烟草TDNA插入突变体的旁侧序列扩增毕业论文.doc

青 岛 农 业 大 学本科生毕业论文 论 文 题 目：烟草T-DNA插入突变体的旁侧序列扩增 专 业 班 级 烟草09级01班 姓名（学号） 指导老师姓名 指导老师职称 硕士研究生 完 成 时 间 2013年5月28日 摘要：1关键词：1Abstract：2Key words:2引言：3关键词：31.材料和方法41.1试验地点及时间41.2实验材料41.3实验方法41.4 DNA 纯度、浓度覆分子量 的测定51.5结果和讨论52.TAIL-PCR521反向PCR62.2PCR步移72.3TAIL-PCR实验82.4制胶、跑电92.5切胶回收、纯化DNA102.5.112.5.123.小结与结论12致谢12参考文献12烟草T-DNA插入突变体的旁侧序列扩增 摘要：通过TALL-PCR技术来分离与已知序列邻近 的未知 DNA 序列，利用 3 个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引 物组合进行 PCR 反应，选择恰当退火温度对目标片段进行 PCR 扩增。通过在测序凝胶上电泳条带的比较筛选出不同的表达的基因，并回收这些片段，经扩增后作为探针，在c 或基因组库中扫描找到相关基因。应用TALL-PCR技术研究烟草基因功能，能够更好的推动烟草功能基因组学研究。TAIL-PCR 技术作为一种使用技术简 单易行，反应高效灵敏，产物特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经在分子生物学研 究领域广泛应用。本文从 TAIL-PCR 技术原理出发，对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR 反 应条件等关键性问题进行综述。TAIL-PCR 是一种较为成熟的扩增 T-DNA 插入旁邻序列的技术，它操作相对简单，具有高效性，特异性高，应用非常广泛。关键词： TALL-PCR技术 突变体 旁侧序列扩增 Flanking sequence of tobacco T-DNA insertion mutants of amplificationAbstract: through the TALL-PCR technology to separate the unknown DNA sequence adjacent with the known sequence, using 3 nested specific primers according to the known sequence design respectively and degeneracy primer combinations of PCR reaction, selection of appropriate target fragment was amplified by PCR annealing temperature. By sequencing gel electrophoresis bands screened out the different expression genes, and the recovery of these DNA fragments, amplified and used as probe, in C DNA or genomic DNA library scanning to find related genes. Study on the application of TALL-PCR technology in tobacco gene function, can promote the tobacco functional genomics study better. TAIL-PCR technology as a technology is simple, reaction product is high sensitive, high specificity, good reproducibility, can obtain the target fragments in a relatively short period of time, has been widely used in the field of molecular biology research. This article from the TAIL-PCR technology theory, summarizes the technology designed specific primer, primer combinations selected, PCR reaction conditions and other key issues.Keywords: TALL-PCR mutant, flanking sequence amplification 引言：中国是世界上的烟草生产大国, 烟叶总产量和总销量都在世界上占有着非常大比重，烟草也是我国重要的经济植物，烟草税收是我国财政收入重要来源之一，对我国经济建设起到了很好的推动作用，有利于我国的社会进步和发展。