环磷酸腺苷高产菌落研究生物工程毕业论文定稿.doc

学院2014届本科毕业论文论文题目：环磷酸腺苷高产菌落研究学生姓名：所在院（系）：生物工程系所学专业：生物工程专业导师姓名：完成时间：2014年3月15日环磷酸腺苷高产菌落研究（学院生物工程系104班）摘 要微生物发酵法合成环磷酸腺苷（cAMP）高产菌种是关键，本文采用高效液相色谱法测定不同菌落发酵液中环磷酸腺苷的含量筛选出cAMP高产菌落。通过活化不同节杆菌，挑选单菌落，分别编号1至6后移种进行发酵，发酵结束后用高效液相色谱法测定发酵液中cAMP含量,结果6号菌落发酵液中cAMP含量最高为2.8957mg/ml，其次为4号菌落，环磷酸腺苷含量为2.5057 mg/ml。本实验初步筛选出环磷酸腺苷高产菌落为6号菌落；同时也发现在实验中无菌操作是否规范、能否避免染菌是我们实验成败的关键。关键字：环磷酸腺苷，节杆菌，发酵，高效液相THE EFFECT OF：Using high performance liquid Cyclic adenosine phosphate high-yield strains screened( School, Department of Biological Engineering，Class 104)ABSTRACTMicroorganism fermentation was synthesized adenosine monophosphate (cAMP) high yield strain is the key, this paper adopts high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining the content of central adenosine phosphate of different colonies fermented liquid screened cAMP high-yield colony. Through activation of different section, select single colony, number 1 to 6 back kind of ferment, respectively after fermentation cAMP content in the fermented liquid by high performance liquid chromatography (HPLC) method, the results 6 colonies cAMP content in the fermented liquid up to 2.8957 mg/ml, followed by colony, 4 cyclic adenosine phosphate content is 2.5057 mg/ml. This experiment preliminary screening cyclic adenosine phosphate high-yield colony for 6 colonies; Also found in the experiment of sterile operation whether standard, whether to avoid dye bacterium is key of success or failure in our experiment.Key words: Cyclic adenosine monophosphate, Arthrobacterium ,Biological Fermentation，HPLC目 录1引言：11.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能11.2环磷酸腺苷生产机制22.材料与方法32.1实验材料32.2实验仪器32.3实验方法32.3.1培养基32.3.2移种与接种32.4高效液相检测环磷酸腺苷含量42.4.1色谱测定条件42.4.2样品处理42.4.3标样的配制42.4.4标样的线性关系52.4.5标准曲线绘制53.