发酵工程第二章-发酵工业菌种的选育课件.ppt

微生物工程工业生产水平的三个决定要素:,生产菌种的性能生产设备发酵和提取工艺条件,优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节。,第二章 发酵工业菌种的选育,2.1 发酵工业常用菌种2.2 发酵工业菌种的分离筛选2.3 发酵工业菌种鉴定2.4 发酵工业菌种改良2.5 发酵工业菌种保藏,2.1.1 微生物的特性,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机 物和无机物满足自身的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,2.1发酵工业常用菌种,2.1.3 已工业化菌种,（一）细菌,单细胞的原核微生物，环状DNA，二分分裂方式繁殖，在自然界分布最广，数量最多。,1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),分布广，常存在于枯草、土壤等，一般为腐生菌；革兰氏染色阳性 能产生大量淀粉酶和蛋白酶，有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。AS1.393 蛋白酶 BF7658-淀粉酶在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含量大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速繁殖；不仅消耗原料蛋白质和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲子发粘发臭，使制曲失败。,2、大肠杆菌(Escherichia coli),可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸的定量分析 基因工程的很好材料,3、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.),革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 可生产乳酸 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作,4、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyleum),芽孢卵形，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭状或鼓槌形 专性厌氧，革兰氏染色阳性 发酵生产丙酮丁醇,5、醋酸杆菌(Acetobacter),不形成芽孢，G，好气性 可生产醋酸 分两群：1）只将乙醇氧化成醋酸 2）将产生的醋酸继续氧化成CO2和水,6、棒状杆菌(Corynebacterium),以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸 的高产菌 如北京棒杆菌AS1.299、钝齿棒杆菌AS1.542,7、短杆菌(Brevibacterium),氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种,8、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),G+、微需氧至兼性厌氧，生长需要缬氨酸和谷氨酸 在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液（20-25C促使形成）可生产葡聚糖 使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌,9、黄单胞菌(Xanthomonas),细胞直杆状，G，无芽孢，极生鞭毛 在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物荚膜多糖，其黄色为一种水溶性色素 野油菜黄单胞菌(X.campestris)可以用淀粉生产黄原胶,10、假单胞菌(Pseudomonas),G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。,（二）放线菌,菌落呈放射状，原核微生物类群，在自然界中分布很广，尤其在有机质丰富的微碱性土壤中较多。大多腐生，少数寄生。产生多种抗生素（12 000余种，60%左右来自放线菌），经济价值大。革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(55%),一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。,1、链霉菌属(Streptomyces),灰色链霉菌(Streptomyces griseus)生产链霉素,金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)生产金霉素,红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)生产红霉素,龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)菌落灰白色，表面后期有皱折，呈龟裂状 生产土霉素,2、小单胞菌属(Micromonospora),与一般放线菌不同，菌丝体长入培养基内，不形成气生菌丝，而在基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端生一个球形、椭圆形孢子。菌落致密，与培养基紧密结合在一起，表面凸起，多崎岖，疣状；菌落常为橙黄色、红色、深褐色、黑色和兰色。可产多种抗生素，如产庆大霉素,3、游动放线菌属（Actinoplanes）,一般不形成气生菌丝，孢囊在培养基内菌丝上形成，孢囊孢子在孢囊内盘卷或呈直线排列；孢子球形，有时端生1-40根鞭毛，能运动。济南游动放线菌(Actinoplanes tsinanesis)产创新霉素(creatmycin;1964),4、诺卡氏菌属(Norcadia),一般无气丝，基丝培养十几小时形成横隔，并断裂成杆状或球状孢子。菌落较小，边缘多呈树根毛状。生产利福霉素、蚊霉素 等,5、孢囊链霉菌属(Streptosporangium),孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢囊孢子，孢囊孢子无鞭毛产多霉素、创新霉素,（三）酵母菌,单细胞真核，主分布于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。