烟草功能基因组学的研究还没有完全开展,，对于克隆研究烟草重要功能基因具有重大的意义,但是没有相应的突变体很难取得突破性的进展。通过筛选突变体,可有望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料,直接应用于烟草新品种选育和基因功能研究。我们的目的就是研究出更高产量和更高质量的新品种烟草，增加我国国民收入，增加国家税收，增强国际竞争力。植物遗传转化是应用重组DNA技术以及组织培养技术,有目的的将外源基因或者DNA片段插入到受体基因组中,并使其在后代植株中稳定表达的过程。近年来,植物基因组学研究如火如荼地开展,因此高效率的植物转化系统对于植物功能基因的鉴定以及转基因作物的应用具有重要意义。T-DNA插入技术作为一种研究功能基因的策略已经被广泛的运用到突变体库的构建工作中本研究对烟草为受体亲本构建的T-DNA插入突变体库进行了筛选、鉴定和共分离分析。利用T-DNA插入烟草基因组来产生突变体，并以T-DNA标签法分析突变体的性状。此技术非常好用，能够快捷的让我们认识和了解烟草基因。TAIL-PCR 是一种较为成熟的扩增 T-DNA 插入旁邻序列的技术，它操作相对简单，具有高效性，特异性高，应用非常广泛。目前我国T-DNA插入突变体的旁侧序列扩增实验还处于较低水品，没有好的实验成果，但我们的发展很快，随着世界新兴技术的日益即日的更新开发，我国的新兴技术也更着快速的发展。PCR技术值得推广。 关键词：T-DNA插入 反向PCR 接头PCR 1材料与方法1.1 试验地点及时间时间：2012年5月至10月地点：中国农业科学院烟草研究所湖北省咸丰县万家坝村科研基地1.2 试验材料烤烟品种：云烟87 云烟89 云烟851.3 试验方法131 步骤与 方 法 提取DNA1、 试验样品的研磨：1.1把样品放入液氮预冷的研钵里，用力研磨，在此期间不断加入液氮，使样品完全浸入液氮，直至研磨成粉末状。放入冰袋里。1.2然后向研钵中加入裂解液，将研磨粉末状完全覆盖，在室温下静置几分钟，直至样品完全融化，再用研株研磨至裂解液呈透明状。1.3可以取出粉末状放入离心管中再加入裂解液。充分混匀。1.4将匀浆液转移至离心管中，室温静置5 min 。1.5 在温度4摄氏度下用12000转离心5 min 。取出离心管，放入插板中。1.6 小心吸取上清液，移入新的离心管中。其他的就不要了。2. DNA 的粗提取：2.1 向上述匀浆裂解液中加入氯仿（裂解液 约五分之一的体积量）用手剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化，室温静置5min。2.2在温度4摄氏度下12000转离心5 min 。2.3从离心机取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机液，吸取上清液装置一心的离心管中。2.4向上清液加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，在15到30摄氏度下静置10分钟。2.5温度4摄氏度12000转离心10 min，一般在离心之后，试管底部出现沉淀。3.DNA沉淀的清洗：小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入75%乙醇 1ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒，洗涤离心管管壁。4. DNA的溶解： 室温干燥沉淀2到5分钟（不可离心或加热干燥，否则DNA将会很难溶解）加入50ul 裂解液 水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待DNA沉淀完全溶解后于-80保存。 1.4 DNA 纯度、浓度覆分子量 的测定 取一些DNA溶液用紫外分光光度计测定 DNA纯度和浓度 用缓冲液稀释 50 倍，测 在 230260， 280 11111波长 处 的光 吸 收 位 。 DNA 浓度 ( g·mL-。) =ODuo×稀 释 倍数)(O020×L)=0D26o×50 g·mL×稀释倍数 。 