实验结果与分析53.1实验结果53.1.1摇瓶发酵各参数测定53.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量63.2结果分析及讨论124结论13参考文献14致谢:15环磷酸腺苷高产菌落研究李成喜（新科学院生物工程系104班）1引言：环磷酸腺苷是核苷酸类药物, 在临床上,主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死, 尤其适用于对洋地黄类强心药中毒或不敏感的患者1。同时cAMP 是机体代谢的重要调节因子，其广泛参与酶活性调节、基因表达以及细胞增殖与分化等，因而备受关注。上个世纪五、六十年代起, 国外就陆续有文献报道环磷酸腺苷的合成。但传统的cAMP以化学合成为主，生产成本高，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用2。现在也有从大枣中提取，原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低。本研究利用节杆菌通过微生物发酵生成cAMP，具有很大发展前景3。环腺苷酸( Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)是由 E. W. Sutherland 于 1957最早从哺乳动物组织中发现的，并于1958年分离出环腺苷酸。Sutherland也因发现 cAMP 于 1971 年获得生理和医学诺贝尔奖4。之后，人们相继从植物和微生物中发现了环腺苷酸，并证明二者是生物界普遍存在的两种生物活性物质。世界各国的研究人员通过对 cAMP 大量的研究, 结果表明cAMP 在很多领域中起着重要的作用。所以 cAMP的生产和检测是十分重要而且必要的。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography ,HPLC）分析cAMP 含量不仅简便快速, 而且选择性好、准确度高。1.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能环磷腺苷，即： 腺嘌呤核苷 - 3，5- 环磷酸酯, 简称cAMP，是由单核苷酸 AMP 分子中的磷酸与核糖形成 3'，5'环式结构（见图 1）其分子式为:Cl0H12N5O6P，水合物为类白色或淡黄色结晶，微溶于水，不溶于乙醇或乙醚熔点为219 220 (分解)，比旋度为51.3°(C = 0.67)；它对酸、碱、热都相当稳定，是当前分子生物学研究的热点之一3,4。cAMP 是人体中的一种重要生物活性物质，它在细胞内外快速双向流动，细胞内产生的 cAMP 可透过细胞膜进入体液中，胞外的 cAMP可被细胞摄取。同时环磷酸腺苷酸也是细胞内传递激素和递质的中介因子，并作为第二信使参与多种生理生化过程的调节，在蛋白质的合成过程中, 基因的转录和翻译都受到 cAMP 的影响。环磷酸腺苷也可作为药物中间体制备二丁酰环磷腺苷和环磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。环磷酸腺苷还可用于畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。因此,研究工作和医学临床试验均需大量的 cAMP。图1 环腺苷酸结构式1.2环磷酸腺苷生产机制环磷酸腺苷的合成主体上可分为两大类，一是通过化学法合成；二是通过生物体合成。从上个世纪五、六十年代起，一系列的化学方法被用于合成环磷酸腺苷，如：碱性水解法、活性酯类法、DCC 脱水法和三氯氧磷法6等。生物体合成是利用生物细胞的新陈代谢生成环磷酸腺苷。利用微生物合成cAMP，可分为发酵法，酶法。发酵法又分分段合成法和全合成法；酶法又分腺苷酸环化酶法和RNA分解法。本研究主要是利用微生物发酵法中的分段合成法，通过在含有碳源氮源的基本培养基上添加前体物质，通过培养微生物细胞获得大量的环磷酸腺苷。微生物cAMP的生物合成途径7如图 2所 示。