鞣花酸的电化学研究毕业论文.doc

目 录中文摘要1英文摘要21 引言31.1 鞣花酸的简介31.2 鞣花酸的生理作用31.2.1 鞣花酸的抗肿瘤、抗突变和抗癌性31.2.2 鞣花酸的抗病毒和抗菌活性41.2.3 鞣花酸的抗氧化和自由基清除活性51.2.4 鞣花酸的外周血淋巴细胞保护活性51.2.5 鞣花酸的抗增殖活性61.2.6 鞣花酸的其他生理作用61.3 鞣花酸的制备61.3.1 植物中提取61.3.2 化学合成71.4 鞣花酸在化妆品中的运用71.4.1 与蛋白质、多糖、生物碱的结合能力71.4.2 防晒作用71.4.3 保湿作用81.4.4 抗皱作用81.4.5 美白作用81.5 课题选择的目的、意义及研究思路92 实验仪器、试剂及方法102.1 实验仪器102.2 实验试剂102.3 实验方法113 实验过程123.1 鞣花酸在碳糊电极上大范围扫描123.2 pH值对鞣花酸循环伏安峰的影响133.3 富集时间对鞣花酸循环伏安峰的影响133.4 扫描速率对鞣花酸循环伏安峰的影响133.5 不同扫速下测量鞣花酸A1峰峰电流133.6 不同pH下鞣花酸紫外光谱扫描133.7 鞣花酸的微分脉冲扫描144 结果与讨论154.1 鞣花酸电化学参数的确定154.1.1 pH的选择154.1.2 富集时间的选择154.1.3 扫描速度的选择154.1.3 扫描电位的选择154.2 鞣花酸的电化学表征154.3 小结20谢辞21参考文献22鞣花酸的电化学研究摘 要：鞣花酸(ellagic acid)是没食子酸的二聚衍生物，也是一种多酚二内酯，广泛存在于各种软果、坚果和其它植物组织中。它不仅以游离的形式存在，而且更多的是以鞣花单宁、苷等缩合形式存在于自然界中。鞣花酸单体是一种天然的抗氧化剂，具有抗氧化及清除自由基、抗癌与抗肿瘤、抗增殖和抗病毒等多种对人体有益的作用。因此，天然氧化剂的氧化机理是生命科学和食品科学的重要研究内容并且引起了国内外学者的广泛关注。本文采用循环伏安法(CV)和微分脉冲伏安法(DPV)在石蜡-石墨碳糊电极(CPE)上考察鞣花酸的电化学氧化还原过程。循环伏安法测试表明，鞣花酸在生理pH介质中的电氧化呈现4个氧化峰，可能分别与其4个羟基的氧化相对应。电氧化过程在CPE表面同时受到吸附和扩散作用控制，以扩散为主。第一个氧化峰随扫速变化的关系表明，其第一步氧化过程遵守电化学-化学-化学(ECC)机理具有较强氧化性的氧化中间体通过串联化学步骤先后转化为具有较弱氧化性的次级中间物和没有电活性的最终产物。通过对鞣花酸DPV的测量，得到电分析鞣花酸的线性范围和检测限度等相关信息。关键词：鞣花酸；固体碳糊电极；循环伏安法；微分脉冲伏安法Electrochemical study of ellagic acidAbstract: Ellagic acid, a dimerization derivative of gallic acid, is a polyphenol dilactone. It is widely present in a variety of soft fruit, nuts and other plant tissues. It can not only exist in free form, and more in condensation forms such as ellagic tannins and glycosides. It has various beneficial effects on human health due to its polyphenolic nature with radical-scavenging activity and antioxidant, antitumor, anti-proliferative and antiviral properties. Therefore, the oxidation mechanism of natural antioxidants is an important subject in life science and food science and has attracted extensive attention worldwide. In