毕业设计（论文）禺毛茛叶绿体SSR引物筛选.doc

JIU JIANG UNIVERSITY毕 业 论 文题 目 禺毛茛核基因的筛选 院 系 生命科学学院 专 业 生物科学 姓 名 班 级 指导教师 二零一二年五月摘 要毛茛属(Ranunculus)共有2000种，我国有122种。禺毛茛复合体(R. cantoniensis complex)是其中形态相近的复合分类群。该复合体及其近缘种具有进化历史的悠久性、生长习性上的多样性、倍性上的多倍性以及遗传变异的丰富性等特点。SSR (Simple Sequence Repeat)已经成为一种非常成熟的分子标记技术。本文利用8对R. macranthus叶绿体SSR引物，通过SSR-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在禺毛茛中筛选出2对多态性高的SSR引物（RC2F/RC2和RRC7F/RC7R）。利用这2对引物对猫爪草和肉根毛茛叶绿体基因进行扩增，扩增产物有多态性，通过这种方法可以快速鉴定猫爪草和肉根毛茛。因此，这些多态性引物的获得，为今后禺毛茛以及毛茛属植物系统进化和种间关系的研究提供更多的资料。【关键词】 禺毛茛；核基因；PCR；引物.AbstractRanunculus have 2,000 species and about 122 species lie in China.R. cantoniensis complex (R. cantoniensis complex) is the composite group of taxa with similar morphology. The complex and its closely related species are featured by long evolutionary history, growth habits of the diversity, ploidy and polyploidy on the richness of genetic variation and others. SSR has become a very sophisticated molecular marker technology. In this paper, using eight pairs of R. macranthus chloroplast SSR primers found 2 highly polymorphic SSR primers (RC2F/RC2R and RC7F/RC7R) by SSR-PCR and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis in R. cantoniensis. R. ternatus Thunb and R. polii Franch. ex Hemsl chloroplast genes were amplified using this two pairs of primers, PCR products had polymorphism. In this way, R.ternatus Thunb and R. polii Franch. ex Hemsl were identified quickly. The acquisition of these polymorphism primers will provide more information for phylogenetic evolution and this relation between species research of Ranunculus cantoniensis.Key words Ranunculus cantoniensis; SSR molecular marker; Polymorphism; Primers; Screening目录摘 要IAbstracti引言11.1禺毛茛的简介11.1.1禺毛茛形态学特征11.1.2禺毛茛的药物成分和药用价值11.2 SSR分子标记介绍及研究进展11.3 PCR技术21.4 琼脂糖凝胶电泳21.5 研究背景及意义32 研究材料与实验方法42.1研究材料42.2 实验仪器及试剂52.2.1仪器52.2.2 实验试剂52.2.3主要试剂配制52.3 实验方法62.3.1 总DNA 的提取步骤62.3.2 1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提总DNA的纯度72.3.3 DNA与引物稀释72.3.4 PCR扩增体系的建立82.3.5 PCR 产物电泳检测82.3.6 引物筛选103 实验结果与分析113.1 禺毛茛总DNA提取结果113.2 SSR-PCR扩增结果113.3 引物筛选结果124 讨 论144.1 DNA的提取方法144.2电泳点样量144.3 银染方法144.4叶绿体SSR-PCR154.5 引物多态性154.6 利用多态性引物鉴别猫爪草和肉根毛茛15结 论16参 考 文 献17谢 辞19引言1.1禺毛茛的简介1.1.1禺毛茛形态学特征禺毛茛（Ranunculus cantoniensis DC）属毛茛科毛茛属匍枝毛茛系，又名自扣草，水辣菜，为多年生草本，须根伸长簇生。