图 2 细菌的cAMP生物合成途径与反馈调节（）（Acase为腺苷酸环化酶；PDase为磷酸二酯酶）cAMP的积累机制：(1)底物的摄取；(2)cAMP合成酶的开始；(3)生成的cAMP 向细胞外分泌漏出。2.材料与方法2.1实验材料实验室存放活化后的节杆菌斜面。2.2实验仪器超净工作台、恒温培养箱、回转式摇床、离心机、立式灭菌锅、还原糖自动测定仪、高效液相色谱仪、平板式加热器、双筒显微镜、培养皿、pH试纸、试管、移液管、酒精灯、吸耳球、烧杯、量筒、玻璃棒2.3实验方法2.3.1培养基种子培养基 ：葡萄糖2%，蛋白陈1%，酵母膏5% ，pH 7.0 7,8； 种子培养基的配制：称取4.0g葡萄糖，2.0g蛋白胨，10.0g酵母膏，溶于200ml蒸馏水中，调ph至7.0后分装于6个250ml的三角瓶中，再用8层纱布和双层报纸包扎瓶口灭菌备用。发酵培养基：葡萄糖5%， KH2PO41%， K2HPO41%， ZnSO4·7H2O 0.01%，蛋白胨1%， 酵母膏0.5%， 次黄嘌呤0.3%7,8,9；发酵培养基的配制：称取30g葡萄糖，6g KH2PO4，6gK2HPO4，0.06g ZnSO4·7H2O，6g蛋白胨，3g酵母膏，1.8g次黄嘌呤，溶于600ml蒸馏水中，为了加快磷酸盐的溶解可适当加热，完全溶解后调ph至7.5后分装于18个250ml的三角瓶中，每瓶30ml，用8层纱布和双层报纸包扎瓶口，并包6支5ml移液管与发酵培养基一起灭菌备用。2.3.2移种与接种将活化后的斜面种子移种至种子培养基8层纱布包扎三角瓶口28恒温摇瓶震荡培养18小时以上，再接种至发酵培养基，接种量10% (V/V)7， 8层纱布包扎三角瓶口30恒温摇瓶震荡培养72以上小时。移种：超净工作台紫外照射30分钟至1小时，关紫外灯开照明灯，开鼓风机。挑选6个长势较好的不同菌落分别进行移种,每个菌落移种一个发酵瓶.具体操作如下:左手持活化试管，并将三角瓶封口解开，放置酒精灯火焰附近。右手取接种环在火焰上灼烧灭菌、伸入斜面试管内部冷却。用接种环轻轻划取斜面上的菌苔，再伸入三角瓶种子培养液轻轻搅动使菌体溶到培养液中；重复 2到3次。移种完成后将三角瓶瓶口外层的2层报纸弃去，直接用8层纱布包扎，但不要污染瓶口处纱布。从超净工作台中取出种子培养瓶后28恒温摇瓶震荡培养18小时以上，待生长到对数生长后期时移种至发酵培养液中。接种：超净工作台准备如移种方法。在超净工作台中解开封口，每瓶种子液接种3瓶发酵样瓶，分别编号11至13，21至23，31至33，41至43，51至53，61至63 并用记号笔做好标记。用移液管吸取3ml种子液分别接种到已编号的发酵样瓶，同样弃去封瓶口的上层的2层报纸，在不污染瓶口纱布的情况下包扎瓶口后30恒温摇瓶震荡培养72小时以上。2.4高效液相检测环磷酸腺苷含量2.4.1色谱测定条件柱温为室温；柱压：19.11 MPa；流速：1 mL/min；波长：254 nm；进样量：20L；色谱柱：SinoChrom ODS- BP 5 m；柱长：150×4.6 mm。4,5流动相为V(甲醇) : V(磷酸溶液) =25:75；磷酸溶液浓度为0.6%。流动相中只包含甲醇和磷酸溶液。将配置好的流动相加热至70度左右，根据需要选择0.45m的滤膜，然后对流动相进行抽滤。抽滤后对流动相进行超声脱气10至20分钟，备用10,11。2.4.2样品处理发酵结束后得到的发酵液用5ml移液管移取3ml于3ml离心管中，每次移取发酵液时要用待移发酵液润洗2至3次。离心管在5000转每分钟下离心15分钟。离心结束后取上层清液，再经0.45m针式虑头过滤后待测。2.4.3标样的配制精密称取cAMP标准品 1000mg，用去离子水溶解并定容至100ml容量瓶中，即得到环腺苷酸标准品溶液，浓度为10mg/ml。精密称量次黄嘌呤标准品54mg，用去离子水溶解定容与100ml容量瓶中，得到次黄嘌呤标准溶液,浓度为0.54mg/ml。3,112.4.4标样的线性关系精密吸取cAMP标准液1ml、2ml、4ml、8ml、16ml、32ml分别定溶于50ml容量瓶中配制成0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mg/ml六份标准液，在上述色谱条件下进样20l4,5，记录色谱峰面积。