this thesis, the electrochemical redox process of ellagic acid was studied at paraffin wax-graphite carbon paste electrodes (CPE) using cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV). The electrochemical oxidation of ellagic acid in the physiological pH medium showed four anodic peaks in the CV curves, probably corresponding to the successive oxidation of four hydroxyl groups of ellagic acid. The oxidation process was controlled mainly by diffusion, and to a smaller extent by adsorption. The effect of scan rate on the first oxidation peak showed that the initial oxidation of ellagic acid followed an electrochemical-chemical-electrochemical (ECC) mechanism the oxidation intermediate with stronger oxidizing activity was chemically converted into a next intermediate with less strong oxidizing activity and then to the final product without electrochemical activity. The linear range and detection limit were obtained for the electrochemical detection of ellagic acid by DPV.Keywords: Ellagic acid; Solid carbon paste electrode; Cyclic voltammetry; Differential pulse voltammetry1 引 言1.1 鞣花酸的简介鞣花酸(ellagic acid)又名四羟基联苯二酸二内酯，为没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚类化合物，其分子式为C14H6O8，其结构为1：鞣花酸不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界2。鞣花酸与三氯化铁的显色反应呈蓝色，遇硫酸呈黄色，Greiss-meger反应呈阳性，还易与金属阳离子如Ca2+结合。纯鞣花酸是一种黄色针状的晶体，其熔点大于360，密度为1.67g/cm3。它不溶于醚，微溶于水和乙醇，100mg乙醇中仅能溶解20mg的鞣花酸。鞣花酸可溶解于碱和吡啶。天然的鞣花酸存在于各种软果、坚果等植物组织中3-4。1.2 鞣花酸的生理作用由于鞣花酸及其衍生物广泛存在于植物中，它们普遍具有较低的毒性和较高的生物活性，对其在预防和治疗疾病的研究越来越受到关注5。上世纪90年代开始，就有研究鞣花酸及其衍生物报道，在临床研究中发现，鞣花酸及其衍生物具有较强的生物活性6-7。但在我国，对鞣花酸及其衍生物的研究仅限于对鞣花酸及衍生物的提取、分离、纯化和简单的实际应用的研究，进一步深入的研究目前还未见文献报道。研究发现，鞣花酸有着较强的抗氧化能力，在国外已经被允许作为食品抗氧化剂使用8。1.2.1 鞣花酸的抗肿瘤、抗突变和抗癌性鞣花酸具有较强的抗脂质过氧化、捕捉自由基的能力，可以抑制多环芳香烃、黄曲霉毒素和芳香胺等引发的癌变，啮齿动物试验表明，它能够抑制肺、肝、皮肤及食道等部位由于化学诱导产生的癌变。