毕业论文（设计）茶叶内生菌的分离鉴定及其生防功能初探.doc

茶叶内生菌的分离鉴定及其生防功能初探朱育菁，陈 璐，蓝江林，苏明星，刘 波收稿日期： 修回日期：基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2006AA10A211）；福建省发展与改革委员会“五新项目”（闽农产(2006)10号）；福建省农科院科技创新团队建设基金（STIF-Y03）；福建省科技平台建设项目（2007N2010）资助。作者简介：朱育菁（1972），女，副研究员，博士。研究方向：植物病害生物防治。*通讯作者：刘波（1957），男，研究员，博士。研究方向：农业微生物技术。（福建省农科院农业生物资源研究所，福建 福州 350003）摘要：对采自福建宁德地区的大白毫和福云六号茶叶进行内生菌的分离和脂肪酸鉴定。从7份样品中共分离到16株细菌、1株真菌。老叶中均未检测到内生菌，芽叶中内生菌数量为26.5×106 -139.5×106 cfu/g。有机种植的福云六号芽叶的含菌量是大白毫的1.94倍。常规种植的大白毫芽叶的含菌量为97.5×106 -139.5×106 cfu/g，明显高于有机种植的26.5×106 -28.3×106 cfu/g。大白毫带有红杆菌属、微杆菌属、根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌，福云六号仅含有根瘤菌属和贪噬菌属。有11株茶叶内生菌对供试10种病原菌表现出拮抗活性，其中放射根瘤菌Eb659菌株抑菌谱最广，具有开发作为生防菌防治植物病害的潜质。关键词：茶叶；内生菌；分离；脂肪酸鉴定；生物防治中图分类号：Q93-331; Q939.95 文献标识码：A 文章编号：Isolation, identification and the biocontrol potential of endophyte in theasienensis (Camellia sinensis)ZHU Yu-jing, CHEN Lu, LAN Jiang-lin, SU Ming-xing, LIU Bo(Agricultural Bioresource Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou, Fujian 350003，China)Abstract：The isolation, fatty-acid identification and inhibition ability against pathogeny of the endophyte in theasienensis (Camellia sinensis) were conducted. The theasienensis samples were collected from Linde area, Fujian Province; the varieties of the theasienensis were Dabaihao and Fuyunliuhao. 16 strains of endophytic bacteria and 1 endophytic fungus were isolated from 7 theasienensis samples. None of endophyte was detected in the old leaves of both theasienensis, whereas the endophytic bacteria in the buds were 26.5×106 -139.5×106 cfu/g. The endophytes in bud of Fuyunliuhao was 1.94 times more than those of Dabaihao, while both theasienensis were treated with organic planting. However, the endophytes in “Dabaihao” buds treated with normal planting were 97.5×106 -139.5×106 cfu/g, obviously higher than 26.5×106 -28.3×106 cfu/g of the buds treated with organic planting. Dabaihao contained endophytic bacteria belonging to Rhodobacter, Microbacterium, Rhizobium and Variovorax, whereas the Fuyunliuhao had only Rhizobium and Variovorax. 11 strains of the endophytic bacteria in theasienensis showed inhibition abilities to 10 pathogenies tested. Eb659 (R. radiobacter) had the biggest inhibition spectrum, which showed that it might have potential to be a biocontrol agent against plant disease.Keywords：theasienensis; endophyte; isolation; fatty-acid detection; biocontrol自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛关注1-2。