茎直立，高25-80厘米，上部有分枝，与叶柄均密生开展的黄白色糙毛。叶为三出复叶，基生叶和下部叶有长达15厘米的叶柄；叶片宽卵形至肾圆形，长3-6厘米，宽3-9厘米，小叶卵形，宽2-4厘米，2-3中裂，边缘密生锯齿或齿牙，顶端稍尖，两面贴生糙毛；小叶柄长1-2厘米，侧生小叶柄较短，生开展糙毛，基部有膜质耳状宽鞘。上部叶渐小，三全裂，有短柄至无柄。花序有较多花，疏生；花托长圆形，生白色短毛。聚合果近球形，直径约1厘米；瘦果扁平，长约3毫米，宽约2毫米。分布于云南、四川、贵州、广西、广东、福建、台湾、浙江、江西、湖北、江苏、等省区。生于海拔500-2500米的平原或丘陵田边、沟旁水湿地。印度、日本、越南等地也有1, 2。1.1.2禺毛茛的药物成分和药用价值禺毛茛具有清热，截疟，平喘，止痛，消肿等医用功效。 用新鲜禺毛茛植物捣烂外敷，可治疗黄疸、疟疾、哮喘、风湿关节痛、鹤膝风、恶疮、疥癣、牙痛等疾病。对革兰氏阳性及阴性细菌、白色念珠菌有抑制作用。 接触皮肤有强烈刺激性，内服可引起剧烈胃肠炎1, 3。1.2 SSR分子标记介绍及研究进展SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）又称微卫星（Microsatellite，MS），是当今四大分子标记技术之一4。基序长16bp，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复序列，广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，而且分布比较均匀，平均每10kb的DNA序列中就会出现一个微卫星序列，再加上SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。SSR的两端有一段保守的DNA序列，根据这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物，对SSR进行PCR扩增，就可扩增出其长度多态性，即SSR分子标记5。由于SSR位点具有较高的突变率(10-210-6)，所以其重复基序的数目变化大，SSR显示出较强的多态性。它呈共显性，符合孟德尔遗传模式，在数量方面没有生物学的限制，而且该标记易于操作，具有高度重复性和可靠性，被认为是目前最好的分子标记6, 7。它成为构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测和目标性状分子标记筛选的理想工具8。目前，应用生物信息学软件来进行SSR引物开发的研究已经崭露头角。在小麦9、水稻10等物种中已初见成效。不仅能够开发出新的SSR标记位点，而且能够将所开发出的标记定位于连锁群上，进行应用；而且在不同物种中开发共用的SSR引物也已由于生物学数据库的日益丰富和生物信息学软件的出现而成为可能4。1.3 PCR技术1985年Mullis等人首创了一种全新的DNA扩增技术即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)，就是利用DNA聚合酶进行体外扩增DNA的技术。它是近年来分子生物学领域的一项重大技术突破，给整个分子生物学研究方法带来了一次重大的革命。PCR是由引物介导在酶促作用下在体外将特异DNA片段进行扩增的方法。它由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，重复循环进行，从而使目标DNA得以迅速扩增。PCR的出现使得原先难以检测到的单拷贝DNA产生的差异扩增数百万乃至上亿倍而得以检测。该方法具有简便、快速的特点，是绝大多数以核酸作为研究对象的分子标记技术的基础11, 12,29。1.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增的结果可以首先用琼脂糖凝胶电泳13检测，但这种方法很难检测出等位基因片段相差较小的产物之间的差别，尤其是当微卫星各等位基因片段间的多态性仅表现为几个bp的差异时，一般都需要采用变性或非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术14来检测微卫星序列的多态性。但非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在检测微卫星时往往产生较多的非特异性带，因而最好采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。