湘杂棉指纹图谱的构建毕业论文(生物工程专业).doc

本 科 毕 业 论 文 湘杂棉指纹图谱的构建Construction of Xiangzamian SSR Fingerprint Map系（院）名称： 生物与食品工程学院 专 业 班 级： 08级生物工程 学 生 姓 名： 学 号： 指导教师姓名： 指导教师职称： 2012年5月 目录中文摘要、关键词I英文摘要、关键词II引言1第1章 材料和方法31.1 实验材料31.2研究方法41.2.1棉花基因组DNA的提取41.2.2 DNA质量检测和浓度检测41.2.3 SSR引物序列信息搜集51.2.4 PCR反应程序51.2.5聚丙烯酰胺凝胶检测51.2.6湘杂棉棉花指纹图谱的构建6第2章 结果与分析72.1 DNA质量的检测结果72.2 SSR-PCR反应体系的建立72.3湘杂棉棉花的指纹图谱72.3.1湘杂棉棉花多态性引物的筛选72.3.2多态性引物对湘杂棉棉花亲本自交系的扩增72.3.3特异分子标记93.3.4湘杂棉棉花指纹图谱的构建102.4 未知种身份识别13第3章 讨论143.1 棉花DNA的提取143.2 杂交棉指纹图谱的构建14第4章 结论15致谢16参考文献17附录1 缩略语表19附录2 指纹图谱20湘杂棉指纹图谱构建摘要： SSR分子标记技术被广泛应用于DNA指纹图谱构建和品种鉴定。本文利用SSR分子标记方法对长江流域大面积推广种植的湘杂棉棉花及其中部分湘杂棉棉花亲本材料进行研究，筛选出了一批在湘杂棉棉花及其亲本上具有较高多态性的SSR引物，构建出了湘杂棉棉花系列品种的指纹图谱。从所选择的棉花26对染色体上挑选的331对SSR引物进行筛选，结果表明，其中有31对在实验材料中显示多态性，占检测引物的9.37%。从31对引物中挑出19对多态性较好、条带易读取的引物，构建了湘杂棉棉花指纹图谱，为湘杂棉种子纯度的检测和未知种身份的识别提供依据。关键词： 湘杂棉 SSR分子标记 指纹图谱 SSR引物Construction of Xiangzamian SSR Fingerprint MapAbstract: SSR molecular markers are widely used in DNA fingerprints map construction and variety identification. This paper conducted research on Xiangzamian series and parts of their parents-line materials planted on the Yangtze River area, using the method of SSR molecular markers, and then a set of highly effective, accurate and reliable molecular technique identification system was set up. Primers with polymorphism on Xiangzamian and its parent lines were screened and the DNA fingerprints of Xiangzamian were constructed. The construction of fingerprinting for Xiangzamian by SSR markers: 331 pairs of SSR primers were selected from 26 pairs of chromosomes of cotton. Among these, there were 31 pairs of primers performed polymorphisms, accounting for 9.37%. 