电 泳 法 测 DNA 纯度和 大 小 ，在 07琼脂 糖凝胶 扳上 ，以 50kb2噬 菌体 DNA做标准分子量 DNA，025演 酚兰为指标剂 ，EB染色， 电 极 缓 冲 液 (pH85) 以 Tri 硼酸为 5Vcm，34 h后停止屯泳 仪下观 察。 1.5 结果和讨论 从实验结果（下表） 可以看 出，从不同烟草品种中提取的 DNA紫外吸收 比值大小不同， 表 明通 过 该 办法 提 取 的 DNA 纯 度 超过 技术的要求，并且 DNA 浓度及 提取率均较高，琼脂糖凝胶电泳图谱也证实 了这一点，是符合 植物分子育种要求的。此实验结果中，要注意多次实验。 不同烟草品种 DNA提取结果 Extraction result of DNA fr0m different tobacco varieties 品种取材部位抽样g part取材量 新鲜wcight DNA浓度 纯度 260/230 260/280DNA浓度浓度(ug/ml)DNA提取液提取按比例(ug/g FW)云烟87腰叶（ml)40.382.101.832048562.28云烟89腰叶（ml)50.102.211.833200683.20云烟85腰叶（ml)63.122.151.823689733.15沙姆逊腰叶（ml)43.552.121.812450686.25· M L为 Middle Evictees的缩写2. PCR的实验原理PCR是在体外进行的酶促扩增反应，在生物技术研究领域中，PCR技术得到了广泛的运用，常用于基因突变体的实验中，获得目的基因和DNA序列测定等方面，是分子生物学中一项极为常用的技术。PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3端互补，由此限定扩增片段。2.1 PCR引物设计（1）Tm值 Tm是一个很重要的参数，在一般情况下，Tm值高于55。酶的温度一般在7074范围，Tm值应该与酶的温度相当，所以Tm值高于55。 （2）引物长度 引物长度一般在1530个核苷酸之间，如果引物太短时，那么就会造成Tm值过低，不能与模板很好地配对。如果引物过长时，那么又会造成Tm值过高，就会超过酶的最适反应温度，还有会使合成引物的费用增加。 （3）引物的GC含量 引物的GC比值最好设计在4060的范围内。GC比值与Tm值的有直接的影响。(4) 引物3端起始碱基 (5)引物无发卡结构 引物自身应无发卡结构。(6)两个引物自身之间不能配对 同一对引物之间不能有配对的多个碱基，那么两引物本身就不能配对，若发生这种情况会形成引物二聚体，造成扩增失败。(7)两引物的Tm值 应注意使两引物的Tm值相近，否则两个引物肯定不能同时达到最佳退火温度，那会影响PCR扩增效果的。2.2 PCR反应条件1 PCR缓冲液 常用的1×PCR缓冲液为10mmolL Tris-HCl pH8.3(常温)，50mmolL KCl，1.5mmolL MgCl2。 (1)Mg2+离子浓度：。Mg2+一般使用浓度为0.52.5mmolL(2)dNTP：常用dNTP浓度为20molL(3)K+离子浓度：50mmolL(4)pH值：PCR反应中用的是Tris-HCL缓冲系统。(5)保护剂：0.01的明胶2模板 PCR模板是DNA3引物浓度 常用引物浓度为0.10.5molL。4PCR反应中的酶 Taq酶3. TAIL-PCR TAIL-PCR技术最初是用来分离P1和YAC克隆插入末端序列的，经过改良后用于分离拟南芥TDNA插入旁侧序列。其原理是用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应使特异产物的扩增优先于非特异性产物的扩增，从而得到特异性的扩增产物。通过5个循环高特异性的反应，使SP1与已知的序列（载体或T-DNA）退火并延伸，提高目标序列的浓度。1次低特异性的反应使AD引物结合到较多的目标序列上，10个循环较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火，随后进行12个热不对称超级循环（每个超级循环包括2个高特异性反应和1个较低特异性反应）。经过上述反应可以得到不同浓度的三种类型的产物：特异性产物（I型）和非特异性产物（II型和III型）。第二次反应则将第一次反应的产物稀释1,000倍作为模板，以SP2和同一AD引物作为引物进行10个热不对称超级循环，使特异性产物被选择性的扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。第三次反应又将第二次反应产物稀释1,000倍作为模板，以SP2和同一AD引物作为引物进行普通的PCR扩增。