天然药物化学-Nature-Medicinal-chemistry总结课件.ppt

天然药物化学 Nature Medicinal chemistry,武汉理工大学化工学院制药工程系Department of Pharmaceutical EngineeringWuhan University of Technology,第一章 总论 第一节 绪论 1、天然药物化学的学科性质：天然药物化学是一门运用现代化学及其它科学的理论和方法，来研究天然药物化学成分和有效成分的学科。2、天然药物化学学习和研究内容：天然药物化学主要研究天然药物中的化学成分和有效成分的化学结构、物理化学性质、提取、分离、检识和结构鉴定方法。其次是生物合成途径和必要的化学结构的修饰或改造，以及构效关系等。,3、研究对象：本学科主要学习和研究天然药物、特别是植物来源天然药物的化学成分。4、关于天然药物化学成分的复杂性：天然药物中的化学成分是十分复杂的。某一种天然药物可能含有几种类型的成分，而每一个类型又可能含有少则几种、多则十几种、几十种化学成分。一种天然药物如此，复方天然药物就更复杂了。,由于生源途径的关系，一种天然药物中往往存在母核相同、取代基不同的同一类型成分，也有不同类型的成分，例如，天然药物人参中就含有20余种三萜皂苷类成分，其都有相同或类似的母体，同时人参中又有黄酮类、多糖及挥发油等类成分。天然药物中成分的复杂性及多种天然药物的配伍应用，即构成了天然药物功效的多样性,是天然药物常具有多方面功效或多种药理作用的物质基础。,举例：大黄中的5种蒽醌苷元成分：苷元名称 R1 R2 大黄酸-COOH H 大黄素-CH3-OH 芦荟大黄素-CH2OH H 大黄素甲醚-CH3-OCH3 大黄酚-CH3 H,5、相关概念（1）单体：即化合物。指具有一定分子量、分子式、理化常数和确定的化学结构式的化学物质。（2）有效成分：具有生物活性、能起防病治病作用的化学成分。（3）无效成分：没有生物活性和防病治病作用的化学成分。（4）有效部位：在天然药物化学中，常将含有一种主要有效成分或一组结构相近的有效成分的提取分离部分，称为有效部位。如人参总皂苷、苦参总生物碱、银杏叶总黄酮等。,（5）有效部位群：含有两类或两类以上有效部位的天然药物提取或分离部分。（6）一次代谢产物：也叫营养成分。指存在于生物体中的主要起营养作用的成分类型；如糖类、蛋白质、脂肪等。（7）二次代谢产物：也叫次生成分。指由一次代谢产物代谢所生成的物质，次生代谢是植物特有的代谢方式，次生成分是植物来源天然药物的主要有效成分。,有效成分和无效成分的关系：二者的划分也是相对的。一方面，随着科学的发展和人们对客观世界认识的提高，一些过去被认为是无效成分的化合物，如某些多糖、多肽、蛋白质和油脂类成分等，现已发现它们具有新的生物活性或药效。,另外，一些天然药物中的化学成分本身不具有生物活性、也不能起防病治病的作用，但是，它们受采收、加工、炮制或制剂过程中一些条件的影响而产生的次生产物，或它们口服后经人体胃肠道内的消化液或细菌等的作用后产生的代谢产物，以及它们以原型的形式被吸收进入血液或被直接注射进入血液后在血液中产生的代谢产物却具有防病治病的作用，这些化学成分无疑也应被视为有效成分。另一方面，某些过去被认为是有效成分的化合物，经研究证明是无效的。如麝香的抗炎有效成分，近年来的实验证实是其所含的多肽而不是过去认为的麝香酮等。,第二节 天然药物化学在中医药现代化和天然药物产业化中的意义和作用 1 阐明天然药物的药效物质基础，探索天然药物防治疾病的原理 通过对天然药物进行有效成分的研究，不仅可以阐明天然药物产生功效的究竟为何物物质，也为探索天然药物防治疾病的原理提供了前提和物质基础。如，现代研究证明，麻黄中的挥发油成分-松油醇是其发汗散寒的有效成分；其平喘的有效成分是麻黄碱和去甲麻黄碱；而利水的有效成分则是伪麻黄碱。,2 促进天然药物药效理论研究的深入 如对于天然药物的化学成分与天然药物药性之间的关系的探讨。研究发现，温热药附子、吴茱萸、细辛、丁香等都含有消旋去甲乌药碱，此成分为-受体激动剂，具有加强心肌收缩力，加快心率，促进脂肪、糖代谢等一系列作用，这些作用与热性药的药性基本一致，故推测去甲乌药碱可能是“热性”天然药物的物质基础。,3 阐明天然药物复方配伍的原理 天然药物配伍中可能存在着一种天然药物有效成分与它种天然药物有效成分在药理作用方面的相互作用，也可能存在着一种天然药物有效成分与它种天然药物有效成分之间产生物理的或化学的相互作用。一般来说，后者常发生在天然药物方剂的煎煮或其它剂型制备过程中，从而使方剂中的有效成分无论在质的方面，还是在量的方面都与单味药有所改变。,生脉散为中医古典精方，古代医家用于抢救热伤元气，脉微欲绝等危重病人。经研究，其三味药单用均不如复方。