19 pairs of primers out of 31 were used to establish the Xiangzamian DNA fingerprints. This study will laid a solid foundation for detection of Xiangzamian seed purity and the unknown status recognition. Keywords: Xiangzamian; SSR molecular markers; Fingerprint; SSR primers引言棉花是我国主要经济作物，对纺织工业发展和提高人民生活水平具有重要作用。改革开放以来，我国的棉花产业取得了举世瞩目的成就，棉花产量与品质都得到了大幅度的提高。20年来，我国棉花总产量与消费量约占世界的1/4，均居世界第一位。棉纺织品与服装一直是我国出口创汇的主要产品。品种和种子是棉花生产中最活跃的要素，是科技进步的载体和产业化经营的物质基础。新中国成立以来我国的棉花育种取得了举世瞩目的成就，在全国主要棉区已经进行几次大规模的品种更新和更换，每次都使棉花单产提高10%以上。棉花杂种优势研究开始于20世纪20年代，国内外多年的研究表明，利用杂种优势是提高棉花产量的有效途径之一。我国20年代早期就开始进行棉花品种间杂种优势利用的研究，指出亲缘愈远的品种杂交，杂种优势愈显著。40年代后，开始进行陆地棉品种间杂交及陆地棉与海岛棉种间的杂种优势的利用研究。70年代后，随着杂交水稻的研究成功和大面积的推广应用，在全国内形成杂交棉研究的高潮。80年代后期以来，国家将棉花杂种优势利用连续列入“十一五”、“十二五”攻关计划，使杂交棉研究再次在全国范围内呈现出勃勃生机1。杂交棉的大规模应用为棉花产量的大幅度提高作出了巨大贡献。种子是最重要的农业生产资料，优良品种对农作物增加产量和改善品质起着至关重要的作用。控制种子，就掌握了农业竞争的主动权。因此，在当今世界，各国政府都把加强种子科技研究，推动种子产业发展，列为促进农业发展的重要举措2。我国是一个农业大国，巨大的种子需求量使得我国种子市场日渐成为国际种业竞争的焦点。DNA指纹图谱是一类构建作物特征指纹的方法，是目前最先进的遗传标记系统。DNA指纹图谱广泛应用于种子特征指纹的绘制、遗传连锁图的构建和遗传多样性研究。杂交棉的指纹图谱具有品种特异性，即同一品种的不同植株具有相同的遗传背景，任何一种植株的DNA指纹图谱均可以代表所属品种的特征3。目前赵久然等正利用SSR分子标记技术构建玉米的特征指纹库，该库可用于玉米品种纯度及真伪鉴定、遗传多样性分析、区试和审定品种的真实性和一致性监控等4。DNA指纹图谱直接反映种子的遗传物质在DNA分子水平上的差异，其多态性远高于蛋白质指纹图谱。DNA指纹图谱有多种类型，如：RAPD、SSR等5。SSR是目前指纹图谱技术中多态性最丰富，也是公认的用来构建指纹图谱最有效的一项技术6-12。某个品种的指纹图谱就相当于该品中的“身份证”，构建杂交棉指纹图谱具有重要的意义。（1）可以防止种子生产和销售过程中出现的以甲品种充当乙品种（张冠李戴），以劣质品种充当优质畅销品种（借壳上市），在品种区试中或者审定后更换杂交种亲本（偷梁换柱），改变品种特性，用已审定的品种冒充自己品种参试（借腹怀胎）等不法行为的出现，规范我国种业市场。（2）利用构建的杂交棉指纹图谱即可有效的鉴别和区分不同杂交棉品种，因而可以减少和杜绝种子生产经营活动中对某一授权品中的侵权行为，保护杂交棉新品种。（3）我国加入WTO和UPOV组织后，一个新品中的推广、产权保护都必须提供该产品的特异鉴定标记和DNA指纹，从这个意义上讲建立品种的指纹图谱也势在必行13。本文利用长江流域广泛种植的湘杂棉系列品种作为材料，构建其指纹图谱，并将其应用于种子纯度鉴定和未知种的识别14-22。第一章 材料和方法1.1 实验材料选用在长江流域棉区大面积推广种植的湘杂棉棉花系列，及另外两个对照杂交棉品种共14个杂交棉及湘杂棉棉花中的部分亲本自交系作为实验材料。这些材料全部由中国农科院棉花研究所提供（如表1.1，表1.2）。