通过上述三次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 与其他旁侧序列分离方法相比，TAIL-PCR具有操作简单、对DNA样品要求不高、特异性高、扩增效率高、快速、灵敏度高等优点，并且PCR产物可以直接用来测序（Liu和Whittier，1995）。为了进一步提高TAIL-PCR扩增效率，McElver等（2001）简化TAIL-PCR的扩增步骤，并把扩增条件加以改进。Sessions等（2002）通过建立简并引物池的方法，大大提高了TAIL-PCR扩增的效率。目前，TAIL-PCR已经被广泛地用于各类插入突变体库侧翼序列的分离，如拟南芥T-DNA插入突变体库SALK（Sessions等，2002），日本国立农业研究院水稻Tos17插入突变体库（Miyao等，2003），本室水稻T-DNA插入突变体库RMD（Zhang等，2006）以及台湾水稻T-DNA插入突变体库TRIM（Hsing等，2007）等，都是采用TAIL-PCR技术分离的旁侧序列。3.1反向PCR反向PCR 技术分离旁侧序列的基本原理是：首先用限制性内切酶消化带有T-DNA或转座子插入的基因组DNA，对所选用限制性内切酶要求切除的产物中，含有在已知T-DNA或转座子上有一个酶切位点，另一个酶切位点在未知的基因组中的片段；将酶消化后的DNA片段连接，使其环化；利用T-DNA或转座子的边界已知序列设计一对反向引物进行PCR扩增，即可获得插入位点两侧未知的基因组序列（反向PCR的反应流程如图4所示）。最初的反向PCR技术是用来快速扩增任何一个已知基因片段两侧未知序列。它避免了对未知序列的克隆、亚克隆和文库筛选等繁琐步骤。选择合适的核酸内切酶是反向PCR技术成功的关键之一：酶切产生的片段不要太大，酶切位点距边界最好在35kb，便于环化；酶切效率要高，产生粘性末段，可以提高连接的效率；大规模分离序列时选用常用酶，可以大大降低分离的成本。反向PCR也存在一些缺陷：由于涉及到酶消化和连接，对基因组DNA的要求相对PCR反应来说要求较高；分离过程相对TAIL-PCR来说较长；在PCR扩增过程中非特异扩增率较高，为了克服这一缺陷，对反向PCR方法进行一些改进，设计两对引物进行巢式PCR扩增，大大提高了产物特异性。韩国POSTECH-RISD数据库应用反向PCR技术进行T-DNA旁侧序列分离（Jeong等，2006），目前已得到80,259条旁侧序列可定位于水稻染色体上。 3.2 PCR步移（PCR-Walking） PCR-Walking技术最早由Siebert等（1995）创立，后来成功用于分离转基因拟南芥（Devic等，1997；Balzergue等，2001）和水稻（Sallaud等，2003；2004；Peng等，2005）的T-DNA插入侧翼序列，是一种替代反向PCR的极其有效的方法，可以用来扩增任何已知序列侧翼的未知序列。PCR-Walking是嵌套PCR和抑制PCR（Suppression PCR）的结合，其操作步骤如下：将完整的基因组DNA用平端限制性内切酶消化，在酶切产物上连接平端接头。该平端接头具有的特征可以使扩增限定在接头引物和特异性基因引物之间：接头的两条互补链长短不等，接头的长链具有与接头引物AP1和AP2互补的连续序列与短链在3端互补，而短链的3端缺乏AP1引物结合位点，并且具有氨基基团，氨基基团阻止了在聚合酶作用下合成产生AP1结合位点。因此接头引物结合位点只能通过从基因特异性引物延伸合成出来的接头长链互补链而产生。即使在一定条件下，产生了从AP1到AP1的扩增片段，也由于末端重复形成手性结构而不能大量扩增。以上特点，保证了PCR-Walking扩增产物的特异性。但是PCR-Walking也存在技术上的缺陷，如引物的特异性不强，PCR-Walking的接头与DNA的酶切片段未能有效连接等。3.3 TAIL-PCR实验 按照以下Tail-PCR体系配溶液 ，再配溶液时，我们是整体配的，配50个体系，所以要配50倍数的溶液，配好后，用移液枪进行移液。 Tail-PCR体系（引物稀释成200uM，+引物瓶上的nM数×50的ddH2O）Step1x1(20ul)x5Buffer2ul10dNTP2ul10ExTaq0.1ul0.5LAD11.0ul5LAD31.0ul5SKI10.5ul2.5DMSO1ul5DNA1ul(20-30ng)DdH2O11.457Step2x1(20ul)x5Buffer2ul10dNTP2ul10ExTaq0.1ul0.5AC10.3ul1.5SKIa-10.3ul1.5DMSO1ul5DNA1ul Step1稀释40倍DdH2O13.366.5Step3x1(20ul)x5Buffer2ul10dNTP2ul10ExTaq0.1ul待添加的隐藏文字内容20.5AC10.3ul1.5SKI30.3ul1.5DMSO1ul5DNA1ul