由于内生菌在植物体内具有独立自主的分裂繁殖和传递的特性，使之有可能成为生物防治中有潜力的微生物农药和增产菌，因此，分离并利用内生菌控制作物的病虫害、开发有益内生菌以提高作物产量和品质，对于无公害农业具有重要意义3,4。我国已从棉花、水稻、马铃薯、番茄、辣椒等植物中分离到内生菌，已证明了内生菌对棉花黄萎病、马铃薯环腐病、番茄青枯病、辣椒炭疽病等植物病害具有防治效果，并且对植株具有增产效果5-10。目前，在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过120种(隶属于54个属)。这些内生细菌大多为土壤微生物种类，其中假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Eterobacter)以及土壤杆菌属(Agrobacterium)为最常见的属11-12。脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质，是生物体的基本结构成分之一，脂肪酸和细菌的遗传变异、毒力、耐药性等关系密切 13-14。细菌细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌DNA具有高度的同源性，各种细菌均具有特征性的细胞脂肪酸指纹图谱15。国内外已有把脂肪酸用于细菌鉴定的报道16-18。福建省是茶叶种植和生产大省，全省共有茶园面积14.5万公顷，居全国第3位，因此开发茶叶内生菌作为生防制剂有着良好的发展前景。本研究从茶叶上分离内生菌，利用脂肪酸进行鉴定，筛选具有广谱抑菌活性的内生细菌，应用于植物病害的生物防治。1 材料与方法1.1 供试植物与病原菌茶叶样本于2006年3月采自福建省福鼎市品品香茶业有限公司和福安市天香茶叶有限公司的有机茶生产基地和加工厂，茶树品种为大白毫和福云六号，种植方式分为有机种植和常规种植，叶分为老叶和芽叶，加工工艺分为杀青和未杀青。样本采回实验室后24 h内进行微生物的分离。供试病原菌及其来源见表1。表1 供试病原菌及其来源Table 1 The tested pathogenies and their source病原菌来源猪大肠杆菌K88（Escherichia coli）棉花黄萎病大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）黄曲霉（Aspergillus flavus）番茄枯萎病尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）番茄青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）甘蓝轮枝菌（Verticillium longisporum)西瓜枯萎病尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）泽泻白斑病菌（Ramularia alismatis）苦瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）中国兽药监察所德国菌种中心（DMSZ）福建农林大学福建师范大学浙江大学本实验室分离保存本实验室分离保存本实验室分离保存本实验室分离保存本实验室分离保存1.2 茶叶内生菌的分离细菌分离与增殖培养均采用NA培养基，真菌培养与拮抗测定均采用PDA培养基，放线菌分离采用高氏一号培养基。分别称取适量茶叶样品，冲洗干净后吸去水分，用75乙醇浸30-40 s，再转入10次氯酸钠溶液中浸5 min，无菌水漂洗数次，无菌滤纸吸干。用无菌剪刀剪碎样品于无菌研钵中，充分研磨匀浆，用无菌水以10-3、10-4、10-5梯度稀释，各取100 L稀释液涂布于不同培养基进行内生细菌、真菌和放线菌的分离，重复3次。根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征判断分离出的菌落种类并计数。按常规方法挑取单菌落纯化后保存，供测试鉴定。1.3 茶叶内生细菌的脂肪酸鉴定1.3.1 细菌脂肪酸的提取 细菌培养条件：TSBA平板培养基30 g胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，购于Fisher公司）+15 g琼脂+1 L水，四线划线法，培养温度（28±1） ，培养时间（24±2） h。获菌：用接种环挑取3-5环（湿重约40 mg）菌落置入干净、干燥有螺旋盖的试管中（最佳获菌区域为第3区）。皂化：加入（1.0±0.1） mL皂化试剂（45 g NaOH+ 150 mL甲醇+ 150 mL水），拧紧盖子，振荡5-10 s，放入95-100 沸水中5 min，室温冷却，振荡5-10 s，再水浴25 min，室温冷却。甲基化：开盖加入（2.0±0.1） mL甲基化试剂（325 mL 6 moL·L-1盐酸 + 275 mL甲醇），拧紧盖子，振荡5-10 s，（80±1） 水浴10 min，移开且快速用流动自来水冷却至室温。萃取：加入（1.25±0.1） mL萃取试剂（200 mL正已烷+200 mL甲基叔丁基乙醚），拧紧盖子，温和混合旋转10 min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层水相部分。基本洗涤：加入（3.0±0.2） mL洗涤试剂（10.8 g NaOH +900 mL水），拧紧盖子，温和混合旋转5 min，打开管盖，利用干净的移液管移出约2/3体积的上层有机相到干净的气相色谱检体小瓶，用于气相检测。