鞣花酸能和致癌物的活性代谢形式结合成无害的化合物,以使其不能和细胞DNA 结合，其作用相当于致癌物清除剂9-10。Sayer11等研究表明，鞣花酸通过占据苯并芘喃二醇环氧化合物的空间有利位置形成一种共价化合物，此共价化合物由于芘喃的活性基团环氧环已被打开而无致癌活性。此外，鞣花酸对于多环芳香烃二酚环氧化物的诱变作用的抑制活性比阿魏酸、绿原酸及咖啡单宁酸高2个数量级。许多实验都表明鞣花酸具有抗肿瘤和抗突变作用。小鼠和人组织体外和体内实验表明鞣花酸对多种肿瘤都有很好的抑制作用，特别是对结肠癌、食道癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和皮肤癌效果十分显著12-13。此外，鞣花酸也有抑制肿瘤细胞增殖、阻断生长因子信号传导途径、诱导凋亡、抑制NF-B，AP-1和JAK-STAT激活途径、抑制血管生成、抑制抗凋亡蛋白的表达和抑制环氧化酶-2的活性Wendy ASmith14等(1998)发现鞣花酸对乳腺癌有很强的抑制作用，结果显示，通过鞣花酸干扰，150mol/L的叶绿酸，苄基异氰酸酯，奥替普拉，金雀异黄素能使DBP(肽酸二丁酯)DNA加合物降低75以上，因此鞣花酸可能通过与酶无关的途径抑制DBP-DNA加合。鞣花酸可能的抗癌机理包括以下四种15-17：抑制致癌剂的代谢活性，鞣花酸可以抑制多环芳香类化合物如苯并吡喃，亚硝基化合物如N-亚硝基苄基甲胺和黄曲霉素B1转换成诱导基因的物质；解除致癌物的毒性，通过动物实验，鞣花酸可以通过刺激体内一些酶的活性比如GST而解除某些致癌剂如苯并芘的毒性；清除致癌物，鞣花酸可以与致癌剂的活性代谢物结合形成无害的化合物，从而使得致癌剂不能与细胞DNA结合；占据DNA上可能与其它致癌物或其代谢物反应的位点，鞣花酸通过与鸟嘌呤O6位置的反应可以阻止它的甲基化。从而抑制N-甲基N-亚硝基脲和鲑鲸DNA结合。尽管在很多研究中鞣花酸都表现出具有抗化学诱变致癌的作用，但是也有文献18-19对它的抗癌作用甚至对它的DNA加成化合物的形成提出了疑义。Hayatsu20等认为，鞣花酸的4个羟基团有较强的亲核性，易与生物体内的亲电子代谢物发生较强的亲核作用，而亲电子代谢物不能与DNA发生反应，因而这种亲核作用可能会将鞣花酸从生物体内移走，从而阻碍鞣花酸起抗癌作用。另外，食物中的鞣花酸在体内的吸收也是有限的。例如，给小鼠口服鞣花酸发现只有少量被吸收，这就阻止了机体组织与足够高浓度的鞣花酸接触而使之不能有效的作为一种体内抗癌剂。1.2.2 鞣花酸的抗病毒和抗菌活性鞣花酸对人类HIV，HBV，小鼠疱疹病毒，鸟的成髓细胞瘤的逆转录病毒都有抑制作用。Euu Hwa Kang21等用C57ML/6小鼠即在金属离子诱导作用下产生的HBeAg转基因小鼠(HBeAg-Tg)。C57ML/6和HBeAg-Tg在T-淋巴细胞和B-淋巴细胞水平上对HBeAg有耐受性，在体内和体外都不产生相应的抗体，只产生了微量的细胞因子，减小了细胞毒性。淋巴细胞免疫应答反应。当用鞣花酸以5mg/kg体重的量灌喂小鼠，能有效地阻止由HBeAg引起的免疫耐受性。Blumenberg22发现每天给老鼠喂食剂量为50mg/kg的鞣花酸，45天后仍没有对老鼠表现出显著的毒性。而Girolami23发现静脉注射剂量为0.2mg/kg的鞣花酸对人体无毒害作用。鞣花酸对不同种类的细菌对有很强的抑制活性，它可以保护伤口免受入侵细菌的感染，也可抑制溃疡。B.Thiem24等研究了鞣花酸的抗菌活性，实验结果表明鞣花酸具有中等的抗菌活性。1.2.3 鞣花酸的抗氧化和自由基清除活性鞣花酸中含有四个酚羟基，它们很容易被氧化，因此鞣花酸可以保护其他物质免被氧化25。在哺乳动物中，鞣花酸对线粒体和微粒体中的脂质体过氧化具有很好的抑制作用。利用鞣花酸的抗氧化活性，它不仅可以有效地抑制丝裂霉素和过氧化氢对人体细胞的损伤，还能抑制多种致癌剂如多环芳香类化合物的形成，因此它广泛应用于食品和医药领域。Anup Sricastava26等研究表明，鞣花酸对DPPH自由基有很好的清除作用，并且呈现出浓度依赖关系。若从IC50值来判断，它的自由基清除活性与槲皮素相当，比叔丁对甲氧酚强。IC50表明鞣花酸对超氧自由基的清除活性的也比槲皮素高，而叔丁对甲氧酚没有超氧自由基清除活性鞣花酸也是一种优良的羟基自由基和氧化亚氮清除剂。