Step2稀释10倍DdH2O13.366.5 阳性检测，利用35S增强子设计引物如下（395bp）：105L: GACTCACTATAGGGCGAATTG105R: GATATCACATCAATCCACTTGC载体特异序列SKI3: TGATCCATGTAGATTTCCCGGACATGASKI2-2: TAACGCTGCGGACATCTACA SKI2-1: TCCATATTGACCATCATACTCATTGSKI1： GCTTTCGCCTATAAATACGACGGATCSKIa-2: ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTAACGCTGCGGACATCTACASKIa-1: ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTCCATATTGACCATCATACTCATTG兼并引物LAD1: ACGATGGACTCCAGAGCGGCC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAALAD2: ACGATGGACTCCAGAGCGGCC(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTTLAD3: ACGATGGACTCCAGAGCGGCC(G/C/A) (G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAALAD4: ACGATGGACTCCAGAGCGGCC(G/C/T) (G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGTAC1：ACGATGGACTCCAGAGPCR-Walking：ADAs：5P-ACCTCCCC-NH2（C6）ADAl：5GAGTCACGATGCACACTTGAACAGAGGATCACAGGAGGGGAGGT两条接头特异性的引物为AP1：5-ACATGAGTCACGATGCACACTTGAAC-3AP2：5-CACACTTGAACAGAGGATCACAGGAG-3实验具体：采用模板K3,体系为25ul，PCR反应程序如下： ：94 5分钟： 94 30秒： Tm温度 30秒： 72 40秒程序到程序共是35个循环： 72 7分钟： 4 保存注：Tm值为该引物的标准Tm值得上下5F2的Tm为52.3，R1的Tm为53.6实际PCR反应中温度范围是：48583.4制胶、跑电(一) 配胶 1、带好一次性手套，将玻璃板洗干净，然后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。分离胶及浓缩胶都可以提前配好，然后装入棕色瓶子作为储存液避光存放于4温度下，最少能够存放1个月，要用的时候取出来就可以了。2，用量筒称量40ml溶液，倒入烧杯，把烧杯放在加热器上，打开加热器德尔开关，开始加热。3，等到烧杯里的溶液开始沸腾之后，不要焦急，让它沸腾一会儿就可以了，然后，关掉开关，拿下烧杯，放在实验台上，等它冷却大约1分钟就可以了。4，把胶倒入中板里。封胶后切记，勿动。等到胶凝后就可以拔梳子了。5，等拔完梳子之后，就可以往梳孔里打DNA。6，把使用的用品放回原位，并清洗干净。（二） 点DNA 用冰盒取出已经跑完PCR的产物，用移液枪把DNA和引物点到一次性手套上，用多少个就点多少个，加入5000的Marker。然后用枪打到已做好的胶块里，连上220V电压，1015分钟后，取出观察。实验结果：实际产物大小为：500750出现亮带温度：F2为56.0，R1为57.2跑电泳结果如下图：3.5切胶回收、纯化DNA1. 使用TAE或TBE缓冲液做胶，对目的基因进行电泳2. 在紫外灯下切胶，用纸巾吸尽胶表面的液体，切胶尽量减小胶的体积，以提高DNA的回收率。胶块超过300mg，使用多个COLUMN回收（切胶时不要将DNA长时间暴露在紫外灯下，防止DNA损伤）3. 切碎胶块4. 称量胶块重量，计算胶块体积，1mg=1ul5. 凝胶浓度 Buffer GM使用量1.0% 3个凝胶体积量1.0%1.5% 4个凝胶体积量1.5%2% 5个凝胶体积量6. 均匀混合后室温1525融化胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37加热）此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（510分钟）。