以红参-麦冬-五味子（1：3：1.5）水煎，发现生成一种新物质，经结构测定为5-羟甲基糠醛（5-HMF），该物质三味药中只有五味子少量含有，药效试验表明5-HMF具有抗心肌缺血作用,可代表生脉散的疗效。,4 阐明天然药物炮制的原理 研究重要天然药物炮制前后化学成分或有效成分的变化，将有助于阐明天然药物炮制的原理、改进传统的炮制方法、制定控制炮制品的质量标准、丰富天然药物炮制的内容。如对于黄芩炮制的研究。黄芩有浸、烫、煮、蒸等炮制方法。过去南方认为“黄芩有小毒，必须用冷水浸泡至色变绿去毒后，再切成饮片，叫淡黄芩”。而北方则认为“黄芩遇冷水变绿影响质量，必须用热水煮后切成饮片，以色黄为佳”。经天然药物化学的研究表明，黄芩在冷水浸泡过程中，其有效成分黄芩苷可被药材中的酶水解成黄芩素，后者不稳定易氧化成醌类化合物而显绿色。,黄芩苷 黄芩素（黄色）醌类（绿色）可见用冷水浸泡的方法炮制，使有效成分损失导致抑菌活性降低，而用烫、煮、蒸等方法炮制时，由于高温破坏了酶的活性，使黄芩苷免遭水解，故抑菌活性较强，且药材软化易切片。因此，认为黄芩应以北方的蒸或用沸水略煮的方法进行炮制。,5 改进药物制剂剂型，提高药物质量和临床疗效 为了研制开发出高效、优质、安全、稳定的“三效”（高效、速效、长效）、“三小”（剂量小、毒性小、副作用小）、“三便”（贮存、携带、服用方便）的新型天然药物，天然药物化学在天然药物制剂的研制中，起着十分重要的作用。,6 建立和完善中药材和中成药的质量标准 为了更好地控制天然药物的质量，在严格按照天然药物材栽培质量管理规范（GAP）的要求进行天然药物材栽培、生产，以及严格按照药品生产质量管理规范（GMP）的要求进行天然药物制剂生产的同时，现在越来越多地应用天然药物化学的检识反应、鉴别方法、各种色谱法以及各种波谱法对天然药物材及其制剂进行定性鉴别和含量测定，并尽可能对其生产的全过程进行监控。在天然药物材和中成药的质量控制中，如果能确定其有效成分，则应以其有效成分为指标，建立定性鉴别和含量测定的方法，以此来控制质量。如果其有效成分还不清楚时，可以采用该主要化学成分或标志性化学成分为指标进行。,7 研制开发新药、扩大药源 1）天然药物化学在天然药物新药研制中的作用 2）天然药物化学在扩大药源、寻找天然药物代用品中的作用,第三节 中药化学成分及生物合成简介及天然药物有效成分的提取方法一、天然药物化学成分及生物合成简介（一）天然药物化学成分类型简介 本小节主要介绍各类成分的基本概念，了解天然药物中一般都有那些类型的化学成分。重点掌握各类成分的一般溶解性，为理解提取、分离一般方法打基础。各类成分的详细内容在各论中具体学习。,各类成分的性质在概念中只介绍极性，溶解性在后面以列表形式介绍。1 生物碱：为一类存在于生物体内分子中含有氮原子的有机化合物的总称；一般具有碱性，可与酸成盐。游离生物碱具亲脂性；生物碱盐具亲水性。2 苷类：为一类经水解后可产生糖和非糖两部分的化合物。非糖部分叫苷元。苷具亲水性，苷元具亲脂性。3 挥发油：为一类可随水蒸气蒸馏出来的与水不相混溶的油状液体的总称。具有香味或特殊气味的天然药物往往都含有挥发油。挥发油具亲脂性。以上三类为主要的有效成分类型。,4 糖类：为天然药物中普遍存在的成分类型，包括单糖、低聚糖、多糖。单糖是糖的基本单位；低聚糖是由29个单糖脱水缩合而成的化合物。多糖是由10个以上至上千个单糖脱水缩合而成的高聚物。5 有机酸：广义的有机酸泛指分子中有羧基的化合物。在植物中多以金属离子或生物碱盐的形式存在。按分子大小又分为小分子有机酸和大分子有机酸。前者极性大，具亲水性；后者极性小，具亲脂性。,6 树脂：为植物组织中树脂道的分泌物。性脆，受热时先软化而后变为液体，燃烧时发生浓烟并有明火。树脂具亲脂性。按结构又分为树脂酸（主要为二萜酸、三萜酸及其衍生物）、树脂醇（分子中具羟基）、树脂烃（为一类结构复杂的含氧中性化合物）类。7 氨基酸、蛋白质和酶：（1）氨基酸：分子中含有氨基的羧酸。构成蛋白质的多为-氨基酸。为亲水性。在等电点时，溶解度最小。,（2）蛋白质、多肽：蛋白质为二十多种-氨基酸通过肽键首尾相连而成的高分子化合物，多肽亦为。但二者分子量不同，一般将分子量在5103以下称为多肽，而介于51031107之间称为蛋白质。蛋白质在冷水中溶解且成胶体，在热水、60%以上乙醇及其它有机溶剂中变性沉淀。（3）酶：是有机体内具有催化作用的蛋白质，其催化作用具有专属性，如特定的酶可催化水解特定的苷。酶的性质和蛋白质相同。,8 鞣质：又称单宁或鞣酸，为一类分子较大、结构复杂的多元酚类化合物的总称。可与蛋白质结合成难溶于水的鞣酸蛋白。为亲水性物质。9 植物色素：为植物中具有颜色的成分的总称。