此外，鞣花酸对微粒体脂质过氧化的抑制活性比槲皮素和叔丁对甲氧酚都高得多。它的金属离子螯合活性也呈浓度依赖关系。总之，从D. Hamiltonii27分离出来的鞣花酸表现出了良好的抗氧化活性，其抗氧化活性与槲皮素和叔丁对甲氧酚相当或者更高。1.2.4 鞣花酸的外周血淋巴细胞保护活性鞣花酸是一种天然多酚，可以在体外保护小鼠外周血淋巴细胞免受尼古丁诱导的细胞和DNA损伤。Adluri Ram Sudheer等研究了它对尼古丁诱导的小鼠外周血淋巴细胞的保护作用。实验结果显示在尼古丁对照组中用鞣花酸处理后脂质过氧化指数，DNA损伤程度，核小体数量都有显著的提高。在尼古丁对照组中不再具有抗氧化活性，而用鞣花酸处理后又可以使其恢复抗氧化活性，其抗尼古丁毒性与N-乙酰基半乳糖相当。鞣花酸和N-乙酰基半乳糖在它们的有效剂量时对正常淋巴细胞不产生任何损伤。以上结论表明鞣花酸今后可以被开发用来作为尼古丁诱导的基因毒性调节物。1.2.5 鞣花酸的抗增殖活性鞣花酸具有一定的抗增殖活性，Jack N.Losso等通过研究鞣花酸对人脐静脉内皮细胞的抗增殖活性。结果表明，用鞣花酸处理正常孵育的细胞后，ATP的生物发光强度增强了约18.21。相反，浓度为1.1009mol/L的鞣花酸在重建的细胞外基质中能抑制HUVEC管的形成和增殖，同时鞣花酸也显示了对结肠癌，乳腺癌和前列腺癌细胞株的抗增殖作用28。1.2.6 鞣花酸的其他生理作用鞣花酸与金属的络合物具有止血的功能，可作为止血剂使用，临床上也可以用它来分离血浆。另外，鞣花酸已被应用于血液凝血因子的研究以期发现影响凝块或血栓的形成因素。此外，鞣花酸还具有镇定剂和降压剂的功能。在哺乳动物体内，鞣花酸和它的衍生物对线粒体、微粒体中的脂质化合物的过氧化具有很好的抑制效果。在农业上，鞣花酸能抑制昆虫的生长，当其浓度为147ppm时即可达到50的昆虫生长抑制率，这使得鞣花酸有望成为一种安全的生物农药。1.3 鞣花酸的制备由于鞣花酸不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界29。所以在自然界中存在含有鞣花酸的物质，可以通过对含有鞣花酸的物质进行提取来制备鞣花酸。鞣花酸也可以直接合成得到。1.3.1 植物中提取在自然界中，葡萄、乌桕、红木莓等物质中均含有鞣花酸，因此可以从这些物质中提取出少量的鞣花酸。葡萄压榨成汁，长期放置会形成黄色或红色的结晶沉淀，沉淀经膜过滤器过滤后悬浮于水中，悬浮液再次过滤，并用水和甲醇洗涤除去杂质，最终得到产物鞣花酸；乌桕枝条经风干粉碎后，用85的工业乙醇回流提取，合并浓缩液并溶于水，依次用正丁醇、乙酸乙酯萃取，最后得到的乙酸乙酯萃取液以氯仿一丙酮混合溶剂为淋洗剂，反复经硅胶柱层析淋洗，得到8种鞣花酸及其衍生物的组分。从上述物质提取均可得到高纯度的鞣花酸，但是由于受原料中鞣花酸含量的限制，而且工业流程相对复杂，所以实际意义不大30。1.3.2 化学合成鞣花酸可以通过鞣花单宁的分解得到，鞣花单宁在加热条件下酸解、纯化得到鞣花酸，此种方法的产率相对较高(约40)。然而原料的酸解过程需要在高温下进行，存在危险因素。且耐酸设备价格昂贵，不宜工业化生产；鞣花酸也可以通过没食子酸和没食子酸酯在过氧化物酶的氧化作用下制取，但由于原料没食子酸或没食子酸酯的制备过程比较复杂，且过氧化酶催化剂也需要精制纯化，因此目前较少用这类方法进行鞣花酸的生产；以五倍子为原料，加入适当蒸馏水在65左右浸取得到单宁酸。单宁酸经碱化、氧化、酸化处理最终得到产物鞣花酸。研究表明，五倍子中单宁酸质量约为70，即以五倍子为原料，鞣花酸产率可到35左右。我国五倍子资源丰富，利用五倍子制备鞣花酸具有十分重要的意义31。1.4 鞣花酸在化妆品中的运用32-33鞣花酸具有独特的化学和生理活性，在护肤品中可起到多重效果，如抗氧化、抗衰老、抗紫外线增白及保湿。因此，对多种因素造成的皮肤老化(皱纹和色素沉着)都有独到的功效。鞣花酸是植物多酚的一种，它也具有植物多酚的一些共性。1.4.1 与蛋白质、多糖、生物碱的结合能力植物多酚与蛋白质疏水键和氢键方式发生复合反应，使人的肌肤产生收敛，故通常称其收敛性。人们在化妆品中采用植物多酚最直接的原因在于其收敛性。