上述试剂配制方法由MIDI公司提供。1.3.2 细菌脂肪酸的气相色谱检测 细菌脂酸酸成分检测采用美国Agilent 6890N型气相色谱系统，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；通过细菌细胞脂肪酸成分进行细菌鉴定的分析软件采用Sherlock MIS 4.5（Microbial Identification System）和 LGS 4.5（Library Generation Software）（均为美国MIDI公司产品）。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，170 起始，每分钟升温5 升至260 ，而后再每分钟升温40 升至310 ，维持90 s；汽化室温度250 、检测器温度300 ；载气为氢气（2 mL·min-1）、尾吹气为氮气（30 mL·min-1）；柱前压68.95 kPa；进样量l L，进样分流比100:l。1.3.3 细菌脂肪酸鉴定 系统根据各组分保留时间计算等链长(ECL)值确定目标组分的存在,采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度(Similarity Index，SI)，从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果，但当其报告的几个菌种的SI比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。以脂肪酸混合标样校正保留时间。1.4 茶叶内生细菌抑菌谱的测定将各供试内生菌株在NA平板上活化后，用NA培养液于30 、170 r·min-1振荡培养48 h备用。拮抗测定试验采用改良的琼脂扩散法：病原真菌在PDA平板上培养2-5 d，用无菌水冲洗菌苔配成孢子悬浮液，吸取1 mL制备好的孢子悬浮液，加入到熔化并冷却到45 左右的6 mL PDA培养基（琼脂含量为0.9%）中，混匀后倾覆在已凝固的PDA平板上，待上层培养基冷却凝固后，在平板上打孔（直径为6 mm），在每个孔内加内生菌发酵液40 L，将平板置于25 培养2-4 d后观察抑菌情况及抑菌圈大小。病原细菌在NA培养液中发酵培养至对数生长期；吸取制备好的发酵液1 mL，加入到熔化并冷却到45 左右的6 mL NA培养基（琼脂含量为0.9%）中，混匀后倾覆在已凝固的NA平板上，待上层培养基冷却凝固后，在平板上打孔（直径为6 mm），在每个孔内加内生菌发酵液40 L，将平板置于25 培养1-2 d后观察抑菌情况及抑菌圈大小。上述每处理均设3个重复，以无菌水为对照。2 结果与分析2.1 茶叶内生菌的分离供试茶叶样本内生菌分离培养的试验结果见表2、3。从7份样品中共分离到16株细菌，1株真菌，未分离到放线菌。不同生长状态、品种、种植方式和加工方式的茶叶样本的内生菌种类和含量均存在一定的差异。新鲜采摘的福云六号和大白毫老叶中均未检测到内生菌，而芽叶中均存在着大量的内生菌，分离到的内生菌数量为26.5×106-139.5×106 cfu/g。同样是有机种植，福云六号芽叶的含菌量为51.5×106 cfu/g，是大白毫的1.94倍。常规种植的大白毫芽叶含菌量为97.5×106-139.5×106 cfu/g，明显高于有机种植（26.5×106-28.3×106 cfu/g）。杀青工艺对有机种植的大白毫芽叶内生菌含量没有明显影响，却使常规种植的大白毫芽叶内生菌含量降低30.1%。样品I号分离到4株不同菌落形态的细菌，样品II、III、IV号和VI号各分离到3株不同菌落形态的细菌。同时，III号样品还分离到真菌1株。上述菌株分别编号为Eb646-Eb662。内生细菌在茶叶中的含量差异显著，含量最小的Eb656仅为2.0×106 cfu/g，含量最高的是Eb651，高达115.0×106 cfu/g。表2 7种茶叶样本内生菌的分离结果Table 2 Endophytes isolated from 7 different theasienensis samples样品品种采集地点类型内生细菌内生真菌内生菌总量种类含菌量(×106 cfu/g)种类含菌量(×106 cfu/g)种类含菌量(×106 cfu/g)大白毫福鼎常规种植，杀青期长，芽叶497.500.0497.5大白毫福鼎常规种植，杀青期短，芽叶3139.500.03139.5大白毫福鼎有机种植，杀青期长，芽叶326.012.3428.3大白毫福鼎有机种植，新鲜采摘，芽叶326.500.0326.5大白毫福鼎有机种植，新鲜采摘，老叶00.000.000.0福云六号福安有机种植，新鲜采摘，芽叶351.500.0351.5福云六号福安有机种植，新鲜采摘，老叶00.000.000.0表3 各茶叶样本分离到的内生菌及其含量Table 3 Content of each endophyte isolated from the theasienensis samples样品编号菌株编号内生菌类型含菌量/（×106 cfu/g）Eb646真菌2.3Eb647细菌22.0Eb648细菌52.5Eb649细菌9.0Eb650细菌14.0Eb651细菌115.0Eb652细菌14.5Eb653细菌10.0Eb654细菌21.0Eb655细菌3.0Eb656细菌2.0Eb660细菌7.5Eb661细菌13.0Eb662细菌6.0Eb657细菌32.0Eb658细菌9.0Eb659细菌10.52.2 茶叶内生细菌的脂肪酸鉴定将分离出的16株细菌的脂肪酸气相色谱检测与MIDI数据库比对结果列于表4。