依溶解性又分为水溶性和脂溶性色素；前者主要指一些有颜色的苷、花青素，后者主要包括叶绿素、胡罗卜素等 10 油脂和蜡：油脂为一分子甘油和三分子脂肪酸脱水结合形成的酯。主要在种子中。常温下为液体。蜡为高级不饱和脂肪酸和一元醇生成的酯。主要在植物茎、叶的表面。常温下为固体。均为亲脂性成分,成分类型 水 醇类 亲脂性有机溶剂游离生物碱+生物碱盐+苷类+苷元+挥发油+糖类（单糖低聚糖）+（多糖）有机酸（大分子）+（小分子）+树脂+氨基酸+蛋白质、酶 鞣质+色素（亲水性）+（亲脂性）+油脂、蜡+：单糖：无水醇难溶；多糖；对醇60%以上难溶。蛋白质、酶；对水热水沉淀；对醇60%以上沉淀。,（二）天然药物化学成分的主要生物合成途径 1 乙酸-丙二酸（AA-MA）途径 以乙酰辅酶A为起始物质，丙二酸单酰辅酶A起延伸碳链的作用。通过这一途径能生成脂肪酸类、酚类、醌类等化合物。1）酚和醌类这类物质的生物合成过程中只发生缩合反应。乙酰辅酶A直线聚合后再进行环合生成各种酚类化合物。,CH3-CO-S-CoA+3 乙酰辅酶A 丙二酸单酰辅酶A CH3-CO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-Enz 上述多酮环合则生成各种醌类化合物或聚酮类化合物。2 甲戊二羟酸（MVA）途径 起始物质为MVA，在ATP作用下，按如下路线合成：,甲戊二羟酸（MVA）,焦磷酸二甲烯丙酯 焦磷酸异戊烯酯 甲戊二羟酸5焦磷酸 萜类、甾类化合物均由这一途径生成。,3 莽草酸途径 具有C6-C3及C6-C1基本结构的化合物由这一途径衍化生成。如由此途径生成的苯丙氨酸，经脱氨及氧化反应等分别生成桂皮酸，再由桂皮酸、苯甲酸生物合成各种含C6-C3及C6-C1结构的天然化合物如苯丙素类、木脂素类、香豆素类等。此途径由莽草酸通过苯丙氨酸，生成桂皮酸，再由桂皮酸生成各种苯丙素类化合物。现也被称为桂皮酸途径。,以香豆素生合成简图示意本途径如下：莽草酸 苯丙氨酸 桂皮酸 香豆素,4 氨基酸途径 大多数生物碱类成分由此途径生成。有些氨基酸，如鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等，经脱羧成为胺类,再经过一系列化学反应(甲基化、氧化、还原、重排等)生成各种生物碱。5 复合途径 许多二级代谢产物由上述生物合成的复合途径生成。即分子中各个部分由不同的生物合成途径产生。如查耳酮类、二氢黄酮类化合物的A环和B环分别由乙酸-丙二酸途径和莽草酸途径生成，再在各种酶作用下生成黄酮。一些萜类生物碱分别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸途径或乙酸-丙二酸途径。,二、天然药物有效成分的提取方法 介绍天然药物化学成分的提取方法，主要介绍溶剂提取法。重点：溶剂提取法的原理，化学成分的极性、常用溶剂、极性大小顺序及提取溶剂的选择；常见的提取方法及应用范围。常用三种方法：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法。另外新方法还有超临界提取法。提取的概念：指用选择的溶剂或适当的方法，将所要的成分溶解出来并同天然药物组织脱离的过程。（一）溶剂提取法 1 提取原理：根据天然药物化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“浓度差”原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。,2 化学成分的极性：被提取成分的极性是选择提取溶剂最重要的依据。1）影响化合物极性的因素：(1)化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2)取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。常见基团极性大小顺序如下：酸酚醇胺醛酮酯醚烯烷。举例：判断下列各组化合物极性大小。A B C,麻黄碱 蝙蝠葛碱 天然药物化学成分不但数量繁多，而且结构千差万别。所以极性问题很复杂。但依据以上两点，一般可以判定。需要大家判断的大多数是母核相同或相近的化合物，此时主要依据取代基极性大小。2)常见天然药物化学成分类型的极性：极性较大的：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、亲水性色素。极性小的：游离生物碱、苷元、挥发油、树脂、脂肪、大分子有机酸、亲脂性色素。以上不是绝对的，具体成分要具体分析。比如，有的苷类化合物极性很小，有的苷元极性很大。,3 提取溶剂及溶剂的选择：1）常用提取溶剂的分类与极性：（1）分类：通常分三类：水类；亲水性有机溶剂；亲脂性有机溶剂。