注意：高于50不仅不会提高溶胶速度，反而会造成一些大片段DNA回收量降低。7. 当凝胶完全融化后，观察溶胶液颜色，如果溶胶液颜色由黄色变成橙色或粉色，则向上融化液加入10ul 3M 醋酸钠溶液（pH 5.2)均匀混合至溶液恢复至黄色。注：当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液加入终浓度为20%的异丙醇。8. 将试剂盒中的spin column 按 collection Tube上。9. 将上述溶液移至spin column 中12000转离心1分钟，弃滤液如再将滤液再离心一次可提高DNA回收率。10. 将700ul的Buffer WB 加入spin column 中，室温12000转离心30秒钟，弃滤液11. 重复步骤1012. 将spin column 于collection Tube 上，室温离心12000转1分钟。13. 将spin column于新的1.5ml离心管上，在spin column膜中央加入30ul 灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。14. 室温12000转离心1分钟洗脱DNA。3.6 PCR-walking 方法 3.6.1 用 PCR-walking 方法对烟草旁序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了其突变体 T-DNA 左、右边界旁侧序列，确定 T-DNA 插入突变体的 位点上。 左端引物: LGSP1, 5c-TATCCTGCCAC-CAGCCAGCCAACA-3c; LGSP2, 5c-ACCACTCGATACAGGCA-GCCCATCA-3c。右端引物: RGSP1, 5c-CGATTGTCTGTTGT-GCCCAGTCATAG-3c; RGSP2, 5c-TCCTTCAATCGTTGCGGT-TCTGT-3c。PCR-walking 方法为 T-DNA 的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。操作方法参照TAIL-PCR实验方法操作，接头引物为 APl 和 AP2和特异性引物GSP1、GSP2进行两轮PCR扩增。3.6.2 PCR产物的回收和纯化PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶1V/cm电压电泳2个小时,对目的产物进行回收,并对回收结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。本次实验应该尽可能的回收PCR条带,不要浪费和污染，有利于之后的拼接分析。3.6.3 PCR-walking反应体系：20ul 体系10xbuffer 2.0uldNTP 2.0ul Extap 0.2ulLad1 1.0ulLad3 1.0ul SKI3 0.5uldmso 1.0ulDNA 1.0ul H2O 11.3ul PCR程序：（1）94    8分钟 （2）94    90秒（3）60   3分钟 （4）72  90秒 （5） goto   (2)   29times （6）72  30分钟PCR结束后  取10 ul产物进行琼脂凝胶电泳跑电泳结果如下图：PCRW alking结果 经过两轮PCR扩增,获得特异性强、浓度高的PCR产物。切胶回收、纯化DNA1. 使用TAE或TBE缓冲液做胶，对目的基因进行电泳2. 在紫外灯下切胶，用纸巾吸尽胶表面的液体，切胶尽量减小胶的体积，以提高DNA的回收率。胶块超过300mg，使用多个COLUMN回收（切胶时不要将DNA长时间暴露在紫外灯下，防止DNA损伤）3. 切碎胶块4. 称量胶块重量，计算胶块体积，1mg=1ul5. 凝胶浓度 Buffer GM使用量1.0% 3个凝胶体积量1.0%1.5% 4个凝胶体积量1.5%2% 5个凝胶体积量6. 均匀混合后室温1525融化胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37加热）此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（510分钟）。注意：高于50不仅不会提高溶胶速度，反而会造成一些大片段DNA回收量降低。7. 当凝胶完全融化后，观察溶胶液颜色，如果溶胶液颜色由黄色变成橙色或粉色，则向上融化液加入10ul 3M 醋酸钠溶液（pH 5.2)均匀混合至溶液恢复至黄色。注：当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液加入终浓度为20%的异丙醇。8. 