,1、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),根据长与宽的比例，分三组：第一组 长宽比为12 细胞多为圆形、卵圆形；主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包第二组 长宽比为2 多供生产葡萄酒、果酒用第三组 长宽比大于2 耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用,啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：上面酵母发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面下面酵母发酵度较低，易凝集沉淀,啤酒酵母的应用非常广，常用于传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母、面包制作，故又称酿酒酵母。,近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白(SCP)、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转化蔗糖，制造酒心巧克力。,2、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum),与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵棉子糖和蜜二糖 葡萄汁酵母常用于啤酒酿造的底层发酵，也可食用、药用或作饲料。,3、汉逊酵母(Hansenula),此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香味，可用于酿酒和食品工业。但由于它能利用酒精作碳源，又能在饮料表面产生干皱的菌膜，所以又是酒精生产的有害菌。,能形成假丝，液体培养时能形成浮膜 可生产SCP、甘油、脂肪酶,4、球拟酵母(Toruiopsis),有些种能产生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。,5、假丝酵母(Candida),6、红酵母(Rhodotorula),有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落 可由菌体提取大量脂肪、-胡萝卜素,7、棉病针孢酵母(Nematspora gossypii),又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作物，如棉花、柑橘、番茄等 该菌具有大量合成核黄素的能力，是核黄素生产的重要菌种,8、毕赤氏酵母(Pichia),能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白，有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖 近年来其在基因工程中的作用日益得到重视,（四）霉菌,1、根霉(Rhizopus),米根霉(Rhizopus oryzae)淀粉酶活力极强，多作糖化酶使用；又由于具有较强的蛋白质分解能力，也可用于制作腐乳。,华根霉(Rhizopus chinentis)是酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。,2、毛霉(Mucor),鲁氏毛霉(Mucor rouxianus)从我国小曲中分离出来；能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用来制作腐乳,总状毛霉(Mucor racemosus)是毛霉中分布最广的一种，几乎在各地土壤中、一些生霉的材料上、空气中都能找到；酒曲中常见 可制作豆豉,3、曲霉(Aspergillus),米曲霉(Aspergillus oryzae)有较强的蛋白分解能力，同时又具有糖化能力 酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生产菌,黑曲霉(Aspergillus niger)具有多种强大的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶等；还能产生多种有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种,4、青霉(Penicillum),产黄青霉(Penicillum chrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸,娄地青霉(Penicillum roqueforti)属不对称青霉，具有分解油脂和蛋白质的能力，可用于制造干酪；该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基酮,展开青霉(P.patulum)又名寻麻青霉，主要用于生产灰黄霉素（一种有效的可口服抗生素，用于治疗真菌性皮肤病、痢疾及灰指甲）,橘青霉(P.citrinum)许多菌系可产生橘霉素，也能产生脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶 有的菌系产生5-磷酸二酯酶，可用它生产5-核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸具有很强的助鲜作用）,5、白地霉(Geotrichum candidum),节孢子单个或连接成链 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很用价值,6、产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen),营养菌丝分隔；分生孢子梗短，大多从气丝上生出；分生孢子从顶端长出后推至侧旁，靠黏液连成假头状，遇水散开,头孢霉素、先锋霉素,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验研究。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌,常用的基因表达系统,原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌,生长迅速、蛋白产量高;,表达蛋白的纯化、分离及分析快速；,外源基因的导入相对容易；,已建立了整套表达理论及技术。,真核细胞表达系统,酵母,生长迅速，营养要求不高，易培养；,安全性好；,比哺乳动物细胞操作简单；,具有一定的修饰蛋白的能力。,2.2发酵工业菌种的分离筛选,菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生物的过程。,菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、生活环境等，设计选择性高的分离方法。,菌种筛选方法 选择性强和灵敏度高，专一性的检测方法。,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,样品采集,预处理,富集培养,菌种初筛,菌种复筛,菌种发酵性能鉴定,菌种保藏,菌种分离,的一般过程,采样原则,样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。