动物细胞培养制药工艺课件.pptx

,第一节 制药动物细胞的表达与特征,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,没有细胞壁 细胞膜 细胞质 细胞核 细胞器,1、结构与功能,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代谢的前提 葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到细胞外并在培养液中积累；经TCA循环，彻底氧化产生CO2和H2O。一小部分为戊糖磷酸途径，生成四、五、七碳糖和NADPH 中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢 葡萄糖代谢旺盛，产生大量的乳酸，对细胞有毒性 葡萄糖限制：增加谷氨酰胺消耗以补偿，反之亦然,2、细胞代谢特性糖代谢,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,谷氨酰胺：脱氨、转氨等，合成其它非必须氨基酸 离体动物细胞，转氨是主要代谢途径；谷氨酰胺与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。脱氨产生的氨，对细胞有毒性。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，受限制时，通过增加其它氨基酸的消耗得以补偿。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。,2、细胞代谢特性氨基酸代谢,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,蛋白质合成场所：糖基化场所：内质网合成各种糖类，在粗糙内质网腔内和高尔基体进行加工修饰。不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞系。对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。,3、蛋白质糖基化与分泌表达,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,昆虫杆状病毒如核多角体病毒可携带外源基因，感染昆虫细胞或幼虫（宿主），高水平表达外源蛋白质。研究进展 1983年，苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统 1984年，家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,安全：杆状病毒无致病性，产品安全性接受FDA认可 易饲养：家蚕发育快、遗传背景清楚 高量表达：外源基因超量表达；不连续且时间短 高效表达：对外源基因有很大的容量（可插入100kb的DNA）可作为重组病毒的选择性标记，是因为外源基因的插入并不影响病毒的增殖，却丧失合成多角体的能力。翻译后加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，与哺乳动物不同 重组率低：筛选困难、周期长，需要4-10d,优点与不足,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,重组率低、筛选困难、周期长，需要4-10d 研究开发的主要方向：有效的病毒表达系统 决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,基于细胞来源：原代细胞、传代细胞 基于细胞寿命：有限细胞系、无限细胞系 基于细胞的染色体数目：二倍体细胞系、异倍体细胞系 基于获得方式：工程细胞系、癌变细胞系 基于生长特性：贴壁依赖性、非贴壁依赖性,1、细胞系的分类,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,概念：从动物体内直接分离得到的细胞。特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似 应用：药物检测实验，药理研究。生产药品：鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。,1）原代细胞,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,概念：原代细胞转接后培养的细胞。特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型。二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆、纯 化后，获得具一定特征的细胞系。药品生产：WI38、MRC5等。,2）传代细胞,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,概念：是生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培养后失去增殖能力，老化死亡。特点：有限生长，无致瘤性，有接触抑制性 举例：WI-38、MRC-5等用于药品生产，曾经广泛使用 寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细胞最高培养次数50-60代。胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚30代；小鼠，8代。