表1.1 供试棉花自交系名称编号名称1湘杂棉棉花2号母本2湘杂棉棉花2号父本3湘杂棉棉花4号母本4湘杂棉棉花4号父本5湘杂棉棉花5号母本6湘杂棉棉花5号父本7湘杂棉棉花6号母本8湘杂棉棉花6号父本9湘杂棉棉花10号母本10湘杂棉棉花10号父本表1.2 供试棉花杂交系名称编号名称1湘杂棉2号2湘杂棉3号3湘杂棉4号4湘杂棉5号5湘杂棉6号6湘杂棉7号7湘杂棉8号8湘杂棉9号9湘杂棉10号10湘杂棉11号11湘杂棉12号12湘杂棉13号13鲁棉研1914中棉所361.2研究方法1.2.1棉花基因组DNA的提取1.2.1.1棉花幼苗的培养用60左右的水浸泡棉种，水自然冷却，浸泡一昼夜；把浸泡好的棉花种子种入用培养盒装的沙土中，沙土湿度用手抓可以成团即可；培养盒加盖，放入人工气候箱，于28，12小时光照黑暗交替培养，五天后长出棉花幼苗。1.2.1.2 DNA提取方法DNA提取采用了CTAB法，以干种子脱去种皮，田间采摘的成熟叶片和幼苗子叶作为实验材料，具体方法如下：（1）把CTAB DNA提取液放入65水浴锅中预热。（2）取实验材料12 g，放入在- 40冰箱中预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状。（3）用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到1.5 mL Eppendorf管中，加入600 L预热的CTAB DNA提取液，临用前加2%的-巯基乙醇（如果是大田叶含棉酚量较高，可以适量多加入-巯基乙醇），总体积达到1 mL混匀后置65水浴中保温10 min以上，并不时轻轻转动试管。（4）加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻地颠倒混匀，至Eppendorf管中液体呈均匀发白状即可，室温下12000 rpm离心10 min，移上清至另一Eppendorf管中。（5）加1/100体积的RNase A溶液（10mg/mL），置37 2030 min（注：这一步骤在做大批量提取DNA，比如做种子纯度检测用DNA时可以省略，对DNA作为后面的SSR-PCR反应的模版不会有影响）。（6）加入2倍体积4冰箱预冷的100%乙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30 min或-80放置10 min，DNA凝聚成团，用枪头挡住DNA团把液体倒出。（7）用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于200 L的灭菌ddH2O中，于4备用或-20长期保存。1.2.2 DNA质量检测和浓度检测（1）预热分光分光度计20 min。（2）取10 LDNA样品，加水至2 mL在石英比色皿中混匀后，另取一只装空白溶液作对比。（3）分光光度计先用2 mL超纯水校正零点。（4）在260 nm和280 nm分别读出OD值。（5）DNA样品浓度计算：DNA浓度 (g/L)=OD260×样品稀释倍数 ×50/1000。（6）用OD260 nm/OD280 nm的比值来初步估测DNA的质量，紫外线分光光度计测定其OD260 nm/OD280 nm的比值约为1.8。若其比值>1.8，说明存在较多的RNA，这时可以用RNA酶处理样品；若比值<1.8，说明存在蛋白质杂质较多，这时可以用氯仿重新抽提样品进一步除去蛋白质杂质，直至到比值达到1.8左右。（7）取5L基因组DNA溶液，用0.8%琼脂糖凝胶电泳进一步检测其质量。然后将DNA用灭菌的ddH2O调至50 ng/ L，于20保存备用。1.2.3 SSR引物序列信息搜集在棉花专业网站（http:/cottondb.org）上，搜寻引物序列信息，共找到SSR引物序列105对，其中66对交与上海生工公司合成，39对于广东英骏公司合成，并于2011年12月份在中棉所另外筛选226对引物。因此整个实验共使用331对SSR引物，几乎完全覆盖了整个棉花基因组。1.2.4 PCR反应程序反应程序由中国农科院棉花研究所提供，具体如下：即先95预变性45 s，然后是94变性30 s，55退火45 s，72延伸45 s，再经过94 30 s，55 45 s，72 45 s 28个循环，最后94变性1min，55退火45 s，72延伸1 min，4结束。 1.2.5聚丙烯酰胺凝胶检测（1）清洗玻璃板：用自来水沾上洗洁精把玻璃板反复擦洗干净，用纯水擦洗两遍，干燥。