实验一土壤中微生物的分离纯化课件.ppt

实验一,土壤中微生物的分离及,纯化（设计性实验）,2020/4/9,1,一、目的要求,?,掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的,基本操作技术。,?,学习平板菌落计数的基本原理和方法,。,2020/4/9,2,二、基本原理,?,在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的,微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获,得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分,离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获,得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。,2020/4/9,3,?,为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微,生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供,给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只,利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而,淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平,板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离,、纯化该微生物，直至得到纯菌株。,?,土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生,物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土,壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以,从其中分离、纯化到许多有用的菌株。,2020/4/9,4,2020/4/9,5,?,平板菌落计数法,是将待测样品经适当稀释之后，,其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的,稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细,胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌,落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中,的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分,散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来,自样品中的,2,3,或更多个细胞。因此平板菌落计,数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计,数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位,(colony-forming,units,，,cfu),而不以绝对菌,落数来表示样品的活菌含量。,2020/4/9,6,2020/4/9,7,三、器材,?,高氏,1,号琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培,养基，马丁氏琼脂培养基，盛,9ml,无菌水的,试管，盛,90ml,无菌水并带有玻璃珠的三角,烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，,10,酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。,?,大肠杆菌菌悬液、,牛肉膏蛋白胨培养基。,lm1,无菌吸管，无菌平皿，盛有,4.5ml,无,菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。,2020/4/9,8,四、操作步骤,?,1,稀释涂布平板法,（,1,）倒平板,将肉膏蛋白胨培养基、高氏,1,号,琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至,55,60,时，向高氏,1,号琼脂培养基中加入,10,酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，,使每毫升培养基中含链霉素,30g/mL,。然后分,别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持,盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手,拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指,、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的,培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指,中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培,养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约,15ml,，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀,分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。,2020/4/9,9,2020/4/9,10,也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的,食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培,养基，摇匀后制成平板，如图,-1,所示。最好,是将平板放室温,2,3,天，或,37,培养,24,小,时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。,2020/4/9,11,（,2,）制备,土壤稀释液称取土样,10g,，放入盛,90ml,无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，,振摇约,20,分钟，使土样与水充分混合，将菌,分散。用一支,1ml,无菌吸管从中吸取,1ml,土,壤悬液注入盛有,9ml,无菌水的试管中，吹吸,三次，使充分混匀。然后再用一支,1ml,无菌,吸管从此试管中吸取,1ml,注入另一盛有,9ml,无菌水的试管中，以此类推制成,10-1,、,10-2,、,10-3,、,10-4,、,10-5,、,10-6,各种,稀释度的土壤溶液。,2020/4/9,12,（,3,）涂布,将上述每种培养基的三个平板底面分,别用记号笔写上,10-4,、,10-5,和,10-6,三种,稀释度，然后用三支,1ml,无菌吸管分别由,10-4,、,10-5,和,10-6,三管土壤稀释液中各,吸取,0.2ml,对号放入已写好稀释度的平板中,，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布,均匀，如图,-2,所示。,2020/4/9,13,（,4,）培养,将高氏,1,号培养基平板和马丁氏培养,基平板倒置于,28,温室中培养,3,5,日，肉膏,蛋白胨平板倒置于,37,温室中培养,2,3,日。,（,5,）挑菌落,将培养后长出的单个菌落分别挑取,接种到上述三种培养基的斜面上，分别置,28,和,37,温室中培养，待菌苔长出后，检,查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查,是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就,要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。,2020/4/9,14,?,2,平板划线分离法,（,1,）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号,笔标明培养基名称。,（,2,）划线,在近火焰处，左手拿皿底，右,手拿接种环，挑取上述,10-1,的土壤悬液一,环在平板上划线（图,-5,）。划线的方法很,多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过,划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个,菌落。,2020/4/9,15,2020/4/9,16,常用的划线方法有下列二种：,?,1,）用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在,平板培养基的一边作第一次平行划线,3,4,条，再,转动培养皿约,70,角，并将接种环上剩余物烧掉,，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线,，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行,划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线,划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。,?,2,）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续,划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。,2020/4/9,17,（,3,）挑菌,同稀释涂布平板法，一直到菌分纯,为止,?,3,、平板菌落计数法,l,）编号,取无菌平皿,9,套，分别用记号笔标明,10-4,、,10-5,、,10-6,。,(,稀释度,),各,3,套。另取,6,支盛有,4.5mL,无菌水的试管，依次标是,10-1,、,10-2,、,10-3,、,10-4,、,10-5,、,10-6,。,2020/4/9,18,2,）稀释,用,lmL,无菌吸管吸取,lmL,已充分混匀的大肠杆菌菌,县液,(,待测样品,),，精确地放,0.5ml,至,10-1,的试管,中，此即为,10,倍稀释。将多余的菌液放回原菌液,中。,将,10-1,试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混,匀。另取一支,lml,吸管插入,10,1,试管中来回吹吸菌,悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时,不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面,，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外,溢。用此吸管吸取,10-1,菌液,lmL,，精确地放,0.5mL,至,10-2,试管中，此即为,100,倍稀释。,其余依次类推，整个过程如图,VIII-3,所示。,放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能,接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果,误差较大。,2020/4/9,19,