（2）极性大小：水(H2O)甲醇(MeOH)乙醇(EtOH)丙酮（Me2CO）正丁醇(n-BuOH)乙酸乙酯(EtOAc)乙醚(Et2O)氯仿(CHCl3)苯（C6H6)四氯化碳(CCl4)正己烷石油醚(Pet.et)。水类还包括酸水、碱水；亲水性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮；亲脂性有机溶剂为正丁醇后所有的。这三类溶剂间互溶情况：水和亲水性有机溶剂可互溶，水和亲脂性有机溶剂间不互溶，有机溶剂间除甲醇和石油醚不互溶外，其它均互溶。（3）溶剂极性大小的实质：介电常数不同，介电常数大的溶剂极性大，介电常数小的溶剂极性小。如，己烷为1.9，氯仿为5.2，水为80。,2）提取溶剂的选择：（1）提取溶剂的选择原则：a 要对所提取成分溶解度大；对杂质溶解度小。b 要与所提取成分不起意外的化学变化。c 要廉价、易得、安全。其中a 是最主要的。（2）提取溶剂的选择：a 水：为极性最大的溶剂，也最常用。可溶解苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有机酸盐、亲水性色素、无机盐。其中蛋白质不溶于热水。缺点：用水提取易酶解苷类成分，且易霉坏变质。某些含果胶、粘液质类成分的中草药，其水提取液常常很难过滤。沸水提取时，中草药中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难。故含淀粉量多的中草药，不宜磨成细粉后加水煎煮。b 亲水性的有机溶剂：以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。优点：应用范围广，易过滤，不霉变，易浓缩回收。缺点：价高、不安全，需回流设备。,c 亲脂性的有机溶剂：这些溶剂的选择性能强，用于亲脂性成分的提取，如游离生物碱、苷元、挥发油等。优点：提取专属性强，易回收浓缩。缺点：价高、易燃、有毒，穿透性差；对设备要求高。4 提取方法：提取工艺流程图：提取和分离工艺多用此图表示。1）浸渍法：也叫冷浸法。将药材粗粉以适当溶剂在常温下浸泡。多以水类或稀醇为溶剂。适于成分遇热易破坏或含多糖较多的天然药物的提取。缺点为浸出效果较差，水提取液易发霉，提取液体积大，浸出时间长。2）渗滤法：将天然药物粗粉装于渗泸筒中，不断添加溶剂渗过药粉，从渗泸筒下端不断流出渗泸液。各类溶剂均可。此法由于溶液浓度差大，浸出效果好，且不破坏成分。但缺点为溶液体积大，时间长。3）煎煮法：为天然药物水提取最常用的方法。将天然药物粗粉用水加热煮沸，保持一定时间，成分即可浸出。煎煮法必须以水为溶剂。此法提取效率高，但遇热破坏成分要注意。且含多糖多的成分过滤困难。,4）回流法：用于以有机溶剂加热提取成分。优点为提取效率高，但受热易破坏成分不宜用此法。缺点为溶剂消耗量大，需回流设备，需几次提取方可提取完全。5）连续回流法：以索氏提取器（亦称脂肪抽出器）回流提取。克服了回流法溶剂需要量大、需几次提取的缺点。缺点为提取时间长，受热破坏成分不能用此法。5 影响提取效率的因素：1）药材粉碎度：药粉越细、表面积越大，提取效率越高。但太细，药粉对成分的吸附也越强。因此水提取宜用粗粉；用有机溶剂可细些,以20目为好。2）提取温度：一般热提效率高，但要考虑有些成分温度高易破坏，应选择适宜温度。3）提取时间：一般提取时间长提出量大。但被提成分在细胞内外溶解一旦平衡，时间长即无意义。一般热水提以1/21h为宜，乙醇提1h为宜。,（二）水蒸气蒸馏法：适于具有挥发性、可随水蒸气蒸馏不被破坏，与水不反应、且与水分层的成分的提取。天然药物中主要用于挥发油、某些挥发性生物碱、少数挥发性蒽醌苷元、香豆素苷元的提取。水蒸气蒸馏提取的装置有两种，一是水蒸气蒸馏装置，二是共水蒸馏装置。（三）升华法：天然药物中的某些固体成分在受热低于其熔点的温度下，不经液态直接成为气态，经冷却后又成为固态，从而与天然药物组织分离这种性质称为升华，这种提取方法称为升华法。天然药物成分有少量具有升华性，如游离羟基蒽醌类成分，一些小分子香豆素类，有机酸类成分等。,（四）超临界提取法。（SFE）1 特点：与经典溶剂提取法比较，不用有机溶剂，而是选用一种称为超临界流体（SF）的物质替代有机溶剂提取。2 优点：1）可在低温下提取，“热敏性”成分尤其适用。2）无溶剂残留，对作为制剂的天然药物提取物的提取是一大优势。3）提取与蒸馏合为一体，无需回收溶剂。4）具选择性分离。3 超临界流体（SF）：指处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上，介于气体和液体之间的、以流动形式存在的物质。超临界状态是指当一种物质处于临界温度和临界压力以上的状态下，形成既非液体又非气体的单一状态，称为“SF”。