环磷酸腺苷和次黄嘌呤的高效液相扫描图谱如3.1.2中图4，图5所示。在0.2mg/ml至6.4mg/ml浓度范围内，色谱峰面积与样品中环磷酸腺苷含量线性关系良好，线性关系图如2.4.3中图3所示。2.4.5标准曲线绘制照2.3.1色谱条件，将处理好的样品溶液与标准品溶液放入自动进样器分别进行扫描测定其峰面积。以峰面积为横坐标，浓度（mg/mL）纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，y = 22948.598x - 1475339.6，R² = 0.9979。标准曲线见图3，样品扫描结果见3.1.2。图3 环腺苷酸标准曲线3.实验结果与分析3.1实验结果3.1.1摇瓶发酵各参数测定发酵结束后，按编号排好发酵瓶进行参数测定。第一步：用50ml量筒量取各个发酵瓶中发酵液体积，做好记录。第二步：用玻璃棒蘸去适量发酵液，滴在5.0至9.0量程的ph试纸上30秒内与标准比色卡对比测定ph，做好记录。第三步：用5ml移液管移取3ml发酵液于3ml离心管中5000转每分钟，离心15分钟。用移液管移取发酵液前，先用待移发酵液润洗2到3次。第四步：取上层清液适量按上述色谱测定条件进样做高效液相测定。第五步：取上层清液适量于还原糖自动测定仪中测定发酵液中剩余还原糖的残糖量，做好记录。结果如表1。表1 摇瓶发酵体积、pH、残糖结果编号发酵液体积（ml） Ph 残糖量 11276.72.67812265.501326.56.72.64521276.72.82822296.72.94723286.72.86331277.02.96832246.73.02833275.5041276.72.6004226.56.72.54043286.72.64251296.72.70152296.72.72253276.72.71261296.71.57162286.72.24763256.72.2163.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量环磷酸腺苷标准品高效液相图如图 4 ，次黄嘌呤标准品的高效液相图如图 5 图4 环腺苷酸标准品的高效液相图图5 次黄嘌呤标准品的高效液相图不同菌落发酵液样品高效液相图谱如图6至图23所示。图6 菌落11高效液相图 图7 菌落12高效液相图图8 菌落13高效液相图图9 菌落21高效液相图图10 菌落22高效液相图图11 菌落23高效液相图 图12 菌落31高效液相图图13 菌落32高效液相图 图14 菌落33高效液相图 图15 菌落41高效液相图图16 菌落42高效液相图 图17 菌落43高效液相图图18 菌落51高效液相图图19 菌落52高效液相图图20菌落53高效液相图图21 菌落61高效液相图 图22 菌落62高效液相图图23 菌落63高效液相图由高效液相图分析得到各编号发酵液中环腺苷酸的含量如表2表2 发酵液中cAMP含量编号cAMP含量（mg/ml)112.249120.406132.344211.640221.338231.418310.591320.557330.547412.530422.583432.404511.995521.765531.980613.018622.729632.940菌落1至6发酵液环磷酸腺苷的平均含量如表3所示表3 环磷酸腺苷平均含量菌落编号环磷酸腺苷平均含量(mg/ml)菌落12.2965菌落21.4653菌落30.574菌落42.5057菌落51.9133菌落62.89573.2结果分析及讨论由3.1.2中不同菌落发酵液样品高效液相图6至图23分别与图4环磷酸腺苷、图5次黄嘌呤的标样图进行对比可以看出, 发酵液中产生的两个吸收峰与标样图的吸收峰几乎在同一位置，说明发酵液中由微生物合成了一定量的环磷酸腺苷，同时也说明了发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余。在发酵培养基的配制中添加了0.3%的次黄嘌呤，由于微生物是将次黄嘌呤作为中间物进行代谢利用，而不是作为碳源、氮源，所以需求量少。