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。（2）待玻璃板彻底干燥后装入胶框，底部用1%琼脂糖凝胶密封，待凝胶凝固后，进行电泳槽的组装。（3）8%聚丙烯酰胺凝胶的制备（如表1.3）表1.3 8%聚丙烯酰胺凝胶（2块胶）成分一次使用量30%丙烯酰胺10.8 mL5×TBE电泳缓冲液8 mLH2O21.2 mL10%AP(过硫酸铵)720 LTEMED28.2 L体积总计40 mL（4）灌胶：灌胶过程中注意防止出现气泡。待胶液流动到下部，在上部轻轻的插入梳子，置阳光下使其聚合完全。（5）扩增产物电泳：将聚合好的胶板按要求组装在电泳槽上，电泳缓冲液为1×TBE，在扩增产物中加入1.8 L溴酚蓝加样缓冲液混均匀，根据泳孔大小取适量1.7 L加入点样孔，200 V恒压电泳45分钟。（6）硝酸银染色(2块胶)固定：固定液（340 mL H2O+40 mL 95%酒精+20 mL 10%乙酸）固定56 min，可缓慢水平摇动，固定结束后，用纯水洗两遍。染色：染色液（0.6 g AgNO3+300 mL H2O）染色12分钟，期间缓慢水平摇动，染色结束后，用纯水洗两遍。显色：显色液（6 g NaOH+4 L甲醛+4 mL 0.2% Na2S2O3+400 mL H2O）倒入迅速震荡使显色液均匀作用，然后平行摇动，直到显影。清楚显影后，倒掉显色液，加纯水洗涤聚丙酰胺凝胶2次，彻底清洗显色液，以免凝胶变色。终止：终止液（3 g Na2CO3+400 mL H2O）中暂时保存，并用数码相机拍照保存。1.2.6湘杂棉棉花指纹图谱的构建为减少药品用量，节省实验成本，把优化好的SSR-PCR反应体系总体积减为10 L，其它成分均减半。利用此反应体系对331对SSR引物进行筛选，寻找在湘杂棉棉花之间，及湘杂棉棉花与部分亲本之间具有多态性的引物。利用筛选出的引物，构建湘杂棉棉花的指纹图谱，并对扩增谱带进行记录，以“1”和“0”分别代表同一位置扩增片段的有无，把19对引物对表1.2中的所有材料扩增的结果转化为以“1”和“0”代表的数字图谱，即构建了棉花的数字指纹图谱。指纹图谱用于未知种识别时，用数字图谱借助NTSYSpc2.1计算出未知种子与已知湘杂棉之间的相似系数，并对他们进行聚类分析，即可识别未知种。第二章 结果与分析2.1 DNA质量的检测结果10000bp615M7423891011121314CTAB法提取不同材料的棉花基因组DNA的检测结果如图2.1所示，表明该方法提取不同材料，均能获得质量较好的DNA。从图中可以看出，提取的DNA条带清晰，均无降解，使用CTAB法可获得质量较好的DNA。实验过程过中所使用的DNA模版均是使用CTAB法提取棉花幼苗所得。图2.1作为PCR模版的DNA电泳检测顺序对应表1.2M-Maker2.2 SSR-PCR反应体系的建立本实验所用SSR扩增的反应体系为：20L的反应体积中包括1.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，0.6 mol/L引物，1 UTaqDNA聚合酶，10×PCR buffer 2.0 L和50 ng模板DNA。但本实验为节省成本，采取的反应总体积为10 L，即其中反应成分均减半，具体实验过程中各成分加入量为：0.4 L Mg2+(25 mM)，0.2 L dNTPs(10 mM)，0.6 L引物(10 M)， 0.5 L TaqDNA聚合酶(1 U/L)，1.0 L 10×Reaction buffer，0.5 L模板DNA(50 ng/l)，6.2 L ddH2O。2.3湘杂棉棉花的指纹图谱2.3.1湘杂棉棉花多态性引物的筛选本实验选取分布于棉花26对染色体的331对SSR引物对表1.1中14个杂交棉品种进行了筛选，结果有314对能够扩增出条带，占检测引物的94.9%。在314对引物中有31对引物在这14个供试材料中显示出稳定的多态性，占检测引物的9.37%。从这些具有多态性的引物中挑出多态性较好，条带易读取的19对引物用于湘杂棉棉花指纹图谱的构建，这19对多态性较好的引物共检测到63条多态性片段，片段大小在95310 bp之间，平均每个位点的等位基因数为3.16个，变化范围25个。