实时荧光定量PCR反应课件.ppt

荧光定量,PCR,技术,生化教研室,研究生实验,一、实验目的,?,掌握荧光定量,PCR,的原理,?,熟悉荧光定量,PCR,的操作步骤,?,了解荧光定量,PCR,的应用,二、实验原理,?,ABI Prism?7500,型荧光定量,PCR,仪,?,7500,功能一览：,?,?,绝对定量,(Absolute Quantification),?,自动计算基线、阈值、,CT,值、浓度、百分,比,?,?,相对定量,(Relative Quantification),?,?,等位基因分型,(Allelic Discrimination),?,?,阴阳性鉴定,(Plus/Minus with IPC),实时荧光定量,PCR,技术原理,?,聚合酶链式反应（,PCR,）,可对特定核苷酸,片断进行指数级的扩增，扩增反应结束后，,可通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定,性分析，也可以通过放射性核素掺入标记,后的光密度扫描来进行定量分析。无论定,性还是定量分析，分析的都是,PCR,终产物。,实时荧光定量,PCR,?,通过对,PCR,扩增反应中每一个循环产物荧,光信号的实时检测从而实现对起始模板定,量及定性的分析。在实时荧光定量,PCR,反,应中，引入一种荧光化学物质，随着,PCR,反应的进行，,PCR,反应产物不断累计，荧,光信号强度也等比例增加。每经过一个循,环，收集一个荧光强度信号，这样我们就,可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，,从而得到一条荧光扩增曲线图。,实时荧光定量,PCR,技术：,荧光阈值和,C,T,值,?,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的,一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增,阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值,的缺省设置是,315,个循环的荧光信号的标,准偏差的,10,倍。,?,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值,时所经历的循环数被称为,C,T,值,（,threshold value,）,三、,实验内容：定量细菌,16S RNA,基因,?,引物,F,：,TCCTACGGGAGGCAGCAGT,?,引物,R:,GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT,扩增片段,447bp,?,Stage1,95,30s 1cycle,?,Stage2,95,5s,60,45s 40cycle,?,Stage3,95,15s,60,1min,95,15s,实验分组,?,按实验台分六组。,?,第一组：做阴性对照和样品，各做,2,个重复。,?,第二组：标准曲线一个浓度（,10,-1,），做,2,个重复。,?,第三组：标准曲线一个浓度（,10,-2,），做,2,个重复。,?,第四组：标准曲线一个浓度（,10,-3,），做,2,个重复。,?,第五组：标准曲线一个浓度（,10,-4,），做,2,个重复。,?,第六组：标准曲线一个浓度（,10,-5,），做,2,个重复。,操作步骤：（见下发的资料页）,四、,五、实时荧光定量,PCR,技术的应用,六、思考题,?,1.,荧光定量,PCR,的原理和应用实,例。,?,2.,使用,SYBR Green I,作荧光染料，,如何提高荧光定量,PCR,结果可靠性？,七、实验报告,?,每人写一份实验报告，交至：,10,号楼,10,楼,1012,室,?,包括：目的、原理、操作注意,事项、结果、讨论,