂氮萘二酮，也称3-氨基邻苯二甲酰肼）是最常用的液相化学发光试剂之一。其在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，形成叠氮醌，叠氮醌在碱性溶液中在催化剂Fe2+的作用下14，与氧化剂过氧化氢作用生成不稳定的跨环过氧化物中间体，然后再转化为激发态的3-安吉邻苯二甲酸跟阴离子，当其价电子从第一电子激发态的最低振动能级跃迁回到基态中各个不同振动能级时，便产生出最大发射波长为425nm的化学发光。此反应的发光强度（峰值强度）或发光总量可以确定反应中的相应组分含量，通过特定的化学发光可以定性定量的测定微量物质，具有操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、4-氨基已基-N-乙基异鲁诺及AHEI和ABEI等。在通常情况下鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，但当有某些催化剂存在时反应非常迅速。最常用催化剂是金属离子，在很大浓度范围内，金属离子浓度与发光强度成正比，从而可进行某些金属离子的化学发光分析，利用这一反应可以分析那些含有金属离子的有机化合物，达到很高的灵敏度。3.2 过氧草酸酯类化学发光体系过氧草酸酯(peroxalate) 类化学发光体系最早发现于20世纪60年代，最初主要用于军事目的，后来逐渐转入民用。过氧草酸酯类化学发光体系有4种要素化合物，即荧光剂、草酸酯、过氧化氢、催化剂。其化学发光的基本原理是：在合适的荧光化合物(增敏剂) 的存在下，过氧化氢诱导氧化芳香基草酸酯放出能量，而由化学发光染料分子吸收后转化为光能，以荧光形式放出8。这种发光体系除了能用于制造各种冷光源外，还广泛应用于各类化学发光分析。与鲁米诺及其类似物化学发光体系相比,主要优点是量子产量高，因而具有较高的灵敏度，金属离子和氧分子干扰少。3.3 高锰酸钾化学发光反应体系高锰酸钾是化学发光反应中常用的强氧化剂3，高锰酸钾化学发光反应可用来测定两类物质，一类是能直接与高锰酸钾产生化学发光反应的有机物，该有机物的分子结构大多数都含有多个羟基或氨基。另一类是基于能量转移机理测定荧光物质。高锰酸钾可以氧化很多种有机物从而产生化学发光4，某些不易与鲁米诺发光进行测定的物质，可以利用高锰酸钾的高氧化性与之反应，得到满意的测定结果。从而不断开发了新的化学发光体系，扩展了化学发光的应用范围。3.4 其它化学发光反应体系其它化学发光反应体系如吖啶酯化合物，是应用最广泛的化学发光剂之一。代表性物质为光泽精。光泽精是使用较早的一种优良发光试剂，在碱性介质中如被过氧化氢等氧化剂氧化后的产物吸收了反应放出的热量而处于激发态，发射蓝绿光并回到基态。吖啶酯类化合物是一类很有前途的非放射性核酸探针标记物，用作 DNA 的发光探针，发光量子产率高，稳定性好，标记物对杂交反应的动力学和杂交体的稳定性无影响，可以直接在碱性介质中进行化学发光反应。4 化学发光分析法的应用化学发光的高灵敏度，宽线性范围，分析快速简便，安全性好等优势使得化学发光作为一种光谱检测手段，越来越受到大家的关注。随着研究的升入，化学发光有着其广泛的应用前景。4.1化学发光法在环境监测中的应用4.1.1 化学发光分析与毛细管电泳技术的联用化学发光分析结合毛细管电泳技术联用的现代测试技术在环境监测工作中应用较多。刘等14用柱头场放大样品富集技术测定镍，使镍离子的灵敏度得到显著提高，其检测限为7.010-11mol/L。卫洪清等15以邻菲咯琳为配位剂，在鲁米诺一过氧化氢体系中，对两种形态的铁元素(Fe(II)和Fe(III)进行了分离和检测。除了直接用化学发光法检测金属离子外，还可以用间接化学发光法。如任吉存等16以钻离子为探针，在鲁米诺一过氧化氢体系中用间接化学发光的方法在线分离和检测了18种金属离子，检测限比间接紫外检测方法低三个数量级，比间接激光诱导荧光法低两个数量级。4.1.1 金属离子分析 痕量金属离子对化学发光反应具有很好的催化作用，因而化学发光测定金属离子17,18,19得到广泛的应用(见表1)。