微卫星的扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，目标产物的检测主要采取显色法，如放射自显影法、荧光染料标记法、溴化乙锭(EB)法和银染法。放射自显影法具有灵敏度高、可靠性强等优点，但是有放射性同位素操作，而且过程比较繁琐；荧光染料标记法检测灵敏度低；EB染色法方便易行，但聚丙烯酰胺对EB的荧光有猝灭作用，大大降低了溴化乙锭染色灵敏度；因此，现在趋向于使用银染法来检测扩增产物。银染的原理是：当银离子与核酸中带负电荷的磷酸基团共价结合后，在碱性环境条件下，由甲醛还原成黑褐色的金属银沉积于胶中而显示DNA带型，从而使胶中核酸所在的位置显示出颜色来15, 16。1.5 研究背景及意义R. macranthus的叶绿体基因组已经完全破译，但是对该属的系统发育和种间关系的研究甚少。本文试图利用已测序的毛茛属叶绿体基因以及查找到的毛茛属植物叶绿体基因中的SSR位点，并利用叶绿体SSR引物，通过SSR-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，筛选出条带清晰、多态性高的叶绿体SSR引物，确定SSR位点在禺毛茛中的多态性，为今后禺毛茛以及毛茛属植物系统进化和种间关系的研究提供更多的资料。猫爪草是毛茛属中唯一被录入中药药典的植物，每个地方的猫爪草的药用价值不同。猫爪草的块根极小却具有很高的药用价值。肉根毛茛块根很大，药用价值却不及猫爪草。据报道，目前，由于人们对肉根毛茛和猫爪草两种晒干的中药材还不能进行准确的鉴定，所以很多不法药商都把肉根毛茛充当猫爪草以高价出售，从中牟取暴利。这使得我们国家蒙受经济损失。本研究拟从禺毛茛叶绿体基因中筛选出多态性高的叶绿体SSR引物，然后用多态性高的叶绿体 SSR 引物对所采的猫爪草和肉根毛茛的叶绿体SSR位点进行扩增，从扩增出来的电泳图谱对猫爪草和肉根毛茛加以辨别并找出猫爪草中多态性高的SSR位点，期望为猫爪草和肉根毛茛的快速鉴别以及寻找药用价值最高的猫爪草提供思路。2 研究材料与实验方法2.1研究材料于2009年5月10日采自九江市南湖公园，每一份采集样本的植株之间至少相隔30m，以尽量保证包含不同的基因型。取禺毛茛、猫爪草和肉根毛茛的嫩叶及幼叶，保存于硅胶中，实验室存放于-70的冰箱3，其详细材料见表2.1。表2.1 实验材料Table.2.1 Experiment materials实验材料名称个体数生境禺毛茛23路边猫爪草12路边肉根毛茛17路边叶绿体SSR引物是由本实验室的指导老师用Primer5软件设计的，由上海生物工程有限公司合成（见表2.2）。表2.2 Primer pairs used to amplify the 9 nuclear lociLocus Fragment Size (bp)Primers (Forward=top; Reverse=bottom)Acetyl-CoAcarboxylase (Acetyl)577ATTCGCGGAGCTACATGATACCTACTGCTACTTTCAACAATCAACDefensin protein (DEFEN)683GCAACATGCGTCTAGTTTCAGGAACCACGAAGGTGACCCTGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPC)1097GTCTGAGGGCAAACTGAAGGAAACCTGAAGCAGCAATAGGAHistone H3358CAAACTTCCCTTCCAACGTCAACTTCCGATATATTTCATTCATTGHSP70-1 (HEAT)1281TCTTCAGGGAGAGAGAGAGTTTGATTACTTCCCCACCATCAGGApetala-III (AP3)1093TGAGTCTGTGAAACTTGTTCGGGGCAATGCGAATAGCAATGCCLFY 575CCCAACCAAGGTATGAATACCTGAATTGCATGTCGATACACPistalla-AqaPI-1 (Pist)1200CGAACTCAGGCACTTGAAGGGCATTGTTGAATGTTGATACACTCTGlycosyl transferase (UF3GT)473GAGGAAGCTTTGCCAGAGGAAATGCGACACTGCGACATA2.2 实验仪器及试剂2.2.1仪器恒温水浴锅（型号HH-4，常州国华电器公司）；Thermo移液器；TGL-16G 离心机；BIO-RAD PCR自动系列分析仪（型号PCR-2400）；BIO-RAD电泳仪（型号DYY-12，北京市六一仪器厂）；BIO-RAD 电泳槽；凝胶成像系统仪；胶片观察灯（型号WD-9406，北京市六一仪器厂）；脱色摇床（型号WD-94054A，北京市六一仪器厂）；立式电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-30KBS）。