极端环境，可能找到适应此环境的微生物。,了解目标产物的性质，可能产目标产物的微生物种类及其生理特征,2.2.1 样品采集,微生物代谢规律,初级代谢产物 细菌 真菌,次级代谢产物 丝状菌 产芽孢细菌,微生物生理特性,微生物营养（C、N需求营养、代谢类型与生长环境的相关性）如：森林土壤 适于利用纤维素为碳源的纤维素酶产生菌。如：肉类加工成、饭店泔水 适于产蛋白酶和脂肪酶的产生菌。,微生物生理特征（与生长环境的相关性）,土样样品采集,土壤有机质含量和通风状况土壤酸碱度和植被状况地理条件季节条件 温度适中 雨量不多,5-25cm,物理方法,2.2.2 样品预处理,热处理方法 减少样品中的细菌数,膜过滤法和离心法 浓缩水中的微生物细胞,化学方法,诱饵法,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 方法。包括控制培养基的营养成分、控制培养条件。,富集的目的：,目标微生物在种群中占优势，使筛选变得可能,当不可能采用定向培养时，则可考虑设计一个在分类学的方法。,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法。,2.2.3 富集培养,定向培养的富集条件,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,定向培养的培养基成分,加入相应的底物作为唯一碳源或者氮源，能分解的菌增加,2.2.4 菌种分离,（1）平板划线分离法（2）稀释分离法（3）简单平板分离法（4）涂布分离法（5）毛细管分离法（6）小滴分离法,菌株在牛奶平板上产生的透明水解圈(0.5%脱脂牛奶，1.5%琼脂粉),季金殿等.一株新的羽毛角蛋白降解菌的分离、鉴定及系统发育分析,http:/,菌株对槐豆胶的降解作用（37,24h）(槐豆胶 2g，琼脂粉 1.5g，MgCl26H2O 0.02g，K2HPO43H2O 0.1g，KNO3 0.05g，蒸馏水100mL，pH 7.0-7.2),角蛋白酶活力（微杆菌属）,-甘露聚糖酶活力（枯草芽孢杆菌）,李 伟.产-甘露聚糖酶菌株的筛选及产酶条件优化的研究,http:/www.bosar-,2.2.5 初筛,（1）平板筛选,初筛,菌株在淀粉平板上产生的透明水解圈(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2),张 新 军.土壤中淀粉酶产生菌的筛选及其发酵条件研究,http:/,淀粉酶活力（双球菌属）,菌株在CMC平板上产生的透明水解圈,纤维素酶活力,菌落选择,从产物角度出发,在培养时以产物的形成，有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,（2）摇瓶发酵筛选,2.2.6 复筛,采用摇瓶培养，一个菌株重复35瓶，培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。,2.3 发酵工业菌种鉴定,菌种鉴定工作,测定一系列必要的鉴定指标,查找权威性的鉴定手册，确定菌种类型,鉴定指标 与微生物的种类有关,微生物鉴定的方法：经典的分类鉴定方法 现代分类鉴定方法 将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定,微生物的技术分成四个不同的水平：细胞的形态和习性水平 细胞组分水平 蛋白质水平 基因或核酸水平,2.3.1 经典的分类鉴定方法,（1）形态学特征,（2）生理生化特征,包括菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊的细胞结构、染色反应等。,包括营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能力、对生长因子的需要、需氧性；对温度、pH渗透压的适应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代谢产物及其与宿主的关系等。,2.3.1 经典的分类鉴定方法,（3）血清学试验与噬菌体分型,生物体外进行不同微生物之间抗原与抗体反应试验血清学试验来进行微生物的分类和鉴定。使用的方法除了凝集反应外，还有沉淀反应（如凝胶扩散、免疫电泳）、补体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等方法。通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或黏液层的抗原性进行分析比较。,2.3.1 经典的分类鉴定方法,（4）氨基酸顺序和蛋白质分析,对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物系统发育的关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。由此，可以根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树并据此进行系统分类。,2.3.2 现代分类鉴定方法,（1）微生物遗传型的鉴定,DNA的碱基组成 DNA的碱基组成和排列顺序决定着生物的遗传性状，分类学上，用（G+C）占全部碱基的质量分数（G+C）来表示各类生物的DNA碱基组成特征。,测定DNA碱基组成的方法：常用的有热变性温度法 浮力密度法 高效液相色谱法。,核酸的分子杂交 不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映这些生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近。,采用较为间接的比较方法核酸杂交 DNA-DNA杂交 DNA-RNA杂交,遗传重组特性分析 染色体之间存在同源性才能发生遗传重组。同源重组还涉及其他因素，因此，不能以同源重组作为唯一的判断标准。,通常具有种属特异性,rRNA序列分析 原核生物16S rRNA和真核生物的18S rRNA的基因序列，根据序列差异计算它们之间的进化距离，画出生物进化树。,（2）细胞化学成分特征分类法,细胞壁的化学组分及分枝菌酸分析；细胞壁的化学组分比较常用的是红外光谱分析法。每种物质都有特定的光谱。这种技术适用于“属”的分类。全细胞水解液的糖型；脂肪酸组成及磷脂成分分析；醌类及多胺类的分析；可溶性蛋白的质谱分析,（3）数值分类法,也叫统计分类法。采用相同的可比特征（形态、生理、生化等），根据相似系数比较。,2.3.3 将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定,中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）http：micronetimaccndatabaseaboutccccmchtml 中国科学院典型培养物保藏委员会（CTCCCAS）http：/中国典型培养物保藏中心（CCTCC）http：/www.cctcc.org 中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）http：chinacicc.org,2.3.3 将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定,中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）http：chinaciccorg美国典型培养物保藏中心（ATCC）http：wwwatccorg。