从表4可见，在TSBA50数据库中，菌株Eb648、Eb650、Eb651、Eb652、Eb653、Eb654、Eb658、Eb660的SI在0.500以上，表明为典型菌种；其中Eb648为类球红杆菌（Rhodobacter sphaeroides），Eb650为放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter），Eb651为砖红色微杆菌（Microbacterium testaceum），Eb652、Eb658为争论贪噬菌（Variovorax paradoxus），Eb653为Rhizobium rubi，Eb654为树状微杆菌（Microbacterium arborescens），Eb660为蛾微杆菌（Microbacterium imperiale）。菌株Eb649、Eb656、Eb657、Eb659、Eb661、Eb662在TSBA50、TSBA40、CLIN50数据库里的SI均介于0.300-0.500之间，匹配性较低，为非典型菌种。结合平板菌落形态，除去Eb657以外的其他5株菌的鉴定结果均确认为正确。而Eb647、Eb655这2株菌在所有数据库中找到的SI都很低，数据库没有这些菌种的数据，有可能为新种。Eb657、Eb647和Eb655菌株有待于进一步鉴定。表4 茶叶内生细菌的脂肪酸气相色谱检测与MIDI数据库比对的结果Table 4 Comparison results between the fatty-acid GC detections of theasienensis endophytic bacteria and MIDI library菌株数据库SI1)菌种Eb647MOORE50.199Prevotella loescheiiEb648TSBA500.729Rhodobacter sphaeroides (Rhodopseudomonas sphaeroides)Eb649TSBA500.328Variovorax paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb650TSBA500.799Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb651TSBA500.774Microbacterium-testaceum (Aureobacterium, Curtobacterium)Eb652TSBA500.607Variovorax paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb653TSBA500.527Rhizobium rubi (Agrobacterium)Eb654TSBA500.618Microbacterium arborescens (Flavobacterium)Eb655CLIN500.253Pseudomonas fluorescens-biotype A & FEb656CLIN500.454Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb657TSBA400.486Cellulomonas flavigenaEb658TSBA500.740Variovorax paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb659TSBA500.421Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb660TSBA500.609Microbacterium imperialeEb661TSBA500.338Variovorax paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb662TSBA500.374Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)1) SI 0.500，说明匹配性很高，为典型的菌种；0.300SI0.500，说明匹配性较低，为非典型菌种； 0.300，说明数据库没有此菌种的数据，给出的是最接近的相关菌种。将上述已确认的13株菌株根据样本来源进行分类，结果见表5。大白毫带有红杆菌属（Rhodobacter）、微杆菌属（Microbacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）和贪噬菌属（Variovorax）共4个属的内生细菌。福云六号仅含有根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌。两种茶树品种都含有的内生细菌为放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）和争论贪噬菌（Variovorax paradoxus）。表5 茶叶样本中所含的内生细菌菌株种类Table 5 Varieties of endophytic bateria in different theasienensis samples样本编号茶树品种类球红杆菌(Rhodobactersphaeroides)微杆菌属(Microbacterium)根瘤菌属(Rhizobium)争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)砖红色微杆菌(M. testaceum)树状微杆菌(M. arborescens)蛾微杆菌(M. imperiale)放射根瘤菌(R. radiobacter)R. rubi大白毫Eb648Eb650Eb649大白毫Eb651Eb653Eb652大白毫Eb654Eb656大白毫Eb660Eb662Eb661福云六号Eb659Eb6582.3 茶叶内生细菌抑菌谱的测定茶叶内生细菌抑菌谱测定结果见表6。