此外，文献上记载最早的化学发光试剂洛粉碱被用于多种元素的分析测定。4.1.2 其它化合物的分析 四价铈可直接与多种还原性无机物或者有机物放生氧化还原反应，是强氧化性化学发光剂之一。尽管发光体系比较简单，可是因为不收Cl-的影响，更合适检测水样中有机物污染的程度。化学发光反应中，过氧化氢是最常用的一种氧化剂，因此有关H2O2化学发光分析涉及到鲁米诺、过氧草酸酯及光泽精等化学发光反应的较多 ( 见表 2)。4.2化学发光法在临床医学中的应用4.2.1 药物 根据药物的不同类型选择不同的化学发光分析方法。目前较常用的方法是直接氧化化学发光。药物大多为一些有机化合物，有机化合物的同系物结构和性质相似，使单一组分的测定遇到困难，因此有机化合物同系物的分析常与HPLC相结合。在碱性溶液中用N-溴代丁二酰亚铵氧化含有酰胺基的药物产生化学发光，如利福霉素等检测限在1.23m gL0.5 gL之间。氧化四环素类药物检出限在0.02-0.04 mgL之间。有机酸的化学发光分析(见表3)，例如在临床医学上1，草酸是一个重要的检测项目，可以直接用氧化化学发光反应测定尿液和草酸二乙酯中的草酸盐及游离的草酸。在临床医学上，草酸是一个重要的检测项目，可以直接用氧化化学发光反应测定尿液和草酸二乙酯中的草酸盐及游离的草酸。另外还可以测定苯酮尿症病人的尿液的苯丙酮酸的含量，方法是先在碱性条件下将苯丙酮酸氧化成1,2-二氧杂环丁烷类化合物，然后裂解产生化学发光。另外可以Fe(III)草酸配合物光解得到Fe(II)，催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应，此法线性范围为0.1100uM。由于高锰酸钾的强氧化性，对于碘和抗坏血酸的测定就发现了多种体系10, 20。不过由于高锰酸钾和多种物质均有化学发光，因此高锰酸钾体系用于实际物质的化学发光测定干扰较严重，为提高分析方法的选择性，吴明星等9人对高锰酸钾同时作用于VC和罗丹明B 的化学发光行为进行了研究。4.2.2 血液许多实验研究对加入Fe2+盐的不同疾病患者血闭合性局部缺血、血氧含量下降以及出血、手术性休克病人血浆和血清的发光强度降低。与此相反，风湿性关节炎、阑尾炎、胆囊炎、胰腺炎等炎性疾病患者血浆和血浆和血清的化学发光进行的测量表明，与正常健康人相比，腹腔器官局部缺血、肢端清的发光强度升高。降低和升高的幅度与疾病的严重程度有关。有研究提出，利用此方法有可能对非典型的心肌梗塞和腹腔器官炎性疾病做出区别诊断。 4.2.3 尿液的化学发光 利用尿液的化学发光可以研究肾脏功能的变化。将Fe2+盐加入尿液中，测量其化学发光，发现肾功能不足者尿液的发光强度降低。与正常健康人相比，阑尾炎患者尿液的发光强度则有不同程度的提高。利用这一方法可以评估肾脏的排泄及收缩功能。 4.2.4 抗氧化活性的测定 利用发光测量技术可以评价某些生物组织和体液的抗氧化活性。以某一稳定的发光系统为模型，如脂肪体、线粒体、卵黄脂蛋白等，将待测的抗氧化物质加入该系统，然后加入Fe2+盐，测量其化学发光。根据系统化学发光被抑制的程度可以评价物质的抗氧化活性。利用这一方法进行的研究证明，不同疾病患者血浆和血清的抗氧化活性是不同的。4.3 化学化光在生物科学领域的应用 化学发光在生物科学领域也有着很多应用，主要简介如下：4.3.1 氨基酸在生物科学领域中氨基酸分析方法的改进有利于推动生物技术、基因工程、DNA 重组和基因克隆等的发展。由于绝大多数氨基酸没有内源荧光特性，因此用过氧草酸盐体系测定氨基酸需将其衍生成荧光物质，但此法避免不了衍生法所固有的缺点。一般来说，仲胺反应产生的的发光强度比伯胺大。对氨基酸上取代基性质研究表明，给电子基有利于增强化学发光强度。4.3.2 有机碱 胺类化合物第一离子化电势呈如下规律 : 伯胺 > 仲胺 > 叔胺，并随碳链增长，离子化电势逐渐下降，因此叔胺化合物的检测限较低，0.28pM。在生物科学领域中胺类化合物的分析，较多的是经柱前衍生生成荧光衍生物，分离后用过氧草酸盐化学发光体系检测，也可将其生成希夫碱或其它产物氧化而发光。