2.2.2 实验试剂2×CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 4%）；Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷 PH8.0）；EDTA(乙二胺四乙酸) ；巯基乙醇；氯仿/异戊醇（24：1）；NaCl（5mol/L）；异丙醇；70%的乙醇，无水乙醇；50%的乙醇；1%琼脂糖；TE缓冲液（PH8.0）；1×TAE（用时将50×TAE稀释50倍成工作液）；10×Buffer；MgCl2；TaqDNA聚合酶；dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；溴酚蓝；EB染色液；1×TBE（10×TBE稀释10倍成工作液）；丙烯酰胺；甲叉丙烯酰胺；尿素；硼酸；过硫酸铵；TEMED；亲合硅烷；去离子水；二甲苯氰；Loading Buffer；Marker；蒸馏水；冰醋酸；37%甲醛；硝酸银 (1g/ml)；无水碳酸钠；硫代硫酸钠。2.2.3主要试剂配制Tris-HCl（PH=8.0）： 121 g Tris碱 800 ml 蒸馏水 42 ml HCl 混匀后加H2O定容至1LEDTA(乙二胺四乙酸)： 186.1 g Na2EDTA·2H2O 700 ml H2O 50 ml NaOH（10 mol/L）调PH至8.0 加H2O定容至1 LTE缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25）1 mmol/L EDTA（pH 8.0）50×TAE（贮存液）： 242 g Tris碱 57.1 ml 冰醋酸 37.2 g Na2EDTA·2H2O（pH 8.0） 加H2O定容至1L 10×TBE（贮存液）： Tris 碱 108 g 硼酸 55 g EDTA（0.5moll） 40 ml PH 8.0 去离子水 1 LLoading Buffer： 98%甲酰胺 49 ml 10mM EDTA（PH 8.0） 1 ml 0.25% 溴酚蓝 0.125 g 0.25% 二甲苯青 0.125 g6% PA： 丙烯酰胺 60 g 甲叉丙烯酰胺 3.157 g 尿素 420.42 g 10×TBE 100 ml 去离子水 1 L2.3 实验方法2.3.1 总DNA 的提取步骤CTAB法17-20：（1）从-70箱中取出硅胶干燥的材料10片嫩叶（芽）放入干净的研钵内，加入64预热的2 ×CTAB 700 l、巯基乙醇50 l(一滴)，迅速研磨成糊（尽量不要产生气泡）。（2）转移到1.5ml离心管中，64保温50 min（每5-10 min混匀一次）。（3）加入等体积的冰冷氯仿异戊醇（V/V=24:1），混匀，12000转离心10min；（4）转移上清 重复（3）一次。（5）转移上清，加入2/3体积冰冷的异丙醇，1/3体积 5 mol /l NaCl，4静置40 min。（6）12000转离心10 min；倒掉上清，用70%乙醇洗涤1次（200l/次），10000 rmin 离心5 min。（7）倒掉上清，用70%乙醇洗涤（200l/次），10000 rmin 离心10 min。（8）倒掉上清，加100%乙醇，12000 r/min 离心 10 min。（9）弃上清，放入烘箱37烘干。烘干后加50 l TE溶解，4保存。2.3.2 1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提总DNA的纯度（1）制胶：称取1.0 g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入100 ml 1× TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热，待胶完全溶解；（2）冷却：从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60）；（3）制胶板： 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固；（4）加缓冲液：在水平电泳槽中加满1×TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至100 V(5 V/cm)，注意正负电极的位置连接正确；（5）放胶：待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极；（6）点样：加入适量加样缓冲液，然后用移液器取3 µ1的提取样品与之混合并转移到凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.0 µ1 DNA分子量标准物）； （7）电泳：打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约40 min；（8）当溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1 cm时，关闭电源取出模具和凝胶，放入EB中染色15-30 min后， 在凝胶成像仪中拍照13。