,3）有限细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,概念：是寿命和活性不受传代次数影响的细胞系，可连续培养 特点：没有接触抑制性，对培养条件和营养因子要求低，倍增时间短，适合制药工业生产 理想的药物生产细胞系,4）无限细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,概念：采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组。,5）工程细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,概念：采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组。,5）工程细胞系,概念：染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。特点：长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低，适于大规模工业化生产。,6）转化细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,Namalwa：类淋巴母细胞，非整倍体，悬浮生长。英国Wellcome公司Sendai病毒诱导，大规模生产a-干扰素。WI-38：二倍体成纤维细胞系，寿命有限。贴壁生长，对许多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗 MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38快，对逆境有一定的抗性，用于制备疫苗,2、生产用的细胞系,1）人源细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,CHO细胞：Chinese hamster ovary 特点：贴壁生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍耐能力 最为普遍和成熟表达糖基化蛋白质药物的细胞。多种衍生突变株，高表达。药物：tPA、EPO、HBsAg、凝血因子、DNA 酶I等,2）哺乳动物细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,骨髓瘤细胞与产生抗体的B细胞融合而构成的细胞 特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，大量分泌和高效表达。单克隆抗体的制备。,3）杂交瘤细胞系,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒 质粒穿梭载体：由质粒和表达筛选盒组成 动物细胞中的筛选功能,3、动物细胞的表达载体,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,对培养条件要求苛刻：无细胞壁，对周围环境十分敏感，理化因素易受伤害 对培养基要求高：完全异养，容易利用，相对低分子量的营养物 产物：接近天然结构的活性分子，产品与天然的产物一致；有潜在的血源性污染的危险 工艺：难度大、产量低、成本高；分离纯化简单,4、表达特点,动物细胞培养,动物细胞的表达与特征,第十七章 动物细胞培养 制药工艺,第一节 制药动物细胞的表达与特征第二节 基因工程动物细胞系的构建第三节 动物细胞培养基制备第四节 动物细胞培养技术第五节 培养过程检测与工艺控制,第二节 基因工程动物细胞系的构建,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,病毒载体：牛痘病毒：构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：基因治疗 杆状病毒：外源基因表达（昆虫）质粒载体：穿梭载体，细菌体内扩增，在动物细胞中表达。,1、载体类型,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,基本过程：与基因工程微生物相同 区别：表达原件，启动子、终止子、增强子、选择标记,2、启动子和复制子,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,基本过程：与基因工程微生物相同 区别：表达原件，启动子、终止子、增强子、选择标记,2、启动子和复制子,基本过程：与基因工程微生物相同 区别：表达原件，启动子、终止子、增强子、选择标记,转录起始序列和ATG起始密码ATG的5端约15bp范围侧翼序列内不含碱基T在-3，-6和-9 位置，偏好G碱基在-3，-6和-9 位置，整个侧翼序列区偏好C碱基,3、转录起始序列,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,4、终止子,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,终止密码子：T(U)AA，T(U)AG，T(U)GA PolyA信号序列：不宜太长，避免能量过度消耗常用：SV40 PolyA(131)、BGH的PolyA（225bp）终止序列：加尾信号序列AA T(U)AAA或连续的终止密码 UGA、UAA和UAG，防止转录通读，使转录在正确位点结束。增强子：在转录起始点上游或下游使用，有利于提高外源基 因的转录水平。,4、终止子,转染指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程 一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达。