因此在发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余是正常情况。将各发酵液的高效液相图中cAMP的波峰面积算出，再利用2.2.4中的标准曲线求得发酵样品中环磷酸腺苷的含量。最后得到的各发酵样品中cAMP含量如3.2.1中表1所示。由表1 测定结果可以看出编号12和编号33的发酵瓶有些异常，ph和还原糖的残糖量都异于其他编号。这两瓶发酵液中还原糖的残余量为零，涂片后显微镜观察发现有其他非棒状杆菌和少量棒状杆菌，由此断定染菌，认定这两瓶发酵失败。在计算菌落环磷酸腺苷的平均值时，编号12和编号23的cAMP含量值不计算在内。其他各瓶发酵液ph基本一致，均含有少量还原糖，发酵状况认为正常。由表2 所得各瓶发酵液中环腺苷酸的含量对比发现还原糖的残糖量越低，则发酵液中环腺苷酸cAMP的含量越高。根据表3不同菌落发酵液中cAMP平均含量的计算结果，发现编号为6的菌落的发酵液中cAMP的平均含量最高为2.8957mg/ml，其次为菌落4环磷酸腺苷的平均含量为2.5057 mg/ml，平均含量最低的是菌落3含量为0.574mg/ml。不同的菌落生产环磷酸腺苷的能力差别较大，同一菌落的不同发酵样瓶中环磷酸腺苷的含量也不尽相同。初步分析主要原因有两个，一是用于实验的菌落可能只达到菌落纯，未达到菌株纯；二是可能由于实验过程中偶然的外界因素对单个发酵瓶产生了影响。若对菌落6进一步进行纯种分离纯化实验，规范实验操作定能筛选出环磷酸腺苷高产菌株。染菌分析：由于各发酵培养基是一起进行高压真气灭菌，只有两瓶发酵失败，推断培养基灭菌是彻底的，染菌可能是在进行发酵接种时污染杂菌。在今后的无菌操作时，要特别加以小心注意。微生物发酵染菌是发酵过程中比较重要的问题，如何避免染菌是发酵成败的关键。可从以下几方面给于避免：一、确定种子不带杂菌，从而可从源头上避免杂菌污染；二、培养基灭菌要彻底，一般采用高压蒸汽121，15分钟到20分钟；三、在种子液进行移种和接种时的无菌操作要规范，通常在超净工作台中进行，发酵瓶瓶口要靠近酒精灯火焰；四、接种过程瓶口不要对着风屏，尽可能是与风向平行，超净工作台中鼓风机的采风口要保持清洁卫生，避免鼓入空气带菌。4结论国内外目前生产cAMP多数是用腺苷和 5- 腺苷酸作为起始原料合成环磷腺苷。以化学合成为主，操作复杂，溶剂损耗量大，收率低成本高，产量小，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用。现也有人研究从大枣中提取环腺苷酸，但限于原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低不易推广。通过本次试验，初步说明环腺苷酸的生产除了通过化学合成和从生物细胞中提取外，还可以利用微生物发酵进行生产。通过初筛获得高产菌落6和菌落4，若能进一步对菌落进行分离纯化定能筛选出高产稳定的纯菌株。将环腺苷酸的生产与生物技术相结合，从而可以使环腺苷酸的生产周期短，分离提纯容易，产品具有无化学残留污染的优点，具有广阔的发展前景。参考文献1 王丽，蒋宗勇，林映才.环腺苷酸（cAMP）及其抗病生物学作用.饲料工业，20092 牟德华，朱艳丽. 大枣环腺苷酸及其生物学功能.食品科技.2007, 河北科技大学生物科学与工程学院3 张明娟，李薇，庞晓明. 枣果中环磷酸腺苷(cAMP)的提取工艺及含量测定.食品与发酵工业.2012，北京林业大学生物科学与技术学院4 李学贵, 蒋文强, 王传芬.HPLC 法测定大枣提取液中环腺苷酸含量的研究. 山东化工.山东轻工业学院食品与生物工程学院5 崔志强,孟宪军,王传杰. HPLC 法测定冬枣环磷酸腺苷含量. 食品研究与开发. 沈阳农业大学食品学院6 赵晋，田茂奎，唐巍.环磷腺苷合成工艺研究概述.理工科研，2008，西南大学化学化工学院7 张克旭.环腺昔酸(cAMP)发酵的菌种选育与调节机制.发酵科技通讯，1980，天津轻工学院8 应汉杰.一种微生物生产环腺苷酸的方法. 南京工业大学.