2.3.3 DNA与引物稀释 将23株禺毛茛、12株猫爪草以及17株肉根毛茛的DNA 原液分别稀释10倍。由上海生工合成的8对引物储存液稀释20倍成工作液以待使用。2.3.4 SSR-PCR扩增体系的建立PCR扩增反应在BIO-RAD PCR仪上完成,所需的Buffer缓冲液、MgCl2、TaqDNA聚合酶、四种dNTP等均由上海生物工程有限公司提供。SSRPCR21, 22反应体系（20 ul）：试剂用量10×buffer2.5 lMgCl2（25 mM） 2 ldNTPs（2 mM）2.5 lPrimer1（5 ） 2 lPrimer2（5 ） 2 lTaq E （5U/l）0.2 lDNA(50-100 ng) 1 ulddH2O 8 lSSR-PCR 反应程序：94预变性5 min 94变性45 s 50 退火30 s 30个循环；72延伸45 s 72延伸5 min。4保存。2.3.5 SSRPCR 产物电泳检测2.3.5.1 1%的琼脂糖凝胶电泳检测SSR-PCR产物的有无13扩增产物用1.0%的琼脂糖胶，在1×TAE缓冲液中电泳分离。DNA的分子量标记梯度为1 00 bp-3000 bp。电泳结果用紫外成像仪记录。实验步骤同2.3.2。2.3.5.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR-PCR产物的特异性和多态性1）电泳准备玻璃板的清洗：用热水浸泡1020分钟后，然后用刀铲去凝胶，再用自来水冲洗，直至玻璃板光滑。用酒精擦3次、用去离子水冲洗干燥。向标有“此面向外”的玻璃板涂上 0.5Binding Silane （现用现配：1 ml 50% 无水乙醇6 ul Binding Silane）、风干、10 min（为防止两块玻璃板互相污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶）。组装玻璃板，并调水平。聚丙烯酰胺变性胶的配制将50 ml 6%PA 胶倒入灌胶瓶中，并将瓶放入真空干燥箱中抽真空（0.080.09Mpa）10 min，再向其瓶中加10%过硫酸铵 50 l、TEMED 50 l（与胶的体积相同），摇匀。灌胶：把胶沿灌胶口边轻轻敲打（倾斜70°80°），边轻轻灌进，防止出现气泡。待胶流动到玻璃板底部，在灌胶口插入梳子，让其充分聚合 1.5h左右。扩增产物变性：向扩增产物中加入 4 l Loading Buffer，95变性 5 min 后立刻置于冰中冷却10 min。2）扩增产物的电泳将胶板安装在电泳槽内，向电泳槽的正极加入 1×TBE，下槽加入 1×TBE下槽电极液。预电泳：恒定功率（55 W），至胶板的温度达到40为止。清除胶面沉积的尿素和气泡，插入样品梳子。加入变性的扩增样品 DNA 46 ul，恒功率55 W电泳约 1.5 h（视 SSR 分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴涂有 Binding Silane 的玻璃板上。3）扩增产物的银染显色 固定：电泳结束后，将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，小心分开两块玻璃板，将带胶的长板放入10%的冰醋酸溶液（1 L蒸馏水+100 ml冰醋酸）中摇动固定20-30分钟至完全脱色。 水洗：取出长板用蒸馏水在水洗盒中漂洗10分钟（1L蒸馏水）。 银染：取出长板放入含 1 ml 37%甲醛+ 1 ml 1 g/ml AgNO3溶液+1 L蒸馏水中染色 30 分钟左右。 显影：染色完毕后在1L蒸馏水中迅速漂洗 10次，转入预冷的碳酸钠溶液中（1 L 中加入30 g 的无水碳酸钠），用前加 1 ml 37%甲醛和 200 l 浓度为10 mg/ml 硫代硫酸钠，在摇床上显影至条带清晰为止。 终止（定影）：当条带清晰时，将玻璃板取出放入固定时用的 10%的冰醋酸溶液中，终止固定2 分钟左右。 漂洗：将板放入蒸馏水中漂洗 l0 分钟。 干燥：胶板置室温下自然干燥。待聚丙烯酰胺凝胶电泳板干燥，对其进行图谱记录；在拍照或扫描保存后，清洗玻璃板以备下次使用14。2.3.6 引物筛选筛选依据条件：条带清晰，不弥散，不模糊；所有样品均有质量好的条带；空白中无或少假带；条带重复性好3, 23-26。