特点：只持续几天,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,1、瞬时转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在的表达。特点：持续时间长。,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,2、稳定转染,动物细胞培养,外源基因转染方法：化学、物理和生物的方法人工脂质体法原理：,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体。阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体，其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。,外源基因转染方法：化学、物理和生物的方法人工脂质体法方法：,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,细胞制备：105的培养平板，CO2培养箱37培养20h。脂质体制备：DNA与脂质体混匀，室温下10min。转染培养：,扩增培养：非选择性培养基，1-2d，转染DNA表达 筛选培养：1:15选择性培养基，2-4d更换培养基，筛选阳性菌株 2-3周，获得单克隆细胞集落 鉴 定：对独立集落进行稳定性、表达量、生物活性等鉴定。,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,动物细胞培养,基因工程动物细胞系,第十七章 动物细胞培养 制药工艺,第一节 制药动物细胞的表达与特征第二节 基因工程动物细胞系的构建第三节 动物细胞培养基制备第四节 动物细胞培养技术第五节 培养过程检测与工艺控制,动物细胞培养,细胞培养基制备,第三节 动物细胞培养基制备,17.3.1,培养基组成成分,17.3.2,培养基种类,17.3.3,培养基质量控制,糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等。,动物细胞对培养基的要求高，不同细胞系的要求也不尽相同，要尽可能提供与体内生活条件接近的培养环境。,动物细胞培养,细胞培养基制备,糖类提供细胞生长的碳源和能源，分解后释放出能量ATP。不同细胞对葡萄糖利用相似，在无氧条件下还产生乳酸等有机酸。不能利用：多糖、双糖、寡糖等聚合物。利用：单糖单体化合物。主要是葡萄糖,1、糖类,动物细胞培养,细胞培养基制备,氮源作用：主要是构成含氮化合物 不能利用：多肽、蛋白质等高分子聚合物。利用：氨基酸等单体化合物。12种是必需氨基酸：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。必须在培养基中添加，才能满足细胞的生长,2、氨基酸,动物细胞培养,细胞培养基制备,作用：一类微量的小分子有机物，既不是细胞的物质基础，也不是能量物质，但对代谢和生长起调节和控制作用。水溶性维生素：B族维生素和维生素C 脂溶性维生素：维生素A、D、E、K四种。,3、维生素,动物细胞培养,细胞培养基制备,作用：细胞代谢所需酶的辅基，调节酶活性，细胞构成成分 参与生理活动。维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。,4、无机盐类,动物细胞培养,细胞培养基制备,激素：调节细胞的生长（刺激作用），胰岛素。贴附因子：细胞的贴壁生长必需，如胶原。脂类化合物：不饱和脂肪酸，如亚油酸、固醇等。载体蛋白：铁离子。,5、激素与附加成分,动物细胞培养,细胞培养基制备,天然培养基 合成培养基 无血清培养基,动物细胞培养,细胞培养基制备,概念：直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基 种类：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液 特点：营养价值高，许多细胞系和原代及传代培养 缺点：成分复杂，不稳定，来源受到限制，不宜大量生产使用。具有血源性污染的可能性，病毒、支原体污染 分离纯化：增加难度。增加成本：工业化生产使用受限。,1、天然培养基,动物细胞培养,细胞培养基制备,概念：用化学成分明确的试剂配制的培养基。组成：糖、氨基酸、无机盐、维生素及其他成分。特点：组分稳定，容易配制。缺点：培养基中须添加5-20血清，才能培养。已有几十种合成培养基，大部分已商品化。如MEM、BME、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199,2、合成培养基,动物细胞培养,细胞培养基制备,血清成分与作用,含有基本的营养成分：补充合成培养基成分的不足 脂肪酸和微量元素：细胞生长所必需，磷脂质、胆固醇、前列腺素E，铜、锌、钴、钼、硒。激素和生长因子：细胞增殖、分化，胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、皮质醇、雌二醇。贴附和伸展因子：细胞贴壁所需，纤维结合蛋白、软骨素、胶原等。载体蛋白：白蛋白、转铁蛋白，金属、激素、维生素和脂类结合，带入细胞,动物细胞培养,细胞培养基制备,血清成分与作用,蛋白酶抑制剂：降解细胞死亡释放的蛋白质；消除毒素和金属的毒性。蛋白质：抗机械剪切，保护细胞免于损伤的作用 缓冲物质：K、Na、Cl、Fe、Ca、葡萄糖等，稳定pH和渗透压 来源：胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清。