有些碱如肾上腺素等可直接氧化而发光。通常有一个经验规则，假如一物质具有荧光或其反应产物有荧光，该物质一般可发生化学发光反应，但也有例外。嘌呤碱是核酸的基础物质，因此对嘌呤碱的分析测定将推动DNA分析方法的发展。在酸性醇液中腺嘌呤与苯甲醛反应，然后用过氧化氢氧化反应产生化学发光，此法具有很好的选择性，线性范围为1.5×10-7 5.0×10-7M，用此法测定鸟嘌呤灵敏度比荧光法高20倍。4.3.3糖类、类固醇，类酯 光泽精体系可用于测定一些还原性物质，如乳糖、葡萄糖，用于抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的分析测定有很高的灵敏度。但此法用于复杂样品分析却因干扰多而受到限制。用草酰胺化学发光照相法测定了葡萄糖。在微量滴定板上将草酰胺发光剂、荧光增感剂及50uL试样混合，于5min内用照相荧光剂测定液斑的发光强度，可检出100pmo l的萄萄糖。糖类物质测定的另一个重要方法是测定酶反应产生的H2O2，由此对酶底物葡萄糖、乳糖等进行测定。而酶的固定化技术为此法的发展注入了新的活力。一些特异性酶如类固醇脱氢酶和其它荧光素酶与合适底物反应产生H2O2，通过测定H2O2达到分析测定底物肾上腺色腙12的目的。4.4 化学发光分析法的应用研究新进展赵兴圣21采用静态注射的方式注入鲁米诺过氧化氢化学发光试剂，通过IFFL-D流动注射化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度，根据测定结果能够快速鉴定出小锈钢中的锰、铝、镍元素，从而判断出小锈钢的钢种和钢号且鉴定液原料成本较低；分析测试时间缩短为10 min以内，整个操作实验条件较温和，有利于自动化的分析操作。王奕璇等22在碱性介质中，基于多潘立酮对纳米银(AgNPs)增敏I,uminol-KMn()化学发光体系发光信号的抑制作用，结合流动注射技术，提出了测定多潘立酮的化学发光分析新方法。该法灵敏、准确、快速，用于样品中多潘立酮的测定，结果满意。蒋清民，张可擎，王军23采用流动注射化学发光新方法，测定了盐酸沙拉沙星注射液中沙拉沙星的含量，回收率为95.1%101.4%，该法快速、简单、灵敏度高、选择性好。谷秀娟24等采用化学发光分析法、电化学发光分析法分别对醛固酮(ALD)、氮末端脑钠肽前体(NT-proBNP)进行检测分析，并进行统计学分析，观察到ALD、NT-proBNP的浓度分别为(256.0±60.9 ) 、(1920±689.08 )ng/L，得出了检测血清ALD、NT-proBNP , cTnI浓度，可以为临床筛查高血压合并AMI提供有价值的实验室依据，为早期发现高血压合并AMI患者提供有效的帮助，降低心血管事件的发生率。黄显杨，李妍媛25探究了不同血液处理方式对微粒子化学发光法检测胰岛素的影响，对COPD患者血清DD和hs-CRP的检测可以帮助临床了解患者的情况，排除肺栓塞，为更好治疗COPD提供参考。5 结论化学发光作为光谱分析中重要的分析手段越来越受到普遍的关注，由于其不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比，而且可以定性定量的测定微量物质，有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方便，易于实现自动化，分析速度快等特点，在化学、生物学领域常用作动力学研究和化学反应机理研究，在环境、生物、化学和医学领域用作金属离子及有机物的分析，并可作为检测手段与其他分析方法联合使用。虽然由于化学发光试剂的稀少，化学发光的选择性差等问题限制了其广阔应用，这些问题也受到大家的普遍注意。但是综合起来分析，化学发光分析法仍是一种很有发展前途的分析技术，有着非常广阔的应用前景。参考文献1 Benjamin J Hindson, Neil W Barnett . 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