3 实验结果与分析3.1 禺毛茛总DNA提取结果图3.1禺毛茛总DNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3.1 Agarose gel electrophoresis of the Ranunculus cantoniensis total DNA本研究使用CTAB 法提取禺毛茛总DNA。主要是在缓冲液中加入2%-巯基乙醇以及增加CTAB的浓度，从实验结果可以看出，CTAB法能有效地去除酚类化合物、多糖和蛋白质，虽有一定程度的弥散，但提取的 DNA质量较高，完全可以用于SSR分子标记分析（图3.1）。3.2 SSR-PCR扩增结果图3.2 禺毛茛SSR-PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳Fig.3-2 Ranunculus cantoniensis SSR-PCR results of agarose gel electrophoresis经过多次实验，证明该叶绿体SSR引物通过SSR-PCR都能将禺毛茛的叶绿体基因中的SSR位点扩增出来。扩增条带清晰，不弥散，不模糊；所有样品均有质量好的条带；空白中无或少假带；条带重复性好（见图3.2）。3.3 引物筛选结果图3.3.1RC2F-RC2R在禺毛茛中的扩增结果Fig.3.3.1 RC2F-RC2R amplification on Ranunculus cantoniensis图3.3.2RC7F-RC7R在禺毛茛中的扩增结果Fig.3.3.2 RC7F-RC7R amplification on Ranunculus cantoniensis在实验中淘汰了扩增后多态性不理想的引物，选留那些扩增条带清晰而且有明显多态性片段的引物，最终获得二对适用于禺毛茛及毛茛属植物亲缘关系研究的SSR引物RC2F-RC2R和RC7F-RC7R（图3.3.1和图3.3.2）。注：实验材料从左到右的顺序为：前面12个泳道是猫爪草，后17个泳道是肉根毛茛。图3.3.3 筛选出来的SSR引物RC2F-RC2R在猫爪草和肉根毛茛上的扩增结果Fig.3.3.3 SSR primers screened out RC2F-RC2R amplification on Ranunculus ternatus Thunb and Ranunculus polii Franch. ex Hemsl注：实验材料从左到右的顺序为：前面12个泳道是猫爪草，后17个泳道是肉根毛茛。图3.3.4 筛选出来的SSR引物RC7F-RC7R在猫爪草和肉根毛茛上的扩增结果Fig.3.3.4 SSR primers screened out RC7F-RC7R amplification on Ranunculus ternatus Thunb and Ranunculus polii Franch. ex Hemsl用筛选出来的2对叶绿体 SSR 引物RC2F-RC2R和RC7F-RC7R对猫爪草和肉根毛茛的叶绿体SSR位点进行了扩增，每个样品均能获得清晰的扩增条带（见图3.3.3和图3.3.4）。统计每对引物扩增出的总带数和其中的多态性带数见表3.1。表3.1 引物的多态性分析统计表实验材料引物编号引物 （5 3）序列扩增谱带数/条多态性谱带数/条多态性百分率%猫爪草RC2FTTTCTCCCCACATTTCCTCT12 433.33%RC2RCTATCCGACTTTTGGTTGTT肉根毛茛RC2FTTTCTCCCCACATTTCCTCT1700%RC2RCTATCCGACTTTTGGTTGTT猫爪草RC7FTTGGGGTTATAGTTGATGGT1218.33%RC7RGCGATTCAATAAAAGGAAAA肉根毛茛RC7FTTGGGGTTATAGTTGATGGT1700%RC7RGCGATTCAATAAAAGGAAAATable 3.1 Statistics of primers polymorphism从表3.1可以得出：用SSR引物扩增的猫爪草SSR位点的多态性很低，而肉根毛茛却无多态性。可能的原因：猫爪草以及肉根毛茛都主要行无性繁殖，而且叶绿体基因行母性遗传27, 28，再加上本实验所使用的材料都是在一个地方（九江）采集的，它们的亲子带之间的遗传物质基本上相同，所以在其SSR位点上基本上就没有多态性。4 讨 论4.1 DNA的提取方法用CTAB法提取的DNA无论质量还是数量均有很大的提高，其纯度和浓度均达到SSR反应的要求。DNA模板的适宜范围较大，一般而言，模板DNA在5100 ng均有PCR产物，但不同物种DNA结构不同，具体的最适DNA用量也有差异17-20。4.2电泳点样量聚丙烯酰胺凝胶具有极高的分辨率，能检测到少于10 ng的DNA条带。