此时其流体密度近似液体、黏度近似气体，其扩散力比液体大增，介电常数也随压力增加而增加。其浸透性优于液体，因而比液体有更佳的溶解力，有利于溶质的萃取，特别是性质不稳定、易热分解的物质的提取。,4 常见的SF：有二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨、二氯二氟甲烷等。其中最常用的为二氧化碳。二氧化碳的特点：临界温度接近室温（Tc=31.3），临界压力也较低（Pc=7.37Mpa），无色、无毒、无味，不易燃，化学惰性，廉价，易制成高纯度气体。故在SFE中最常用。5 二氧化碳-超临界流体的溶解能力规律：在超临界状态下，CO2对不同溶质的溶解能力差别很大。其取决于溶质的极性、沸点、分子量。(1)对亲脂性、低沸点成分溶解能力强，如挥发油、烃类、醚类、酯类等。(2)成分极性基团（如OH、COOH）越多，越难提取。如糖类、氨基酸的萃取压力要4104Pa以上。(3)成分分子量越大，越难提取。,第三节 天然药物化学成分的分离方法 本节介绍天然药物化学成分的一般分离方法，有萃取、沉淀、结晶、盐析、膜分离、柱色谱等方法。重点掌握前三种和柱色谱法。一 两相溶剂萃取法 1 原理：利用混合物中各单体组分在两相溶剂中的分配系数（K）不同而达到分离的方法。溶剂分配法的两相往往是互相饱和的水相与有机相。混合物中各成分在两相中分配系数相差越大，则分离效果越高。2 方法：1）简单萃取法：仪器，实验室用分液漏斗或下口瓶。一般在水和亲脂性有机溶剂中进行，根据情况，也可用酸水或碱水。天然药物中成分比较复杂，一般一次萃取分离不出来纯品，需要再配合其他方法。由于成分的复杂性及相互作用，萃取中易发生乳化。破坏乳化的方法有：（1）加热敷；（2）将乳化层抽滤；（3）长时间放置（24小时以上）。,2）pH度萃取法：是分离酸性或碱性成分的常用方法。以pH成梯度的酸水 溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的碱性成梯度的混合生物碱，或者以 pH成梯度的碱水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的酸性成梯度的混合 酚、酸类成分，使后者分离的方法。3）连续萃取法：采用连续萃取器萃取。利用两溶液比重不同自然分层和 分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。此法可克服用分液漏斗多次萃取 操作的麻烦。4）液滴逆流分配法（DCCC法）：是利用流动相形成液滴，通过作为固定 相的液柱而达到分离纯化的目的。二 沉淀法 指于天然药物提取液中加入某些试剂或溶剂，使某些成分沉淀而使所要成分与杂质分离的方法。依据加入试剂或溶剂不同，分为下述四个方法。,1 水醇沉淀法：1）水提取醇沉淀法，于水提浓缩液中加入乙醇使含醇量达60%以上，可使多糖、蛋白质沉淀。2）醇提取水沉淀法，于醇提取浓缩液中加入10倍量以上水，可沉淀亲脂性成分。2 铅盐沉淀法：利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀而分离的方法。中性醋酸铅可沉淀具有邻二酚羟基和羧基的成分；碱式醋酸铅的沉淀范围较广，可沉淀含酚羟基和羧基及中性皂苷等。如沉淀为杂质，则可弃去；如沉淀为所要成分，则可将沉淀悬浮于水或稀醇中，通H2S气体或加入稀H2SO4、Na2SO4等脱铅，成分即可分离。3 酸碱沉淀法：1）酸提取碱沉淀：用于生物碱的提取分离。2）碱提取酸沉淀：用于酚、酸类成分和内酯类成分的提取、分离。4 专属试剂沉淀法 某些试剂能选择性地沉淀某类成分，称为专属试剂沉淀法。如雷氏铵盐能与水溶性生物碱类生成沉淀，可用于分离水溶性生物碱与其它生物碱；胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离；明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质等。,三 盐析法 于天然药物水提取液中加入某些无机盐至一定浓度或达到饱和状态，可使某些成分由于溶解度降低而沉淀析出。常用的无机盐有HCl、Na2SO4等。四 结晶法 1 关于结晶和重结晶概念：结晶是指由非结晶状态到形成结晶的操作过程。重结晶指由纯度低结晶处理成纯度高结晶的操作过程。二者从操作角度差别是起始物不同。2 结晶和重结晶操作：提取或分离物 溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤 溶液 放置（冷藏）析晶，过滤 粗结晶 重复上述操作（重结晶）结晶,3 影响结晶的因素：1）结晶用溶剂的选择是最重要因素之一。