Eb648在保存中缺失，因此仅15株茶叶内生细菌用于抑菌谱的测定。供试内生细菌对猪大肠杆菌K88、黄曲霉、甘蓝轮枝菌、泽泻白斑病菌和苦瓜炭疽菌均未表现出抑制活性。11株分别对番茄青枯雷尔氏菌、西瓜细菌性果斑病菌、棉花黄萎病大丽轮枝菌、西瓜枯萎病尖孢镰刀菌和番茄枯萎病尖孢镰刀菌具有拮抗作用。在15株供试内生细菌中，Eb659号菌株抑菌谱最广，能够抑制3种病原菌，即番茄青枯雷尔氏菌、西瓜细菌性果斑病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌；Eb656、Eb657、Eb658、Eb660、Eb661、Eb662各抑制2种病原菌；Eb652、Eb653、Eb654、Eb655号各抑制1种病原菌；而Eb647、Eb649、Eb650、Eb651未对供试的10种病原菌表现出拮抗活性。表6 15株茶叶内生细菌抑菌谱测定结果Table 6 Inhibition spectra of the 15 endophytic bacteria against 10 pathogenies内生菌抑菌圈直径（mm）1）猪大肠杆菌K88番茄青枯雷尔氏菌黄曲霉西瓜细菌性果斑病菌甘蓝轮枝菌西瓜枯萎病尖孢镰刀菌泽泻白斑病菌棉花黄萎病大丽轮枝菌番茄枯萎病尖孢镰刀菌苦瓜炭疽病菌Eb647-Eb649-Eb650-Eb651-Eb652-18.50-Eb653-15.50-Eb654-13.50-Eb655-13.00-Eb656-43.00-22.50-Eb657-37.00-28.00-Eb658-33.00-12.75-Eb659-38.00-53.00-25.00-Eb660-13.75-35.00-Eb661-12.75-20.00-Eb662-13.75-21.50-1） “-”代表没有拮抗活性。3 讨论植物体内存在大量有益的内生细菌和内生真菌，这些内生菌在植物体内有着多种生物学功能，可以提供植物所需要的营养物质及一些激素，参与植物的防卫功能，能够促进植物快速生长，增强植物抗逆境、抗病害、抗动物危害的能力3,19。已有报道表明，福建茶树优良品种铁观音、黄旦、毛蟹、肉桂的茶叶存在内生细菌和内生真菌，其中分离到的内生细菌数量为2.9×l06-39.4×l06 cfu/g。本研究在福建茶树品种福云六号和大白毫的芽叶也分离到26.0×l06-139.5×106 cfu/g内生细菌，经脂肪酸鉴定从属于红杆菌属、微杆菌属、根瘤菌属和贪噬菌属。植物内生菌生活在活体植物组织中，其生长代谢受多方面因素制约，包括宿主植物和外界环境因子等20。在茶叶内生菌的研究中，谢丽华等21发现茶树品种黄旦的内生真菌分离频率达100，而福云六号只有7.5；同时随着茶树叶片的成熟，叶片中内生真菌的种类与数量逐渐增多，但是在成熟的茶树叶片组织中，内生细菌的分离频率很低，表明茶树品种（或遗传背景）与叶片龄期影响内生菌的种群结构。本研究在大白毫中分离到1株内生真菌，在福云六号中未分离到内生真菌；在福云六号和大白毫的老叶中均未分离到内生细菌，而两种茶树品种的芽叶中均分离到3-4种内生细菌；大白毫带有红杆菌属、微杆菌属、根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌，福云六号仅含有根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌。上述结论证实了茶叶内生菌的种类与分布因茶树品种和叶片龄期而存在差异。此外，本研究还发现种植方式和杀青工艺也会影响茶叶内生菌的存在，如常规种植的大白毫芽叶明显高于有机种植的，并且杀青工艺使常规种植芽叶的内生菌含量大幅度下降。关于植物内生菌在防治病害、促进植物生长发育、固氮方面以及农残降解上的作用，国内外都有研究5。洪永聪等22从茶叶上分离筛选对茶树叶斑病防病效果好、对拟除虫菊酯类农药降解效能高的内生细菌，所有的分离菌株中有l4株对4种茶树叶斑病菌都有不同程度的拮抗效果，且在氯氰菊酯平板上生长良好，但仅鉴定了其中效果最好的TL2菌株，为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。本研究从福云六号和大白毫芽叶中分离的内生菌中，有11株内生细菌对供试10种病原菌表现出拮抗活性。其中，放射根瘤菌Eb659有着最广的抑菌谱，能够抑制1种植物病原细菌（番茄青枯雷尔氏菌）和2种植物病原真菌（西瓜细菌性果斑病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌），尤其是对西瓜果斑菌具有极好的抑菌效果，抑菌圈53.00 mm，表明将其作为生防菌防治植物病害具有一定的应用和开发价值。放射根瘤菌Eb659在植株体内的定殖效果、对茶树病原菌的抑制效果以及田间防效有待于进一步研究。参考文献1 何劲，刘蕴哲，康冀川植物内生菌及其在农业和医学上的用途J贵州农业科学，2006，34(3)：113-1152 姜怡，杨颖，陈华红，等植物内生菌资源J微生物学通报，2005，32(6)：146-1473 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