这一性质使含多酚的化妆品在防水条件下对皮肤有很好的附着能力，并且可使粗大的毛孔收缩，使松弛的皮肤收敛、绷紧而减少皱纹，从而使皮肽显现出细腻的外观。多酚的收敛作用还可减少油腻性皮肤的过度分泌，除用于护肤品外，还用于洗发水的配制，对油性发质表现出良好的去污效用。同时多酚也可用作抑汗剂，它接触皮肤后可使汗腺收敛抑制排汗，从而达到减少汗液分泌。1.4.2 防晒作用适当日光照射是维持人体健康的必要条件，但经日曝晒，阳光中的紫外线就会使皮肤出现灼痛红肿，甚至出现红疹、皮炎，还有皮肤癌等病症，过度的日晒也是皮肤老化的一个主要外因。因此防晒剂已经成为化妆品中重要的一类产品。防晒剂大致可分为物理性的紫外线屏蔽剂和化学性的紫外线吸收剂两大类。一般有机类防晒剂皆属于后者。目前已经有多种防晒剂被开发利用，例如氨基苯甲酸类、水杨酸脂类、对甲基肉桂酸脂类、二苯酮及其衍生物等。这些防晒剂中的大多数为油溶性化合物，其中一些品种对皮肤有局部刺激性。因此，从天然产物中筛选具有紫外线吸收作用的水溶性防晒剂具有重要意义。而鞣花酸这一植物多酚正属于这样一类化合物。多酚是一类在紫外线光区有强吸收的天然产物，且对人体无毒性。1.4.3 保湿作用保湿剂是为了保持皮肤的娇嫩润滑，需要在皮肤表面使用能与水结合的保水物质，使角质层保湿，延缓和阻止皮肤内水分挥发。鞣花酸这一植物多酚即是一种具有保湿作用的天然产物，因其分子中含有多元醇结构，可使空气中吸嘲；同时，鞣花酸的保湿还在于具有透明质酸酶的抑制活性，从而达到护肽品中真正生理上的深层保湿作用。1.4.4 抗皱作用皮肤老化表现在皮肤弹性下降、松驰、粗糙、皱纹、老年斑等现象。从生理上看，主要涉及皮肤蛋白质和结缔组织的交联和降解两类反应。活性氧自由基是交联的一个主要因素，抗氧化剂通过消除自由基起抗皱作用，蓓酸脂肪酸脂有显著抑制皱纹形成作用。若加入金缕梅或丹皮提取物复配则加强抗皱作用。多酚对胶原酶和弹性蛋白酶有抑制作用，可阻止弹性蛋白的含量下降或变性，维持皮肤弹性及防皱作用。1.4.5 美白作用决定皮肤色调的因素主要是皮肤内的黑色素，肤色的深浅主要决定于黑色素细胞合成黑色素的能力。黑色素的形成过程是：首先由氨基酸之一的酪氨酸作为基质在酪氨酸酶的作用下转化为多巴，再转化为多巴醌的代谢过程。酪氨酸酶在黑色素的合成中起到非常重要的作用。基于抑制酪氨酸酶效果明显，能够控制黑色素合成，不少酪氨酸酶抑制剂被提议做成皮肤美白剂。迄今已尝试使用过过氧化氢、过氧化锌、过氧化镁等化学药品，抗坏血酸、谷胱甘肽、胶态硫等天然物质作为有效成分的美白化妆品，但是这些有效成分过多，使得安全性和稳定性不充分，或者在增白方面还不能说是足够明显的。1996年，在日本，鞣花酸首次作为预防晒伤后产生斑点的活性物质使用。它能淡化雀斑，并且对过度暴晒在紫外线下的皮肤进行修复。鞣花酸是2004年3月经世界卫生组织公布核准的新美白成分。它是一种很有前景的美白添加剂。1.5 课题选择的目的、意义及研究思路由于鞣花酸及其衍生物广泛存在于植物中，它们普遍具有较低的毒性和较高的生物活性，对其在预防和治疗疾病的研究越来越受到关注。上世纪90年代开始，就有研究鞣花酸及其衍生物报道，在临床研究中发现，鞣花酸及其衍生物具有较强的生物活性。但在我国，对鞣花酸及其衍生物的研究仅限于对鞣花酸及衍生物的提取、分离、纯化和简单的实际应用的研究，进一步深入的研究目前还未见文献报道。鉴于鞣花酸对人体健康的积极作用，急需强化对鞣花酸氧化还原机理的研究及建立有效的抗氧化性强弱评价机制。因此本文着重探讨鞣花酸的抗氧化性和氧化机理。本课题的研究思路：(1) 通过循环伏安法(CV)和微分脉冲伏安法(DPV)测试富集时间、富集电势、pH、浓度等因素对鞣花酸伏安行为的影响。(2)通过循环伏安法对不同pH的鞣花酸的电化学行为进行研究，并通过紫外光谱法和进一步计算得到鞣花酸的电离常数。