应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。,动物细胞培养,细胞培养基制备,概念：不添加血清、使细胞能在体外生长繁殖的的合成培养基。组成：合成培养基基础之上，添加激素与生长因子、结合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子量营养因子。特点：提高了培养的质量，避免血清带来的麻烦，产品纯化容易，组分稳定，大量配制。商品化的培养基：,3、无血清培养基,动物细胞培养,细胞培养基制备,培养用水质 缓冲液 生理盐水和平衡盐溶液 其他成分配制,动物细胞培养,细胞培养基制备,必需使用纯净水配制培养基 水存放时间不宜超过2周 普通水必需除去各类元素、有毒或有害物质及微生物和热源，达到纯净水标准。,1、培养用水质,动物细胞培养,细胞培养基制备,弱酸与弱酸盐：碳酸氢钠/碳酸体系 弱碱与弱碱盐：磷酸二氢钠/磷酸氢二钠体系 作用：pH恒定。,2、缓冲液,动物细胞培养,细胞培养基制备,生理盐水：调节渗透压的盐溶液，0.9%NaCl等渗能力 平衡盐溶液：BSS 由生理盐水，缓冲剂与指示剂、无机盐、葡萄糖等成分。作用：满足细胞对盐离子营养的要求；pH和渗透压的环境要求；直观观察pH。加入酚红指示剂，酸性黄色、中性樱桃红、碱性紫红色。,3、生理盐水和平衡盐溶液,动物细胞培养,细胞培养基制备,用量：使用L-型氨基酸，对于DL-混合型氨基酸，使用量应该加倍。谷氨酰胺很不稳定：单独配制溶液。Gln浓度：100倍浓缩液，20保存 一般培养液中含量为14 mmol/L。,4、氨基酸的配制,动物细胞培养,细胞培养基制备,不含葡萄糖的溶液常规高压灭菌。含葡萄糖时，采用过滤除菌；或115，15min 血清使用：需要灭活（56，30min），过滤灭菌，按一定比例加入。4保存。出现沉淀、混浊时，要重新配制。,5、培养基的灭菌,动物细胞培养,细胞培养基制备,第十七章 动物细胞培养 制药工艺,第一节 制药动物细胞的表达与特征第二节 基因工程动物细胞系的构建第三节 动物细胞培养基制备第四节 动物细胞培养技术第五节 培养过程检测与工艺控制,动物细胞培养,第四节 动物细胞培养技术,动物细胞培养技术,动物细胞培养,动物细胞培养技术,生长基质 接触抑制 贴壁依赖性细胞 非贴壁依赖性细胞 兼性贴壁细胞,概念：改变介质表面特性，促进细胞贴附的物质。作用：为介质表面提供适量带电荷，细胞被吸附在介质上，实现贴壁生长。原理：细胞、玻璃和塑料介质表面带负电荷；要使细胞贴壁，必须进行二价阳离子、糖蛋白或其它试剂交联，使之表面带正电荷。天然生长介质：胞外基质成分，胶原。人工生长介质：多聚赖氨酸,1、生长基质,动物细胞培养,动物细胞培养技术,概念：细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个 细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密 度不再增加。有：大多数细胞 无：少数悬浮培养细胞（癌细胞）,2、接触抑制,培养基中的生长因子耗尽时也会产生生长抑制，所以将正常细胞因相互接触而抑制分裂的现象改称为密度依赖性的生长抑制。,细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白，也叫做糖被，他在细胞上起识别作用。当细胞增殖到一定程度，也就是互相挨在一起的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，这种现象就叫做接触抑制。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,概念：生长需要在适量带电荷的固体或半固体支持表面，细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面，才能生长和增殖。大多数动物细胞都属于此类，细胞对培养用器皿的附着能力的不同就是细胞贴壁性能代表了细胞的活力。,3、贴壁依赖性细胞,动物细胞培养,动物细胞培养技术,4、非贴壁依赖性细胞,动物细胞培养,动物细胞培养技术,4、非贴壁依赖性细胞,概念：生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，有时被称为悬浮细胞。血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞属于此类，生长干扰素的Namalwa细胞。,概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。如：CHO细胞、BHK细胞。理想的药物生产细胞系,5、兼性贴壁依赖性细胞,动物细胞培养,动物细胞培养技术,原代细胞分离与培养 传代细胞培养 细胞系的保存与复苏,动物细胞培养,动物细胞培养技术,1、原代细胞分离与培养,动物组织或器官,洗涤 粉碎,酶解消化,离心或过滤,培养液稀释细胞,洗涤,接种培养,从体内取出组织或器官 经过粉碎、消化而获得单细胞 进行体外接种培养。37消化，胰蛋白酶，胶原酶 消化液浓度：0.1-0.3 mg/ml,动物细胞培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养,动物细胞培养技术,2、传代培养-过程,概念：对长满表面的细胞进行消化分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。传代时期：刚刚全部汇合的细胞。过早产量低，过晚健康状态不佳。消化方法：过程与原代细胞相同。用3050倍体积的0.25胰蛋白酶和EDTA对细胞块消化，消化后再培养。