英国国家典型培养物保藏中心（UKNCC）http：wwwuknccCOuk法国巴斯德研究所菌种保藏中心（CIP）http：cippasteurfr德国科赫研究所菌种保藏中心（RKI）http：wwwrkide,菌株选育、分子改造,2.4 发酵工业菌种改良,目的,提高目标产物的产量,提高目标产物的纯度,开发新产品,防止菌种退化,自然选育诱变育种杂交育种 原生质体融合育种基因工程育种,菌种改良方法,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,自然选育虽然突变率很低（10-810-5），但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,2.4.1 自然选育,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变，进行所要求的变异菌种筛选，称为诱变育种。是最常用的菌种改良手段。包括诱变和筛选。,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理：紫外，快中子,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,2.4.2 诱变选育,（2）诱变剂处理过程中几个有关的问题,化学诱变剂使用过程的安全性,诱变剂量的选择,诱变剂的选择,出发菌株的选择,（1）诱变剂的作用原理,用物理、化学、生物方法修改目的微生物基因组，产生突变型。突变率10-610-3。,？,（3）诱变育种的一般步骤,形态,理化筛选,从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。,诱变剂的选择,诱变剂的剂量,出发菌株的准备,诱变,筛选,诱变的时间,（4）诱变育种的筛选方法,平皿快速检测法,高通量筛选,本质是基因重组,2.4.3 杂交选育,杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经杂交方式，使遗传物质重新组合，从中分离筛选出具有新性状的菌株。,营养缺陷型标记A为生物素、苯丙氨酸、甲硫氨酸缺陷，B为苏氨酸、亮氨酸、硫胺缺陷型杂交后基因重组产生营养互补的原养型重组体可在基本培养基上生长。抗性标记有抗逆性温度敏感性标记 其他性状标记 如孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素含量和代谢速度,杂交育种的遗传标记,通过酶解破除细胞壁后制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，这种特殊的杂交方式即原生质体融合。不受双亲亲和力的限制，打破种属间的遗传障碍，获得远缘杂交重组体。,2.4.4 原生质体融合,2.4.5 基因工程育种,（1）基因工程步骤 目的基因的获得；载体的选择与准备；目的基因与载体连接成重组DNA；重组DNA导入受体细胞 重组体的筛选。,（2）基因表达系统 原核表达系统 原核表达系统就是将外源基因导人原核生物，在原核细胞中快速、高效地合成基因产物。到目前为止，这是人类了解最深入、实际应用最为广泛的表达系统。成功地在原核生物中表达外源基因，必须满足一定的条件，包括选择适当的表达载体、外源基因不能含有内含子。真核表达系统 在原核生物中表达真核基因产物，往往会因为翻译后加工过程的缺陷，导致产物失去原有的生物活性。因此人们构建了真核表达系统用于生产真核蛋白。,2.5发酵工业菌种保藏,2.5.1 菌种退化,（1）菌种退化的结果,使微生物个体和群体特征的各个方面发生变化。最重要的是使产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件性能减弱等。,（2）菌种退化的原因,菌种连续传代是加速菌种发生退化的直接原因。使培养物处于旺盛的生长状态、且每次传代时营养和环境条件都是在不断的变化。,菌种的退化是由于微生物细胞内的DNA 结构发生了变化，从而使性状发生相应的变化。菌种的退化的原因为内因和外因两个方面，即自身变化和环境影响。,1）环境条件引起菌种退化,菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身变化的主要原因。微生物细胞在每一世代中的突变机率一般为10-8-10-9，保藏在0-4度时这一突变机率更小，但仍然不能排除菌种退化的可能。,（3）菌种退化的防治,2）菌种自身突变引起菌种退化,及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。,A、配合一定的培养条件，对退化菌株进行单菌落或单细胞分离，淘汰退化的个体，纯化菌种；B、将芽孢杆菌的悬液加热至90度处理数分钟，杀灭已退化的菌体，保留芽孢；再将芽孢或孢子进行传代，以淘汰退化的个体；C、提供特殊的培养条件，使环境有利于优良性状菌株的生长而不利于退化菌株的生长，从而淘汰已退化的菌株个体；D、将分离后得到的初筛菌株先保藏，再进行复筛考察，从中选出稳定性较好的菌种；E、同时应用上述方法的两种或两种以上的方法，会收到更好的复壮效果。,提供良好的环境条件,A、进行合理的传代B、采用优良的保藏方法C、定期纯化菌种,菌种保藏原理,主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。,保藏方法,1、斜面冰箱保藏法 4 C；3-6个月2、沙土管保藏法 产孢子或芽孢微生物，1年3、菌丝速冻法 甘油或二甲基亚砜作为保护 剂，-20 C 4、石蜡油封存法 1年左右5、真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般5年以上6、液氮超低温保藏法-196 C；保护剂；保存期长,安瓿管,国内外重要菌种保藏机构,1、ATCC(American Type Culture Collection)美国标准菌种收藏所，马里兰州，罗克维尔市2、CSH(Cold Spring Harbor Laboratory)冷泉港研究室，美国3、IAM(Institute of Applied Microbiology,University of Tokyo)日本东京大学应用微生物研究所，日本东京,4、IFO(Institute for Fermentation,Osaka)发酵研究所，日本大阪5、普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京6、工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)轻工部食品发酵工业科学研究所，北京,