专利申请9 CHEN, X. C. ET AL.: 'Medium optimization for the production of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate by Microbacterium sp. no.205 using response surface Methodology' BIORESOURCE TECHNOLOGY vol. 100, no. 2, 2009, pages 919 - 92410 蒲云峰，万英，侯旭杰. HPLC法测定不同品种红枣中cAMP含量.食品研究与开发. 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室11 王 荔，亓树艳，莫晓燕.大枣环磷酸腺苷提取纯化工艺的初步研究.食品科技.提取物与应用.2012, 西安交通大学生命科学与技术学院 致谢:经过近两个月的实验和整理论文，毕业设计即将结束，同时也标志着我的大学生活即将接近尾声。大学四年来在老师和同学们的帮助下，我努力学习掌握各种专业知识以及培养自己各方面的能力，尽自己的能力完成了我的学业。这次的毕业设计是一次交流和学习的机会，整个实验和论文整理过程是一个不断学习、不断提高自己、积累自己经验的过程，我从中学到了很多新知识，更培养了自己的信心和毅力。在今后的工作和学习中，我会继续发扬这段时间各项好的习惯和作风，努力做好以后的每一项工作。本文是在师的悉心指导下完成的，在跟随常老师做实验期间从她身上我学到的不仅仅是知识和实验技能的操作,更多的是做人为事的道理。常老师治学严谨,要求严格，为人和蔼,对我今后的学习工作都有很大帮助，同时在完成本实验时也得到了康老师和实验室其他老师在实验试剂、实验药品、实验仪器和实验操作等方面提供的帮助和指导，及试验组全体同学的协助，在此一并表示衷心的感谢！原文已完。下文为附加文档，如不需要，下载后可以编辑删除，谢谢！施工组织设计本施工组织设计是本着“一流的质量、一流的工期、科学管理”来进行编制的。编制时，我公司技术发展部、质检科以及项目部经过精心研究、合理组织、充分利用先进工艺，特制定本施工组织设计。一、 工程概况：西夏建材城生活区27#、30#住宅楼位于银川市新市区，橡胶厂对面。本工程由宁夏燕宝房地产开发有限公司开发，银川市规划建筑设计院设计。本工程耐火等级二级，屋面防水等级三级，地震防烈度为8度，设计使用年限50年。本工程建筑面积:27#楼3824.75m2;30#楼3824.75 m2。室内地坪±0.00以绝对标高1110.5 m为准，总长27#楼47.28m；30#楼47.28 m。总宽27#楼14.26m；30#楼14.26 m。设计室外地坪至檐口高度18.6 00m，呈长方形布置，东西向，三个单元。本工程设计屋面为坡屋面防水采用防水涂料。外墙水泥砂浆抹面，外刷浅灰色墙漆。内墙面除卫生间200×300瓷砖，高到顶外，其余均水泥砂桨罩面，刮二遍腻子；楼梯间内墙采用50厚胶粉聚苯颗粒保温。地面除卫生间200×200防滑地砖，楼梯间50厚细石砼1：1水泥砂浆压光外，其余均采用50厚豆石砼毛地面。楼梯间单元门采用楼宇对讲门，卧室门、卫生间门采用木门，进户门采用保温防盗门。本工程窗均采用塑钢单框双玻窗，开启窗均加纱扇。本工程设计为节能型住宅，外墙均贴保温板。本工程设计为砖混结构，共六层。基础采用C30钢筋砼条形基础，上砌MU30毛石基础，砂浆采用M10水泥砂浆。一、二、三、四层墙体采用M10混合砂浆砌筑MU15多孔砖；五层以上采用M7.5混合砂浆砌筑MU15多孔砖。本工程结构中使用主要材料：钢材：I级钢，II级钢；砼：基础垫层C10，基础底板、地圈梁、基础构造柱均采用C30，其余均C20。本工程设计给水管采用PPR塑料管，热熔连接；排水管采用UPVC硬聚氯乙烯管，粘接；给水管道安装除立管及安装IC卡水表的管段明设计外，其余均暗设。本工程设计采暖为钢制高频焊翅片管散热器。本工程设计照明电源采用BV2.5铜芯线，插座电源等采用BV4铜芯线；除客厅为吸顶灯外，其余均采用座灯。二、 施工部署及进度计划1、工期安排本工程合同计划开工日期：2004年8月21日，竣工日期：2005年7月10日，合同工期315天。