2.3.2多态性引物对湘杂棉棉花亲本自交系的扩增利用在湘杂棉棉花之间表现多态性较好的19对引物，对表1.1和表1.2中湘杂棉棉花及其部分亲本自交系进行扩增，结果显示在杂交棉中表现多态性较好的引物，在其自交系中也能表现出较好的多态性，但并不是所有多态性引物都能在亲本和杂交棉之间扩增出互补条带。图2.2至图2.6是利用筛选出的多态性引物对湘杂棉棉花及其亲本扩增的部分图片，从图中可以看出杂交棉与双亲条带类型具体出现以下几种情况：（1）双亲互补型，如图2.2中引物SSR005对湘杂棉棉花5号与其亲本的扩增；图2.3中引物SSR006对湘杂棉棉花4号、6号、10号与其各自的亲本的扩增；图2.4中引物SSR008对湘杂棉棉花5号与其亲本的扩增；图2.6中引物SSR012对湘杂棉棉花10号与其亲本的扩增均体现出了双亲互补带型，即母本和父本在在杂交种中表现为共显性，这类引物可以很容易是杂交种与双亲分开，因此可以用于杂交种种子纯度的鉴定。（2）偏母型，如图2.4中SSR008对湘杂棉棉花10号与其亲本的扩增带型就为偏母型，即杂交种偏母性遗传，在条带上就表现为杂交种条带与母本条带相同，这种类型引物无法使杂交种与母本分开。（3）偏父型，如图2.5中SSR020对湘杂棉棉花2号、6号及其亲本扩增的带型就表现为偏父型。（4）同双亲相同型，即对杂交种扩增的条带与双亲条带均相同，从图中可以看出这种情况出现较为普遍，不再列举。（5）其它类型，本实验中其他类型的出现情况较为复杂，从图片中可以很清楚的看出，如图2.2中湘杂棉棉花2号、10号父本的条带在杂交种中却未出现，但是SSR005扩增出湘杂棉棉花10号的带型及其父本、母本的带型均不相同，因此也可用于杂交种种子纯度的鉴定。SSR005在对湘杂棉棉花6号扩增时多出一条带既不是来自父本也不是来自母本。由于目前生产上利用的杂交种多数是单交种，由两个亲本自交系杂交而得到，它的遗传基础来源于双亲，所以杂交种有可能遗传了亲本不纯合的基因。在用SSR引物对棉花杂交种进行扩增时，若某些引物与不纯合位点存在同源序列，则该引物就可能表达，因而造成“偏父”“偏母”“其他型”类型的出现。但也有许多复杂的带型通过现在的遗传学尚无法很好的解释。160bp90bpM123456789101112131415图2.2 SSR005对中棉杂交棉和亲本的扩增图谱13分别为中棉2号及其母本，父本；46分别为中棉4号及其母本，父本；79分别为中棉5号及其母本，父本；1012分别为中棉6号及其母本，父本；1315分别为中棉10号及其母本，父本160bpM12345678910111213141590bp图2.3 SSR006对中棉和亲本的扩增图谱从左至右的顺序同图2.2147bp217bpM123456789101112131415图2.4 SSR008对湘杂棉和亲本的扩增图谱从左至右的顺序同图2.2217bpM123456789101112131415110bp图2.5 SSR020对湘杂棉和亲本的扩增图谱从左至右的顺序同图2.2242bpM123456789101112131415160bp图2.6 SSR012对湘杂棉和亲本的扩增图谱从左至右的顺序同图2.22.3.3特异分子标记从筛选出的31对多态性引物中挑出19对多态性丰富，容易记带的引物，其中SSR001是湘杂棉棉花3号的特异引物（如图2.7），SSR005是湘杂棉棉花10号的特异引物（如图2.11），SSR011是湘杂棉棉花7号的特异引物（如图2.17），SSR013是湘杂棉棉花12号的特异引物（如图2.19），SSR016是湘杂棉棉花2号的特异引物（如图2.22），这些特异引物对这些杂交种的扩增带型与其它杂交种均不相同，只需要一对这样的引物就可以把它们与其它杂交种相互区分。这些特异引物只是通过对14个杂交种的扩增得到的，但是有些特异性引物却并不能把杂交种与其亲本相互区分，比如SSR016可以把湘杂棉棉花2号与其它湘杂棉棉花品种相互区分，但却不能把它与其母本区分开来。至于湘杂棉棉花7号，12号，3号的特异引物是否表现为共显性，由于本实验中它们亲本材料的缺乏，还有待于检验。