要注意消化程度，细胞对酶的反应不同，有的敏感，掌握好适宜的消化时间和方法，不要过度，获得细胞浓度均匀，生长速度一致的传代细胞。防止细胞系之间、非细胞生物的污染。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,3、细胞系的建立,动物细胞培养,动物细胞培养技术,一旦获得了稳定的有一定特性的细胞系，就建立细胞库，进行长期保存。根据药品生产的有关规定，必须建立原始细胞库和生产用细胞库或工作细胞库。,QC内容：细胞活性检测、无菌实验、核型、DNA分析、同工酶分析、支原体试验、其他外源物试验、稳定性和基因型分析等，工作细胞库必须与主细胞库完全一致。,4、细胞系的冻存与复苏,动物细胞培养,动物细胞培养技术,概念：细胞混悬于冻存液中，以一定的速度将细胞悬液降至-70以下，常于液氮下保存。冷冻保护液：含10血清的培养液，附加10甘油或10%DMSO，降低冰点，减少细胞内外冰晶的形成，减少在冻存过程中对细胞的损伤。方法：选用指数期细胞；贴壁细胞须消化，制备成单细胞悬液，离心，制成106/ml；分装至保存管中，注明细胞名称和日期；降温：冷冻速度-1/min，当温度降至-25 时，可加速冷冻。,4、细胞系的冻存与复苏,概念：以一定的复温速度将冻存细胞恢复至常温。方法：取出冻存管，立即放置于3740 水浴中，快速融化，应在1min内完成；在保护剂存在下，慢冻快融是保存复苏细胞的要领。必须要带护目镜和手套。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,单层贴壁培养 悬浮培养 微囊培养 微载体培养,动物细胞培养,动物细胞培养技术,1、单层贴壁培养,概念：细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层细胞的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。生长过程：接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面；进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,单层贴壁培养特点,培养容器：转瓶、玻璃珠、微载体和中空纤维等。滚瓶是为早期培养所采用，结构简单，投资少，重复性好。优点：容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度；有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。缺点：操作较繁杂劳动强度大检测受到限制培养条件难以均一传质和传氧差占用空间大，产量低，放大培养是瓶颈。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,2、悬浮培养,概念：细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培 养过程。优点：操作简单，培养条件相对均一传质和传氧较好，容易放大培养。缺点：细胞体积小密度低培养病毒易失去标记而降低免疫能力。适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤。借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。培养容器：通气式搅拌和气升式生物反应器,动物细胞培养,动物细胞培养技术,3、微囊培养,微囊培养：在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行悬浮培养。适用于贴壁和非贴壁培养。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,1.4%海藻酸钠溶液,多聚赖氨酸,搅拌式或气升式反应器系统,3、微囊培养,微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体，纯化工艺简单，应用前景广。多聚赖氨酸/海藻酸固定细胞：凝胶载体的表面被多聚赖氨酸覆盖，形成一层多孔可透薄膜，再使凝胶载体液化，便可制成微囊产品的纯度高。杂交瘤细胞与海藻酸钠溶液混合，经微囊发生器，微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，再用柠檬酸去钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞在在微囊内悬浮。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,3、微囊培养,微囊法优点：可防止细胞在培养过程中受到物理损伤能从囊中自由出入半透膜，从而提高细胞密度和产物含量，并方便分离纯化处理。缺点:微囊制作复杂,成功率不高 微囊内死亡的细胞会污染正常产物 收集产物必须破壁,不能实现生产连续化,动物细胞培养,动物细胞培养技术,4、微载体培养,微载体：是指直径在60-250m，能适用于贴壁细胞生长的微珠。特点：微载体的大小：增大单位体积内表面积，对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200m之间。微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。,微载体,动物细胞培养,动物细胞培养技术,微载体培养,概念：细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培养液中的培养过程。优点：细胞生长的环境均一培养基利用率高重复性好减少了劳动强度，容易放大。兼具贴壁和悬浮培养的双重优点 种类：微载体，多孔微载体。