计划2004年9月15日前完成基础工程，2004年12月30日完成主体结构工程，2005年6月20日完成装修工种，安装工程穿插进行，于2005年7月1日前完成。具体进度计划详见附图1（施工进度计划）。2、施工顺序基础工程工程定位线（验线）挖坑钎探（验坑）砂砾垫层的施工基础砼垫层刷环保沥青 基础放线（预检）砼条形基础刷环保沥青 毛石基础的砌筑构造柱砼地圈梁地沟回填工。结构工程结构定位放线（预检）构造柱钢筋绑扎、定位（隐检）砖墙砌筑（50cm线找平、预检）柱梁、顶板支模（预检）梁板钢筋绑扎（隐检、开盘申请）砼浇筑下一层结构定位放线重复上述施工工序直至顶。内装修工程门窗框安装室内墙面抹灰楼地面门窗安装、油漆五金安装、内部清理通水通电、竣工。外装修工程外装修工程遵循先上后下原则，屋面工程（包括烟道、透气孔、压顶、找平层）结束后，进行大面积装饰，塑钢门窗在装修中逐步插入。三、 施工准备1、 现场道路本工程北靠北京西路，南临规划道路，交通较为方便。场内道路采用级配砂石铺垫，压路机压。2、 机械准备设2台搅拌机，2台水泵。现场设钢筋切断机1台，调直机1台，电焊机2台，1台对焊机。现场设木工锯，木工刨各1台。回填期间设打夯机2台。现场设塔吊2台。3、施工用电施工用电已由建设单位引入现场；根据工程特点，设总配电箱1个，塔吊、搅抖站、搅拌机、切断机、调直机、对焊机、木工棚、楼层用电、生活区各配置配电箱1个；电源均采用三相五线制；各分支均采用钢管埋地；各种机械均设置接零、接地保护。具体配电箱位置详见总施工平面图。3、 施工用水施工用水采用深井水自来水，并砌筑一蓄水池进行蓄水。楼层用水采用钢管焊接给水管，每层留一出水口；给水管不置蓄水池内，由潜水泵进行送水。4、 生活用水生活用水采用自来水。5、 劳动力安排结构期间：瓦工40人；钢筋工15人；木工15人；放线工2人；材料1人；机工4人；电工2人；水暖工2人；架子工8人；电焊工2人；壮工20人。装修期间抹灰工60人；木工4人；油工8人；电工6人；水暖工10人。四、主要施工方法1、施工测量放线施工测量基本要求A、西夏建材城生活区17#、30#住宅楼定位依据：西夏建材城生活区工程总体规划图，北京路、规划道路永久性定位B、根据工程特点及建筑工程施工测量规程DBI012195，4、3、2条，此工程设置精度等级为二级，测角中误差±12，边长相对误差1/15000。C、根据施工组织设计中进度控制测量工作进度，明确对工程服务，对工程进度负责的工作目的。工程定位A、根据工程特点，平面布置和定位原则，设置一横一纵两条主控线即27#楼：（A）轴线和（1）轴线；30#楼：（A）轴线和（1）轴线。根据主轴线设置两条次轴线即27#楼：（H）轴线和（27）轴线；30#楼：（H）轴线和（27）轴线。 B、主、次控轴线定位时均布置引桩，引桩采用木桩，后砌一水泥砂浆砖墩；并将轴线标注在四周永久性建筑物或构造物上，施测完成后报建设单位、监理单位确认后另以妥善保护。C、控轴线沿结构逐层弹在墙上，用以控制楼层定位。D、水准点：建设单位给定准点，建筑物±0.00相当于绝对标高1110.500m。基础测量A、在开挖前，基坑根据平面布置，轴线控制桩为基准定出基坑长、宽度，作为拉小线的依据；根据结构要求，条基外侧1100mm为砂砾垫层边，考虑放坡，撒上白灰线，进行开挖。B、在垫层上进行基础定位放线前，以建筑物平面控制线为准，校测建筑物轴线控制桩无误后，再用经纬仪以正倒镜挑直法直接投测各轴线。C、标高由水准点引测至坑底。结构施工测量A、首层放线验收后，主控轴一引至外墙立面上，作为以上务层主轴线竖身高以测的基准。B、施工层放线时，应在结构平面上校投测轴线，闭合后再测设细部尺寸和边线。C、标高竖向传递设置3个标高点，以其平均点引测水平线折平时，尽量将水准仪安置在测点范围内中心位置，进行测设。2、基坑开挖本工种设计地基换工，夯填砂砾垫层1100mm；根据此特点，采用机械大开挖，留200mm厚进行挖工、铲平。开挖时，根据现场实际土质，按规范要求1:0.33放坡，反铲挖掘机挖土。开挖出的土，根据现场实际情况，尽量留足需用的好土，多余土方挖出，避免二次搬运。人工开挖时，由技术员抄平好水平控制小木桩，用方铲铲平。挖掘机挖土应该从上而下施工，禁止采用挖空底脚的操作方法。