但其效果与电泳点样量有直接关系，若点样量过多，就会使相差1-5 bp的条带连在一起，难以分辨，且容易从点样孔溢出，造成样品见的相互污染；点样量较少，则电泳检测的条带较细，颜色较浅，不易识别。因此要根据点样孔的深浅确定点样量的多少，而点样缓冲液（包含指示剂）与PCR产物的比例根据前期实验基本为20 ul产物中加入5 ul缓冲液。4.3 银染方法硝酸银染色是一种检测微量DNA的理想方法。该法具有经济简便、快速灵敏、无污染、分辨率高，结果可永久保存等优点。但是硝酸银染色容易造成背景较深，与条带反差较小等结果，这可能是由于染色时间过长、染色后漂洗时间较短、显影液温度较高或显影时间较长造成的。因此，硝酸银染色时间一定要严格控制，银染后漂洗幅度频率要大，漂洗时间要把握准确，显影过程要时刻观看，防止显影时间过长，及时将胶板移入固定液中终止显影反应。当前较常用的是Bassam和Sanguinetti两种银染法15, 16，但Sanguinetti法的背景色较深，不易人工读带，本文采用Bassam法略加改动，在显影时加入的甲醛量由1.5ml改为1ml，使得显影更容易控制，且背景色浅，方便读带。4.4叶绿体SSR-PCR由图3.2知，毛茛属叶绿体基因SSR位点很容易扩增出来，所以本实验就无须进行PCR反应体系优化，直接用叶绿体SSR引物的Tm-5来确定退火温度，扩增出理想的SSR片段。查文献可知，对核基因进行PCR时，为了能获得尽可能清晰的条带，都要对PCR反应体系进行优化，筛选出最佳反应体系。这说明叶绿体基因比核基因容易扩增。4.5 引物多态性从已知的8对引物中筛选出2对条重复性好且多态性丰富的引物，对毛茛属的2个种（猫爪草和肉根毛茛），共29个样本进行了SSR-PCR扩增，根据不同种在同一位点频率的差异，统计了2个种的总条带数及多态性条带数(表3.1)。2对引物都能扩出比较清晰的条带(图3.3.3和图3.3.4)，共扩增出58个位点，多态位点数为5个。本研究表明，SSR位点在这三种毛茛属植物中的多态性比率不高。可能是由于本实验所使用的材料都是在一个地方（九江）采集的，猫爪草以及肉根毛茛都主要行无性繁殖，而且叶绿体基因行母性遗传27, 28，它们的亲子带之间的遗传物质基本上相同，所以在其SSR位点上基本上就没有多态性。4.6 利用多态性引物鉴别猫爪草和肉根毛茛由图3.3.3可知，用筛选出来的一对叶绿体 SSR 引物RC2FRC2R对猫爪草和肉根毛茛的叶绿体SSR位点进行扩增，猫爪草的SSR位点长度明显小于肉根毛茛，猫爪草的SSR位点具有很高的多态性，完全可以作为寻找药用价值最高的猫爪草的分子标记。通过这种方法可以快速鉴别猫爪草和肉根毛茛：如果是猫爪草和肉根毛茛的混合物，则通过SSR-PCR变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能跑出两条带；反之聚丙烯酰胺凝胶电泳图是一条带，将带与Marker对比，即可鉴别出是猫爪草还是肉根毛茛。与细胞鉴定，测序鉴定等方法相比该方法快速、简便，整个实验过程仅需几个小时。因此，本实验的研究结果可以用于猫爪草和肉根毛茛的分子鉴定。结 论本文初步建立了毛茛属叶绿体SSR-PCR扩增试验体系，并通过对8对毛茛属叶绿体SSR引物的筛选。筛选出多态性较高、扩增条带清晰的2对引物，为进一步对禺毛茛遗传多样性研究提供依据。同时本实验所筛选出来的叶绿体SSR引物也为该属植物的研究提供了有效的SSR分子标记引物。从扩增的结果上看所筛选的SSR引物可以应用于猫爪草和肉根毛茛的鉴定，也可用于寻找药用价值最高的猫爪草。随着对禺毛茛的进一步开发利用和研究，SSR分子标记将被广泛应用于禺毛茛的品种鉴定、遗传分析、遗传图谱建立、分类研究和种质资源鉴定等各个领域29-31。但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，其开发费用相当高，因而各个实验室必须进行合作才能开发出更多的引物32。有研究表明，同一SSR引物能在不同亚种间、种间、属间、甚至于不同科间进行扩增。如采用中华猕猴桃中所开发的263对SSR引物，有75能在猕猴桃科下 8 个不同种中扩增出产物。 Decroocq 等33的研究表明葡萄属中开发的SSR引物能够用于其属下不同的种，但杏属中开发的引物只能用于该属下面的近缘种，表明不同物种的SSR边界序列具有不同的保守性32。当然本实验的结果也可以说明这一点。参 考 文 献 1 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志(第28卷)M.北京:科学出版社, 1979. 2 聂谷华等, 禺毛茛居群地理变异研究. 安徽农业科学, 2009. 37(001): 173-176页. 3 赵中伟等,禺毛茛SRAP反应体系优化及引物筛选. 江苏农业科学, 2009(004): 第28-31页. 4 孙佳莹等, SSR引物开发的生物信息学算法. 生物技术, 2006. 16(4):第80-82页. 5 孟清照