3.3.4湘杂棉棉花指纹图谱的构建实验过程中，并不是每种湘杂棉棉花品种都能找到其特异的引物，有些即使找到，这些引物也只是在这14个杂交棉品种中具有特异性，如果扩大杂交种品种数量检验，有些特异性引物就有可能变为非特异性了，为使表1.2中每一个湘杂棉棉花都能与任何一个杂交棉品种以及与它们亲本相互区分，实验利用挑选出的19对引物对14个杂交棉品种进行扩增如图2.7图2.25，为它们制作了代表它们品种特异性的指纹图谱。本实验在建立指纹图谱时，为了提高其准确性与可靠性，选择主带作为指纹图谱的统计数据。图2.8 SSR002对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314242bp147bp图2.7SSR001对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314160bp90bp图2.10 SSR004对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314242bp180bp图2.9 SSR003对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314404bp180bp图2.12 SSR006对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M123456789101112131490bp160bp图2.11 SSR005对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314180bp90bp图2.14 SSR008对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314309bp160bpM1234567891011121314309bp190bp图2.13 SSR007对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2图2.16 SSR010对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M123456789101112131490bp160bp图2.15 SSR009对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314110bp201bp图2.18 SSR012对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314404bp180bp图2.17 SSR011对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314242bp147bp图2.19 SSR013对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314309bp147bp图2.20 SSR014对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314404bp238bp图2.21 SSR015对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314309bp180bp图2.22 SSR016对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314309bp147bp 图2.24 SSR018对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314404bp180bp图2.23 SSR017对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314404bp180bp图2.25 SSR019对14个杂交棉的扩增结果从左至右顺序对应表1.2M1234567891011121314309bp180bp2.4 未知种身份识别将湘杂棉指纹图谱的19对多态性引物对未知种的扩增结果，转化为数字图谱，借助NTSYSpc2.1计算出未知种子与已知湘杂棉之间的相似系数，并对他们进行聚类分析（如图2.26），通过聚类图很直观的能够看出未知种与序号为5的湘杂棉6号遗传相似系数达0.97，因此可以初步判断未知种为湘杂棉6号。