机械挖土,先发出信号，挖土的时候，挖掘机操作范围内，不许进行其他工作，装土的时候，任何人都不能停留在装土车上。3、砌筑工程材料砖：MU15多孔砖，毛石基础采用MU30毛石。砂浆：±0.00以下采用M10水泥砂浆，一、二、三、四层采用M10混合砂浆，五层以上采用M7.5混合砂浆。砌筑要求A、开工前由工长对所管辖班组下发技术交底。B、砌筑前应提前浇水湿润砖块，水率保持在1015。C、砌筑采用满铺满挤“三一砌筑法“，要求灰浆饱满，灰缝812mm。D、外墙转角处应同时砌筑，内外墙交接处必须留斜槎，槎子长度不小于墙体高度的2/3，槎子必须平直、通顺。E、隔墙与墙不同时砌筑又不留成斜槎时可于墙中引出阳槎或在墙的灰缝中预埋拉结筋，每道不少于2根。F、接槎时必须将表面清理干净，浇水湿润，填实砂浆，保持灰缝平直。G、砖墙按图纸要求每50mm设置26钢筋与构造柱拉结，具体要求见结构总说明。H、施工时需留置临时洞口，其侧边离交接处的墙面不少于500mm，顶部设边梁。4、钢筋工程凡进场钢筋须具备材质证明，原材料须取样试验，经复试合格后方可使用。钢筋绑扎前应仔细对照图纸进行翻样，根据翻样配料，施工前由工长对所管辖班组下发技术交底，准备施工工具，做好施工的准备工作。板中受力钢筋搭接，I级钢30d，II级钢40d，搭接位置：上部钢筋在跨中1/3范围内，下部钢筋在支座1/3范围内。钢筋保护层：基础40mm，柱、梁30mm，板20mm。保护层采用50mm×50mm的水泥砂浆块。板上部钢筋用马凳按梅花状支起。所有钢筋绑扎，须填写隐检记录，质评资料及目检记录，验收合格后方可进行下道工序。5、砼工程水泥进场后须做复试，经复试合格后由试验室下达配合比。施工中严格掌握各种材料的用量，并在搅拌机前进行标识，注明每立方米、每盘用量。同时搅拌时，须车车进磅，做好记录。 浇筑前，对模板内杂物及油污、泥土清理干净。投料顺序：石子水泥砂子。本工程均采用插入式振捣器，一次浇筑厚度不宜超过振捣器作用部分长度的1.25倍，捣实砼的移动间距不宜大于振捣器作用半径的1.5倍。砼浇筑后1昼夜浇水养护，养护期不少于7d，砼强度未达到1.2MPa之前不得上人作业。6、模板工程本工程模板采用钢木混合模板。模板支搭的标高、截面尺寸、平整度、垂直度应达到质量验收标准，以满足其钢度，稳定性要求。模板支撑应牢固可靠，安装进程中须有防倾覆的临时固定措施。本工程选用851脱模剂，每拆除一次模板经清理后涂刷脱模剂，再重新组装，以保证砼的外观质量。6、 架子工程本工程采用双排架子防护，外设立杆距墙2m，里皮距墙50cm，立杆间距1.5m，顺水间距1.2m，间距不大于1m。 架子底部夯实，垫木板，绑扫地杆。为加强架子的稳定性，每七根立杆间设十字盖，斜杆与地面夹角60o。为防止脚平架外倾，与结构采用钢性拉接，拉接点间距附和“垂四平六“的原则。外防护架用闭目式安全网进行封闭，两平网塔接和网下口必须绑孔紧密。结构架子高出作业层1m，每步架子满铺脚手板，要求严密牢固并严禁探头板。7、 装饰工程装饰工程施工前，要组织质监部门、建设、设计、施工单位四方参加的主体结构工程核验收，对已完全体分部工程进行全面检查、发现问题及时处理，清除隐患，并做好装饰前材料、机具及技术准备工作。1、根据预算所需材料数量，提出材料进场日期，在不影响施工用料的原则下，尽量减少施工用地，按照供料计划分期分批组织材料进场。2、将墙面找方垂直线，清理基层，然后冲筋，按照图纸要求，分层找平垂直，阴阳角度方正，然后拉线作灰饼。底子灰应粘结牢固，并用刮杠刮平，木抹子抹平。3、罩面应均匀一致，并应在终凝前刮平压光，上三遍灰抹子。4、油漆、涂料施工：油漆工程施工时，施工环境应清洁干净，待抹灰、楼地面工程全部完工后方可施工，油漆涂刷前被涂物的表面必须干燥、清洁，刷漆时要多刷多理不流坠，达到薄厚均匀，色调一致，表面光亮。墙面涂料基层要求现整，对缝隙微小孔洞，要用腻子找平，并用砂纸磨平。为了使颜色一致，应使用同一配合比的涂料，使用时涂料搅匀，方可涂刷，接槎外留在阴阳角外必须保证涂层均匀一致表面不显刷纹。8、 楼地面工程楼地面工程只作50厚豆石砼垫层。做垫层必须先冲筋后做垫层，其平整度要控制在4mm以内，加强养护45天后，才能进行上层施工。10、层面工程1、屋面保