应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,原理：是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。,原 理,动物细胞培养,动物细胞培养技术,微载体培养操作要点,培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平，接种细胞至终体积1/3的培养液中。贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。培养维持期：进行细胞计数、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37），重新开始搅拌。收获细胞：微载体培养的放大：,动物细胞培养,动物细胞培养技术,微载体培养操作要点,培养初期 贴壁阶段 培养维持期：收获细胞：排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行,动物细胞培养,动物细胞培养技术,1、分批式操作,已用于搅拌式反应器或气升式反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。分批培养杂交瘤和骨髓瘤细胞的周期为35天，细胞密度达25105/ml。单克隆抗体的产量约10100 mg/L。在大规模搅拌反应器中，细胞密度较低，最终达5106，而在7501500 cm2的转瓶生产中，细胞密度达12108。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,2、流加式操作,最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。通过流加控制，可实现高密度培养。杂交瘤细胞培养，细胞密度可达1.4107，生产抗体的产量比分批操作提高几10倍，可达500 mg/L。由于培养体积不断变化，流加对过程的控制能力仍然有限在实际生产中应用少。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,3、半连续式操作,动物细胞培养生产药物中经常采用。已应用于大规模生产乙肝表面抗原、t-PA等基因工程产物。半连续操作特别适用于分泌表达型细胞，如杂交瘤细胞的培养，尤其是微载体系统。微载体系统培养基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后，反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。该方式操作简单，使细胞密度和产量维持在较高水平，能在较长时间内进行持续生产，反复收获产物，生产效率高，是动物细胞培养生产药物中经常被采用的方式。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,4、罐流操作,概念：是一种细胞被截留在反应器内的连续操作方式。在培养后期不断的加入新鲜培养基，同时以同样的流量排出部分培养基，借助于出口介质过滤把细胞滞留在反应器内的培养方式。是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式。罐流体系的分类 全部截留:100截留细胞，如固定化包埋细胞，可通过中空纤维、平板膜、凝胶颗粒和微囊等实现；部分截留:使用微载体系统、贴壁系统、分离悬浮系统等实现。流化床包埋培养人鼠杂交瘤细胞，整个反应器有效浓度达4108/ml，单位体积产量提高200300倍。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,4、罐流操作,优点：全部截留 大大提高了细胞生长密度和产物浓度。利用培养基，降低细胞代谢废物，细胞生长良好。产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避免了产物的聚合、降解等产量和活性形式的变化，有利于纯化。中空纤维生物反应器、固定床或流化床反应器、膜生物反应器等的唯一可操作方式。缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，由于过滤器容易堵塞，从而限制培养次数。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,2、罐流操作优缺点,提高细胞培养密度，和产物浓度。可控制培养液处于低废物的水平，细胞生长好，延长培养周期。产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避免了产物的聚合、降解等产量和活性形式的变化，有利于纯化。缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，由于过滤器容易堵塞，从而限制培养次数。,动物细胞培养,动物细胞培养技术,第十七章 动物细胞培养 制药工艺,第一节 制药动物细胞的表达与特征第二节 基因工程动物细胞系的构建第三节 动物细胞培养基制备第四节 动物细胞培养技术第五节 培养过程检测与工艺控制,生长环境参数：温度、pH、溶氧、转速、液流量 培养基成分变化参数：葡萄糖消耗率、乳酸生成率、铵离子浓度 生长状态参数：形态变化、活性高低、密度大小 目标产物生产率：产物合成与积累速度，分泌 微生物的污染参数,动物细胞培养,过程检测与工艺,第五节 培养过程检测与工艺控制,动物细胞培养,过程检测与工艺,1、细胞数目与活性的检测,动物细胞培养,过程检测与工艺,离线分析：血细胞计数板或分光光度计，确定反应器中的细胞数目。