将试剂盒中的spin column 按 collection Tube上。9. 将上述溶液移至spin column 中12000转离心1分钟，弃滤液如再将滤液再离心一次可提高DNA回收率。10. 将700ul的Buffer WB 加入spin column 中，室温12000转离心30秒钟，弃滤液11. 重复步骤1012. 将spin column 于collection Tube 上，室温离心12000转1分钟。13. 将spin column于新的1.5ml离心管上，在spin column膜中央加入30ul 灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。14. 室温12000转离心1分钟洗脱DNA。4结果与分析通过上述实验我们可以看出TAIL-PCR和PCR Walking技术在探讨烟草基因有着重要的作用，PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的，因此，在进行PCR前，模板的纯化和引物设计尤为重要。研究证明表示，TAIL-PCR 方法能够高效地分离T-DNA 插入突变体的旁邻序列。通过 TAIL-PCR 方法，获得 T-DNA 插入点旁侧的烟草基因组序列，并且证实了旁侧序列与烟草的突变性状一起分离。TAIL-PCR 是一种比较成熟的扩增 T-DNA 插入旁侧序列的技术方法，它能够直接用于PCR产物的测序。它有很多的优点：（1）所用的DNA模板的量非常少，且对 DNA 的纯度要求不是很高，在PCR 扩增前不需要任何特殊的 DNA 操作。可以直接测序，节省了 PCR 反应前后的许多费时、费力的操作程序。（2）特异性非常高，用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合 , 通过不对称的温度循环和分级反应 ,使反应体系有利于特异引物的扩增 ,最终的扩增产物中目的片段占 绝对优势 ,反应产物可以直接用做探针标记和测序模板。(3) 高效灵敏。使用任何一个 AD 引物 ,在 60 %80 %的反应中能够产生特异性产物。运用不同的 AD 引物就能够有效地扩增到目标片段。(4) 快速。整个 TAIL2PCR 反应循环能够在 1 d 内完成 ,可以快速地获得目标片段。(5) 不涉及连接反应 , 反应产物准确可靠 ,重复性好。 TAIL2PCR 反应需要较多的引物组合。此外 ,由于 AD 引物存在有限的结合位点 ,对于个别的侧翼序列 ,即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果。整个 TAIL2PCR 需要一系列连续的反应 ,反 应条件的设置要求比较精细。 TAIL2PCR 技术能够分离获得克隆载体上的 DNA 序列 ,也能够用于基因组小的物种如拟南芥 3 ,8 、水稻9 ,10和基因组大的物种 ,如小麦1以及哺乳动物11的已知序列两侧翼的 DNA 序列的分 离。上述优点使 TAIL2PCR 技术成为分子生物学研究中的一种强大工具。通过这一系列实验，可以比较形象清晰的看出PCR技术具有非常实用，非常高效，快捷，对于各类生物分子实验都有用。我们通过PCR实验来研究烟草基因功能，能够帮助我们更快更好的了解烟草基因和掌握烟草的习性，更有助于我们研究出各种好的烟草基因，提高烟草质量和烟草产量。PCR技术在于它的优越性，广泛性，超越性，好操作，好掌握。这是一个好的分离突变体插入标签旁侧序列的有效方法，值得我们大力推广。此外, 为了培育优质、高香气、低毒烟草新品种, 使得烟草功能基因组的研究具有重要的科研理论意义和应用价值。目前国内外 烟草基因组的测序工作正在进行, 随之展开的烟 草功能基因组研究将需要大量的烟草突变体, 而当前烟草突变体库的建立还很少，尚处于摸索当中。因此为了加快烟草突变体库的创建， 对于烟草功能基因组的研究、重要基因的克隆、阐明控制烟草重要农艺性状的分子机制以及培育烟草新品种都具有重要的战略意义。参考文献：（1）刘贯山，孙玉合，太帅帅，陈珈.普通烟草 CDPK 基因家族的克隆及表达分析，J. 中国文库, 2009, 03 （2）：754-758) Delavault P., and Patrick T., 2002, The obligate root parasite Orobanche cumana exhibits several rbcL sequences, Gene, 297(1-2): 85-92 Dhammika G., and Robert G.K.，2000, Genomicorganizationflan-kingregionandtissue-specificexpres