2 实验仪器、试剂及方法2.1 实验仪器表2.1 实验所用仪器仪器名称型号厂商电化学工作站CHI660C上海辰华仪器公司分析天平TG328A上海精密科学仪器有限公司酸度计pHS3T上海大中分析仪器厂自动双重纯水蒸馏器SZ93上海亚荣生化仪器厂冰箱美菱BCD-186SN合肥美菱冰箱厂超声波清洗器HS2060A天津市恒奥科技发展有限公司2.2 实验试剂表2.2 实验所用试剂药品名称化学式规格 生产厂家鞣花酸C14H6O898%华威锐科氢氧化钠NaOH分析纯AR中国国药集团上海化学试剂厂硼酸H3BO3分析纯AR合肥工业大学化学试剂厂氯化钾KCl分析纯AR中国国药集团上海化学试剂厂乙酸 (冰醋酸)CH3COOH分析纯AR中国医药集团上海化学试剂厂磷酸H3PO4分析纯AR中国国药集团上海化学试剂厂无水乙醇C2H5OH分析纯AR上海化学试剂厂石墨C光谱纯SR中国医药集团上海化学试剂厂石蜡分析纯AR上海化学试剂厂2.3 实验方法本实验采用循环伏安法(Cyclic Voltammetry)和微分脉冲伏安法(Differential Pulse Voltammetry)对鞣花酸进行电化学研究。循环伏安法是一种常规的电化学测试方法，通过观察曲线的形状和改变测量参数得到发生电化学反应的个数和可逆程度，氧化还原峰的对应关系，电极表面微观反应过程及偶联化学反应等多方面信息，对于电极反应参数、控制步骤和反应机理的判断都起到了一定的作用。微分脉冲伏安法是在电极上施加阶梯波基准电势和一系列短的电势脉冲波形的叠加信号，测量极化电极上由脉冲电压所产生的法拉第脉冲电流随直流电势变化的关系。该方法因其具有高灵敏度、操作简便等优点已经作为检测浓度的有效方法之一，被广泛应用于衡量物质的分析工作中，常常比大部分色谱方法及原子吸收光谱法等方法更灵敏。将不同pH下的鞣花酸置于紫外光谱下扫描，将紫外光谱曲线经过进一步拟合可以算出鞣花酸的两个电离常数，从而可验证鞣花酸的一些其他性质。3 实验过程3.1 鞣花酸在碳糊电极上大范围扫描图3.1 CPE电极示意图分别称取比例为5 : 2的石墨粉和固体石蜡，在表面皿中加热混匀并调成糊状备用。截取直径约为2.5 mm的圆柱形铜棒，将它的一端用金相砂纸打磨光滑；然后插入一根长度适当，内径较铜棒直径稍大的聚乙烯管中，使铜棒和管壁紧密接触，入口端用胶封口。当铜棒进入管内距管的另一端仅余下2mm中空长度时，将上述碳糊填入中空端，使碳糊均匀紧密的嵌入其中，放置冷却后用金相砂纸将填充碳糊一端打磨成镜面。注意的是，上述方法制备的新电极在使用前要用乙醇超声清洗数秒，使用过的电极每次先在氢氧化钠中清洗，再用二次水冲洗，并用滤纸吸干电极表面水分。采用纯乙醇作为溶剂，配制浓度为5 × 10-4mol/L鞣花酸母液，储存于4的冰箱中备用。用pH为7.4的B-R缓冲液(B-R缓冲液的配比为2.71mL的85%正磷酸、2.47g硼酸和2.36mL冰醋酸混合，用水和乙醇体积比为4:1的混合溶液定容至1000mL容量瓶中，初始pH值为1.8，通入氮气15分钟来除去氧，并用低浓度NaOH溶液调节其pH值)来稀释鞣花酸母液，配制浓度为5 × 10-5mol/L的鞣花酸子液10mL，并以0.5mol/L的KCl作为支持电解质。所用的B-R缓冲溶液和NaOH溶液均是用20%的乙醇和80%的二次水的混合溶液作为溶剂，NaOH的浓度为1mol/L。在三电极体系(工作电极为自制石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极)下用循环伏安法在1mol/L的NaOH中扫50圈，扫速设定为100mV/s。在三电极体系中测鞣花酸子液大范围电势的循环伏安曲线，扫速设定为50mV/s，静置时间初步设定为30s，扫描一个周期。3.2 pH值对鞣花酸循环伏安峰的影响用NaOH溶液来调节B-R缓冲液的pH，分别配制pH值为1.8、3.3、5.0、7.4、8.4、9.4、10.4和11.4的B-R缓冲液。然后用不同pH的B-R缓冲液稀释鞣花酸母液至5 × 10-5 mol/L，加入0.5 mol/L的KCl作为支持电解质，各配制10 mL。将工作电极在NaOH溶液中循环伏安法清洗后，在三电极体系中测不同pH的鞣花酸子液的循环伏安曲线，电势范围根据峰位置的改变而改变，扫速设定为50 mV/s，扫描一个周期。每次测量之后均在NaOH溶液中用循环伏安法清洗50圈。3.3 富集时间对鞣花酸循环伏安峰的影响将工作电极在NaOH溶液中循环伏安法清洗后，在三电极体系中测pH = 7.4的鞣花酸子液不同富集时间的循环伏安曲线，电势范围设定为-0.2V 0.8V，扫速设定为50 mV/s，富集时间分别为0s、30s、60s、90s、120、150s、180s、210s、240s和270s，扫描一个周期。