在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活性控制结合在一起 细胞活性：组织化学染色法和细胞形态的观察检测细胞活性。台盼篮染色排除法，MTT比色分析,2、细胞凋亡,概念：细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。凋亡细胞排斥活体染料，台盼篮不能检测。光学显微镜：直接形态观察凋亡小体 荧光显微镜：荧光染料染色，观察细胞核的形态,动物细胞培养,过程检测与工艺,细胞死亡有两种形式，即凋亡和坏死，其形态学和生化变化完全不同。坏死：细胞受到严重伤害时快速膨胀，染色质凝聚，而死亡，细胞直接裂解，坏死过程不受细胞自主控制。,细菌污染：肉汤培养基于37恒温培养，检查。支原体污染：染色、培养和共培养，至少同时使用两种方法。使用抗生素、卡那霉素、金霉素处理培养物。特异性的支原体血清、高温、支原体去除剂。高温处理，支原体和细胞的耐热性不同，支原体敏感。,动物细胞培养,过程检测与工艺,营养的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的减少为指标 副产物的积累：乳酸和铵离子的增加 近红外测量技术可实现葡萄糖的在线检测 控制铵离子浓度低于2-4mmol/L。乳酸低于60mmol/L,1、基质消耗的检测,动物细胞培养,过程检测与工艺,葡萄糖限量：减少乳酸量，增加葡萄糖的产量系数。谷氨酸限量：减少铵盐和氨基酸的生成。进行双控制（同时控制葡萄糖和Gln），乳酸和铵离将同时减少，使细胞代谢变得有效。生产工艺中，优化二者之间的关系，使之协调。,2、代谢控制,动物细胞培养,过程检测与工艺,搅拌混合：生物反应器提供了均相环境，提高氧及其它营养物质的传递速率，剪切力会对细胞造成损伤。对细胞损伤可用细胞外蛋白浓度来表示，它决定了细胞的裂解程度。细胞内LDH维持一个常数。通过监测LDH释放可评价不同搅拌对细胞的损伤程 度。,1、搅拌剪切的检测,动物细胞培养,过程检测与工艺,1、搅拌剪切的检测,动物细胞培养,过程检测与工艺,搅拌速度与细胞损伤之间的关系是与反应器的结构相关联的，如搅拌速度、叶轮顶部速度、综合剪切因素及Kolmogorov漩涡尺寸等，这些参数还不能用于生物反应器的放大。不同类型细胞对流体力的应答不同，应注意细胞系的特性。不同生物反应器产生不同的细胞应力，细胞能承受的机械应力取决于搅拌桨的形状及其直径和转速、罐体及其直径以及液相比例。根据搅拌转速对细胞细胞损伤的影响，可确定培养基保护添加剂和搅拌桨的伤害作用等。,表面通气反应器：避免漩涡。高速搅拌，安装挡板 填充反应器：无顶部气体空间，消除夹带和气泡破裂 鼓泡反应器：气体从反应器中移走，或使用高径比较大的反应器进行悬浮培养 搅拌和鼓泡反应器：使用剪切保护剂 多微孔载体：用各种搅拌检测，显微镜下检查微载体的机械损伤程度,搅拌反应器的设计,动物细胞培养,过程检测与工艺,动物细胞培养,动物细胞培养技术,思考题,1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？,、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？,、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？,、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？,没有,是,成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理,胰蛋白酶水解蛋白质,细胞间的成份是蛋白质,思考题,、细胞膜的主要成份是什么？,、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？,、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？,蛋白质和磷脂,能,注意时间的控制,不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近,胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛,思考题,11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？,12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？,13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,易于培养细胞贴壁，进行生长增殖,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。,这样的过程叫做传代培养,思考题,11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？,12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？,13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,易于培养细胞贴壁，进行生长增殖,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。,这样的过程叫做传代培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,原代培养,动物细胞培养,细胞增殖,部分细胞无限传代,去掉组织间蛋白,动物细胞培养不能最终培养成生物体,传代培养,