一般应符合下列条件：（1）要对被结晶成分热时溶解度大、冷时溶解度小；对杂质或冷热时都溶解，或冷 热时都不溶解。（2）与被结晶成分不发生化学反应。（3）沸点不宜太高。除用单一溶剂外，天然药物成分的结晶常用一定比例的混合溶剂，。2）纯度：3）被结晶成分的类型：分子小易结晶；分子大、含糖多，不易结晶。4）溶液浓度：溶液浓结晶快，但结晶细碎，杂质多；反之结晶慢，但晶形大、纯 度高。5）结晶温度和时间：温度低、时间长，结晶好。,五 膜分离法 利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液中的化学成分进行分离、分级、提纯和富集。反渗透、超滤、微滤、电渗析为四大已开发应用的膜分离技术。其中反渗透、超滤、微滤相当于过滤技术。溶剂、小分子能透过膜，而大分子被膜截留。不同膜过滤被截留的分子大小有区别。如运用超滤，选用适当规格的膜可实现对天然药物提取液中多糖类、多肽类、蛋白质类的截留分离。透析法也属于膜分离法。,六 柱色谱法 1 吸附柱色谱 是利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异，而实现分离的一类色谱。1）硅胶、氧化铝柱色谱：二者均为最常用的吸附剂。硅胶是一种中等极性的酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。氧化铝有弱碱性，主要用于碱性或中性亲脂性成分的分离，如生物碱、甾、萜类等成分；对于生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型的化合物分离。吸附柱色谱行为与化合物的极性有关：2）聚酰胺柱色谱：其与化合物间主要为氢键吸附。主要用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质类等成分的分离。聚酰胺对一般化合物的吸附的规律：化合物中能形成氢键的基团（酚羟基、羧基、羰基）多，吸附强。能形成氢键的基团数目相同，处于对位和间位的吸附力强于邻位的。芳香环和双键多，吸附力强。,3）大孔吸附树脂（1）结构与组成：大孔吸附树脂为白色或淡黄色球形颗粒状，粒度多为2060目。组成为苯乙烯，二乙烯苯，或-甲基丙烯酸酯型。其中苯乙烯，二乙烯苯型为非极性树脂，2-甲基丙烯酸酯型为中极性树脂。大孔吸附树脂的结构中包含了许多微观小球组成的网状孔穴结构。（2）特性：理化性质稳定，不容于酸、碱及有机溶剂。对有机物选择性较好。吸附速度快。再生处理方便。（3）吸附原理：吸附性：大孔吸附树脂本身具有吸附性，是由范德华力或氢键吸附的结果。筛性原理：是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。,（4）影响大孔吸附树脂分离效果的因素：化合物分子极性大小：一般来说，大孔树脂的色谱行为具有反相的性 质。被分离物质的极性大先流出色谱柱。分子体积大小：在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强。（5）洗脱剂：对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强，对中 极性大孔树脂及极性较大化合物，则极性较大溶剂洗脱力强。一般上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。4）活性炭：是一种非极性吸附剂，对非极性物质吸附强。活性炭主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。,2 分配柱色谱：利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数的不同而达到分离的方法。按照固定相与流动相的极性差别，分配色谱法有正相与反相色谱法之分。在正相分配色谱法中，流动相的极性小于固定相极性。常用的固定相有氰基与氨基键合相，主要用于分离极性及中等极性的分子型物质。在反相分配色谱法中，流动相的极性大于固定相极性。常用的固定相有十八烷基硅烷（ODS）或C8键合相。流动相常用甲醇-水或乙腈-水。主要用于分离非极性及中等极性的各类分子型化合物。天然药物中的各种苷类特别适合用反相色谱法分离。反相色谱是应用最广的色谱法，因为键合相表面的官能团不会流失，流动相的极性可以在很大的范围调整，再加之由它派生的反相离子对色谱法和离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。高效液相色谱（HPLC）最常用的即是反相填料。,3 凝胶过滤色谱 凝胶过滤色谱原理主要是分子筛（或反筛子）作用、根据凝胶的孔径和被分离化合物分子的大小而达到分离目的。凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质，被分离物质的分子大小不同，它们能够进入到凝胶内部的能力不同，当混合物溶液通过凝胶柱时，比凝胶孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比凝胶孔隙大的分子不能进入凝胶内部，只能通过凝胶颗粒间隙。因此移动速率有差异，分子大的物质不被迟滞(排阻)，保留时间则较短，分子小的物质由于向孔隙沟扩散，移动被滞留，保留时间则较长，而达到分离。天然药物中多糖类、蛋白质、苷和苷元 的分离可用凝胶色谱。商品凝胶的种类很多，常用的是 样品 葡聚糖凝胶(Sephadex G)和 凝胶 羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20),4 离子交换色谱 离子交换反应的原理是树脂与被交换成分间同种电荷离子的等当量替代作用。以离子交换树脂为固定相，水或酸水、碱水为流动相，在流动相中的离子性物质与树脂进行交换而被吸附，再用适合溶剂将被交换成分从树脂上洗脱下来即可。天然药物中的碱性成分可用阳离子交换树脂交换,酚酸性成分可用阴离子交换树脂交换,然后将交换后的树脂通过调整酸碱环境使吸附物游离,选择适当溶剂将吸附物溶解出即可。由于被交换的混合物成分的酸性或碱性不同而解离度不同，与同一离子交换树脂的交换能力不同而被分离。,色谱法分离 定义 色谱法是从混合物中分离组分的方法。色谱技术甚至能够分离物化性能差别很小的化合物，色谱法或称色谱法（chromatography），是一种物理或物理化学的分离分析方法。特别是近几十年来，由于气相色谱法、高效液相色谱法及薄层扫描法的飞速发展，而形成了一门专门的科学，称为色谱学。它已广泛应用于多个组分的分离分析。分类 色谱法，从不同的角度，有不同的分类方法，通常可按分子聚集状态、操作方法及分离原理等进行分类。1 按流动相与固定相的分子聚集状态分类,(1)按流动相的分子聚集状态分类 气相色谱法（gas chromatography；GC 液相色谱法（liquid chromatography；LC）超临界流体色谱法（supercritical fluid chromatography SFC）(2)按固定相的聚集状态分类 气相色谱法可分为 气固色谱法（GSC）气液色谱法（GLC）液相色谱法可分为 液固色谱法（LSC）液液色谱法（LLC）,2 按操作形式（固定相的形态）分类 可分为柱色谱法，平面色谱法及逆流分配等类别。3 按色谱过程的分离机制分类 可将色谱法分为：吸附色谱法、分配色谱法；空间排阻色谱法、离子交换色谱法；亲合色谱法；化学键合相色谱法（chemical bonded phase chromatography；BPC）；毛细管电色谱法（capillary electrochromatography；CEC）；,常用的色谱方法1 硅胶色谱1.1 性质 色谱硅胶为一多孔性物质，可用通式SiO2H2O表 示。它具有多孔性的硅氧环（siloxane），SiOSi的交键结构，由于其骨架表面具有很多游离（I）、健合（II）和键合活性状态的硅醇基（silanol）基（III）。它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分。1.2 色谱柱的制备与加样1.3 色谱溶剂的选择1.4 硅胶的再生,硅胶含水量与活性的比较活 性 加入水量（%）I 0 II 5 III 15 IV 25 V 38,常用溶剂的介电常数（）己烷 1.88苯 2.29乙醚(无水)4.47氯仿 5.20乙酸乙酯 6.11丙酮 21.5乙醇 26.0甲醇 31.2水 81.0,2 氧化铝色谱2.1 氧化铝的活性及活性测定 氧化铝含水量与活性的比较 活 性 加入水量（%）0 3 6 10 15,板层法示意图 氧化铝活性与各种颜料薄层色谱Rf,氧化铝活性的测定活性（级）对氨基偶氮苯的比移值 0 0.12 0.24 0.46 0.54 硅胶活性的测定活性（级）对二甲氨基偶氮苯的比称值 0.15 0.55 0.65,2.2 色谱洗脱用的溶剂2.3 氧化铝的再生3 活性炭色谱4 离子交换色谱,样品 稀NH4OH洗脱 强酸性（H型）通过液 盐基性两性化合物 酸性、中性化合物 稀NaOH 强碱性（OH型）强碱性（OH型）洗脱 通过液 稀HCl洗脱 通过液 盐基性物质 中性化合物 两性化合物酸性化合物,4.1 影响离子交换的有关因素(1)溶液的酸碱度(2)对交换离子的选择性(3)被交换物质在溶液中的浓度(4)温度的影响(5)溶剂的影响 5 大孔吸附树脂色谱5.1 性质 5.2 吸附和分离原理 5.3 基本操作(1)大孔吸附树脂的预处理(2)上样(3)洗脱 洗脱剂的选择 洗脱(4)树脂柱的再生。