每次测量后均在NaOH溶液中循环伏安法清洗。3.4 扫描速率对鞣花酸循环伏安峰的影响将工作电极在NaOH溶液中循环伏安法清洗后，在三电极体系中测量不同扫描速率对鞣花酸循环伏安峰的影响，富集时间设定为30 s，扫描速率分别设定为1、2、5、10、20、50、100、200、400、700和1000 mV/s，扫描一个周期。每次测量后均用NaOH溶液循环伏安法清洗电极一次。3.5 不同扫速下测量鞣花酸A1峰峰电流在三电极体系中测量pH=7.4，浓度为5 × 10-5 mol/L的鞣花酸子液。扫描电势随鞣花酸A1峰位置的改变而改变。富集时间为30s，扫描速率分别设定为1、2、5、10、20、50、100、200、400、700和1000 mV/s，扫描五个周期。每次测量后均NaOH溶液循环伏安法清洗电极一次。3.6 不同pH下鞣花酸紫外光谱扫描用NaOH溶液来调节B-R缓冲液的pH，分别配制pH值为1.8、3.3、5.0、7.4、8.4、9.4、10.4和11.5的B-R缓冲液。然后用不同pH的B-R缓冲液稀释鞣花酸母液至1 × 10-5mol/L，各配制10mL。以20%乙醇的水溶液来校准光谱曲线，然后测量不同pH下鞣花酸子液的紫外光谱，波长范围设定为200 nm 400 nm。3.7 鞣花酸的微分脉冲扫描配制B-R缓冲液的pH值为7.4，配制浓度分别为5 × 10-5，3 × 10-5，1 × 10-5，7 × 10-6，5 × 10-6，3 × 10-6，1 × 1 0-6，7 × 1 0-7mol/L等系列浓度的鞣花酸子液。在三电极体系下采用脉冲微分伏安法扫描，鞣花酸子液浓度配制直到检测不出鞣花酸的脉冲伏安峰的浓度为止。脉冲扫描的参数设置为电势增量5 mV，脉冲幅度50 mV，脉冲宽度50 ms，采样宽度40 ms，脉冲周期100 ms，静置时间30 s。4 结果与讨论4.1 鞣花酸电化学参数的确定4.1.1 pH的选择本次实验的目的是研究鞣花酸的一些电化学特性，基于鞣花酸主要作为人体的抗氧化剂和对人体抗癌具有一定作用的一种物质，所以在研究鞣花酸的电化学特性时选择人体的生理pH值7.4。4.1.2 富集时间的选择在pH=7.4的鞣花酸溶液中，用循环伏安法研究了鞣花酸在碳糊电极上富集时间对鞣花酸峰及峰电流的影响。实验结果表明，峰电流随富集时间的增大先增大后减小，最后趋于稳定。但每个峰趋于稳定的富集时间不同，为了方便研究以及减少实验误差，富集时间均采用30s。4.1.3 扫描速度的选择在pH=7.4的鞣花酸溶液中，用循环伏安法研究了鞣花酸在碳糊电极上扫描速度对鞣花酸峰电流的影响。实验结果表明，鞣花酸的循环伏安图在扫速较大时，峰形发生了改变，鞣花酸的第二个峰会逐渐消失。在50 mV/s以下，峰形没有改变。所以本次实验采用50mV/s的扫描速度。4.1.3 扫描电位的选择通过大范围电势扫描得到鞣花酸的峰电位在0.3V 0.7V之间，扫描的终止电位设定为0.8V。由于扫描电位范围设定的越大，测定干扰会越大。因此本次实验电位扫描的范围控制在-0.2V 0.8V。4.2 鞣花酸的电化学表征图4.1为碳糊电极在pH=7.4和浓度为5 × 10-5mol/L鞣花酸溶液中于-0.2V0.8V电势范围内的循环伏安扫描图。从鞣花酸的循环扫描曲线可以看到，鞣花酸在0.3V0.7V之间出现四个明显的氧化峰，为鞣花酸上的四个酚羟基发生不可逆氧化产生的。图4.1 鞣花酸在碳糊电极上的循环伏安图(pH=7.4，CEA=5 × 10-5mol/L，v=50mV/s)图4.2是以碳糊电极作为工作电极，在pH=7.4和浓度为5 × 10-5mol/L鞣花酸溶液中，在-0.1V0.9V电位区间内在不同扫速下的循环伏安扫描。从图中可以看出峰电流随扫速的增加而增加。扫速增大到100mV/s时，峰形发生了改变。将鞣花酸第一个峰的峰电流(扣除背景电流)分别对扫速的一次方、扫速的对数作图，可以发现在低扫速(50 mV /s)下，峰电流和扫速的二分之一次方呈现出良好的线性关系(图4.3)，说明在低扫速下碳糊电极受扩散控制，主要是由溶液中的反应物鞣花酸向电极表面扩散并在电极上发生反应；在高扫速(100 mV /s)下，峰电流的对数和扫速的对数的关系为y=a + bx，经过计算后得到该函数的斜率和截距分别为a=-0.58646 ± 0.02286，b=0.55031 ± 0.01209(图4.4)。