经过进一步比对未知种与湘杂棉6号的指纹图谱，发现由于对引物SSR010和SSR011谱带读取错误的原因，导致了它们之间的相似系数为0.97而非1。经过两者指纹图谱的比对，完全证实了未知种即为湘杂棉6号。图2.26 未知种与14个杂交棉品种基于SSR的聚类图（品种编号同表1.2）-0第三章 讨论3.1 棉花DNA的提取总DNA的提取与纯化是PCR检测、限制性酶切和分子杂交等分子生物学研究工作的首要步骤，因此DNA质量的好坏将对进一步的研究工作产生影响。棉花中酚类物质的含量很高，容易被氧化而褐变，并与DNA结合成粘稠的棕色复合物。在提取液中添加还原剂-巯基乙醇还原剂，可以防止酚类物质的氧化，同时加入PVP 40，PVP 40可以与酚类物质结合形成鳌合物，通过离心除去，提高DNA的得率和纯度。CTAB是一类去污剂，其作用是破坏细胞膜释放DNA，此外与提取缓冲液中的EDTA一起，共同保护DNA免受内源核酸酶的降解23-24。因此，这种方法一直是植物DNA提取的有效方法。本实验采用该方法分别对杂交棉子叶和田间成熟叶进行DNA提取，在提取液配制和提取步骤上都做了简化，提出的DNA质量可以满足棉花方面任何分子生物学研究的需要。在对干种子的提取时，由于多糖和蛋白的干扰含杂质仍较多，无法完全除去，但如果实验时间比较紧迫，后续实验对DNA模版质量要求不是很高的情况下，也可以采用干种子提取。3.2 杂交棉指纹图谱的构建本实验中共筛选331对引物，具有多态性的引物有31对，仅占检测引物9.37%，远远低于参考文献中所提到其它作物中实验得的数字，分析原因可能是由于杂交棉品种之间亲缘关系太近，导致很难找出能区分它们的多态性引物，这点从聚类图2.26就可以得到证实。所以在做杂交棉指纹图谱时，要尽可能的寻找其他研究者已证实在杂交棉品种中具有多态性的引物，不然只是随机挑选均匀分布棉花26对染色体上的SSR引物，会大大增加实验成本，但这也提示我们在棉花自交系选育、杂交种组配时应广泛收集未利用的种质资源，拓宽育种材料的遗传基础25。第四章 结论本实验从棉花26对染色体上挑选了331对SSR引物进行筛选，其中有31对能够在实验材料中显示多态性，占检测引物的9.37%。从这些具有多态性的31对引物中挑出19对多态性较好，条带易读取的引物构建了湘杂棉棉花指纹图谱。这19对多态性较好的引物共检测到63条多态性片段，片段大小在95310 bp之间，平均每个位点的等位基因数为3.16个，变化范围25个。利用这19对引物构建的指纹图谱可以区分开所有的供试材料。参考文献1 杨芳荃. 杂交棉及其推广应用前景J. 湖南农业科学, 2004, (4): 6-82 蒋和平, 孙炜琳, 陈曦. 中国种业发展的现状及对策J. 农业科技管理. 2004, (2): 23-283 苏顺宗. 利用SSR分子标记鉴定杂交水稻种子纯度的研究D. 四川: 四川农业大学, 20034 赵久然. 中国玉米标准DNA指纹库的构建J. 中国可持续发展, 2005, (8): 63-66 5 黎 裕. 分子标记的种类及发展J. 生物技术通报, 1999, (4): 19-226 薛 艳, 张新宇. 新疆早熟棉品种SSR指纹图谱构建与品种鉴别J. 棉花学报, 2010, 22(4): 360-3667 王俊芳, 杨伟华. 棉花品种指纹图谱构建及棉种鉴定技术研究J. 中国棉花, 2009, 36(3): 6-218 潘兆娥, 王希文. 中棉所48的SSR数字指纹图谱构建J. 中国农学通报, 2010, 26(7): 31-359 李成奇, 王晓芸. 百棉系列棉花自交系品种（系）SSR指纹图谱构建J. 棉花学报, 2011, 23(3): 228-23410 孙 宁, 杨付新. 国家棉花区试新品种的SSR指纹图谱分析J. 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