,5.4 用于新药研究应考察的内容 树脂用于新药研究应考察一定内容：如树脂型号的选择、吸附容量的考察、药材树脂比例的考察、色谱柱的径高比考察、洗脱溶剂的考察、吸附流速和洗脱流速考察、收集洗脱液量考察、树脂的使用寿命考察以及工艺放大试验等。,5.5 影响大孔吸附树脂吸附分离中药化学成分的因素(1)被分离成分性质 极性 分子大小(2)上样溶剂性质 溶剂对成分的溶解性 溶剂pH值(3)上样溶液浓度(4)吸附流速(5)洗脱剂性质 洗脱剂种类 洗脱剂的pH值(6)洗脱流速,6 凝胶色谱6.1 原理凝胶色谱分离机理可用下式表示：Vk=VO+Vi Vk：保留体积。VO：柱床内存在于凝胶外面的水相体积称为外水体积。Vi：凝胶颗粒内部所含的水相体积称为内水体积。k：分配系数。,凝胶色谱示意图,设k=1，则VR=V0+Vi，这说明溶质分子相当小，能自由进入凝胶颗粒内部，而且对凝胶的“内水”和“外水”亲和力相等，此时洗脱体积VR就等于“空隙体积”与“内水体积”之和。若k=0，则VR=V0，说明溶质分子很大，以致完全排阻于凝胶颗粒之外，此时洗脱体积就等于“空隙体积”。在通常情况下，为一个常数（0k1），洗脱体积VR大于V0，小于（V0+Vi），大分子首先被洗脱。如果仅按照物质分子的大小进行分离，那么值应小于1。但实际情况是值往往大于1，则洗脱体积就大于V0+Vi，这表明凝胶不完全是惰性的，而溶质与凝胶之间具有特殊的吸附力，这种吸附力来自分子间的氢键或离子交换作用。,6.2 种类(1)亲水性凝胶(2)疏水性凝胶 7 聚酰胺色谱,4.3.8 高效薄层色谱4.3.9 快速色谱,10 干柱色谱11 液相色谱预制,液相色谱预制柱示意图 分离园盘示意图,离心液相色谱分离程序,螺旋型逆流色谱,4.3.13.1 液滴逆流色谱,液滴逆流色谱,13.2 旋转多段式逆流色谱,RLCC上行法 RLCC下行法,14 真空液相色谱（vacuum liquid chromatography,VLC）,真空液相色谱实验装置图,15 制备型全程加压板色谱,16 高效液相色谱,高效液相色谱示意图,生物合成,Biosynthesis,Acetyl CoA,Acetyl CoA,2NADPH,2NADP,2ATP,2ADP,ATP,ADP,DMP,IPP,MVA,焦磷酸香叶酯（GPP）,单萜,DPP,IPP,倍半萜,焦磷酸金合欢酯(FPP),NADPH,三萜类,焦磷酸香叶基香叶酯（GGPP）,二萜,聚合,NADPH,聚合,四萜类,第四节 结构研究法,化合物的纯度测定结构研究的主要程序结构研究中采用的主要方法,一、化和物的纯度测定 方法：检查有无均匀一致的晶形，有无明确、敏锐的熔点（熔距一般为12）及色谱法。其中色谱法包括：TLC、PC、GC、HPLC。,二、结构研究的主要程序1.初步推断化合物类型2.测定分子式，计算不饱和度。3.确定分子式中含有的官能团，或结构片段，或基本骨架。4.推断并确定分子的平面结构5.推断并确定分子的主体结构（构型、构象）,文献检索、调研工作贯穿结构研究工作的整个过程。利用中、外文主题索引按中药拉丁文学名进行检索，来获得已分出化合物的种类、个数、性质、用到的提取方法、提取溶剂、色谱的溶剂系统、生物活性等信息。,获得文献后，最好整理成一览表以方便检索比较。已知化合物，还需做混合熔点测定和混合的IR光谱；未知化合物，需按测定程序进行，如有不对称中心，还需测定绝对构型。,三、结构研究中采用的主要方法1.确定分子式，计算不饱和度 a.元素定量分析配合分子量测定 元素定性分析，如钠融法，分析化合物中含有几种元素。元素定量分析确定各元素百分含量，根据倍比定律确定分子中的原子比 分子量测定：冰点下降法、沸点上升法、粘度法、凝胶滤过法及质谱法。,刺果甘草中分离的一白色结晶元素定性分析：含有C,H,O元素定量分析:C 79.35%,H 10.21%,O 10.44%原子比为10.16：15.58：1，约化为10：16：1质谱得到其分子量为456所以最后确定其分子式为C30H48O3,b.同位素丰度比法c.高分辨质谱（HR-MS）法 HR-MS还可以给出化合物的精确分子量。从氢核磁共振波谱和碳核磁共振波谱中可直接获得碳氢的个数，再结合质谱给出的分子量的信息，就可以得到氧的个数，用这种方法也能确定化合物的分子式。,d.不饱和度 u=/2/2 1、分别代表一、三、四价原子的数目。,2.质谱法 常用的质谱有：电子轰击质谱（EI-MS）、场解析电离质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）等。质谱常用于确定分子量，并可求算分子式和提供其它结构信息。,3.红外光谱