其中，其斜率接近于0.5说明在高扫速下碳糊电极主要受吸附控制，主要是吸附的电极表面的鞣花酸发生反应，溶液中的鞣花酸尚来不及消耗而形成显著的浓度差。图4.2 不同扫描速率下鞣花酸在碳糊电极上的循环伏安图(pH=7.4，CEA=5 × 10-5mol/L, 扫速1，2，5，10，20，50，100，200，400，700，1000mV/s)图4.3 峰电流与v1/2的关系 图4.4 峰电流对数和扫描速率对数的关系图4.5为鞣花酸A1峰在1000mV/s的扫速下的循环伏安图，然后以C1峰电流与A1峰电流之比对扫速作图得图4.6。从图4.6中可以看出该直线的斜率为0.55接近于0.5从图中可以看出，还原峰与氧化峰的电流比随着扫描速度的增加逐渐增大，并有趋于1的趋势。因此，鞣花酸的A1峰的氧化过程为EC机理(电化学-化学机理)：在低扫速下，在A1下直接生成的不稳定氧化产物有充足的时间发生化学转化，生成相对稳定的物质，保留到逆向阴极峰下C1被还原的不稳定氧化产物的量很少，阴极峰电流很低甚至为零。随着扫速增大，扫描在更短的时间内从A1到达C1峰，不稳定氧化产物更多地在C1峰下被还原，C1峰对A1峰的电流比增大。 图4.5 1000mV/s下鞣花酸的循环伏安曲线 图4.6 C1峰/A1峰与扫速的关系然后将第二对氧化还原峰比A1峰对扫速分别作图，得图4.7。从图中可以看出A2/A1和C2/A1均随着扫速的增加先增大后减小。图4.7 第二对氧化还原峰对A1峰电流比与扫速的关系因此我们推测鞣花酸可能的氧化机理为：鞣花酸在峰A1下发生电氧化后，生成了极为活泼的氧化产物EAO1，紧接着发生两步化学转化，先后变成较为稳定的氧化产物EAO2和稳定氧化产物EAO3，其中第二步化学转化的速率较慢。在很低的扫速下，扫描从A1到C1再到C2的时间较长，EAO1大多通过化学转化变为稳定产物EAO3，所以C1、C2和A2对A1的电流比都很低。随着扫速加快，化学转化为EAO3的时间缩短，EAO1和EAO2更多地得以留存，分别到C1和C2峰下被还原，使C1、C2和A2对A1的电流比都增大。但随着扫速进一步加快，EAO1来不及较多地转化为EAO2，就已在C1下被还原为EA，所以C1对A1的电流比继续增大，而C2和及其对应的A2对A1的电流比反而降低。图4.8 不同pH下鞣花酸的紫外光谱图(cEA=1 × 10-5 mol/L，v = 20 mV/s，pH=1.8、3.3、5.0、7.4、8.4、9.4、10.4、11.5)图4.8为不同pH下鞣花酸的紫外光谱曲线，从图中可以看出在pH值低于7.4时，鞣花酸的紫外光谱曲线在255nm和366nm处有两个峰，而当鞣花酸在碱性条件下测量时，255nm处的峰发生分裂。因此我们可以推论在酸性条件下，鞣花酸主要是以质子化鞣花酸形态存在，碱性增加时鞣花酸子液发生了去质子化现象，溶液中主要是以质子化和去质子化两种形态存在。当碱性过强，则鞣花酸完全发生了去质子化，吸收峰的位置右移。根据所测得的鞣花酸紫外光谱曲线上的等吸收点可进一步通过拟合得到鞣花酸的pKa值。通过微分脉冲伏安法检测到鞣花酸溶液的浓度检测范围为1 × 107mol/L 7 × 106 mol/L，通过峰电流对浓度作图得到其线性方程为i/A = 0.0251 + 0.7899(c/mol/L) (R = 0.99845)。微分脉冲法对鞣花酸浓度的最低检测限为1 × 107mol/L，当浓度为5 × 108 mol/L则几乎不能检测出电流峰信号(如图4.9)。 图4.9 不同浓度鞣花酸的DPV图(CEA(1®13): 5 ´ 108， 7 ´ 108，1 ´ 107， 3 ´ 107，5 ´ 107， 7 ´ 107，1 ´ 106，3 ´ 106， 5 ´ 106，7 ´ 106， 1 ´ 105，3 ´ 105， 5 ´ 105 mol/L.)4.3 小结(1) 采用CPE为工作电极进行鞣花酸的循环伏安测试，鞣花酸出现四个阳极峰 和两个阴极峰 (C1和C2)，C1峰和C2峰的峰电流都很低，表明鞣花酸氧化的可逆程度很小。电解液pH值对各个峰的峰电流和峰电势的影响表明