绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达课件.ppt

绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达,概览,和实验内容实验目的实验原理实验过程,绿色荧光蛋白(,简称),基因来源于，是等于年发现的蛋白质，由个氨基酸组成，分子量约为。在包括热、极端和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定在荧光显微镜下，用波长约 的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；蛋白本身性质稳定；可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；其基因片段长度较小(约)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性是一种优化的突变型，使其产生的荧光较普通强倍，大大增强了其报告基因的敏感度。与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子。,丝氨酸酪氨酸甘氨酸 生色基团蛋白质折叠，生色基团得以“亲密接触”,经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。,蓝光、绿光与黄光基因克隆变体,分子标记药物筛选融合抗体生物传感器信号传导,标记！,真核细胞表达载体，载体上携带有蛋白表达基因很强的复制能力高效的功能强大的启动子和多克隆位点具有基因，可以采用来筛选已成功转染了该载体的靶细胞,系统（）,原核蛋白表达引用最多的系统在任何表达系统中，基础表达水平最低真正的调节表达水平的“变阻器”控制提供各种不同融合标签和表达系统配置具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌许多载体以载体试剂盒方式提供，用于迅速定向克隆产物许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化,（）表达菌株,表达载体和宿主菌的选择（）是表达宿主菌,实验内容,得到重组质粒转入表达菌株（）经培养后用进行三个时间梯度的诱导表达，紫外线下观察,实验目的,掌握重组蛋白的基因表达和蛋白检测设计思想学习分子生物学实验主要操作技术,实验原理,实验器材与仪器,实验仪器实验材料实验试剂,实验思路,实验步骤,将重组质粒转化入表达菌株 制备（）菌株的感受态细胞（）菌液接入 液体培养基，摇床培养过夜,二次活化：比例接入新的试管摇床培养,冰上,度，离心收集细胞,弃培养液，加入预冷的液，轻悬，冰上，度，离心,弃上清液，加入预冷的液，轻悬，冰上，度，离心,弃上清液，加入预冷的液，轻悬，即可,将重组质粒转入（）菌中,分成份，份分别加入重组质粒，轻匀，冰上；份平行操作（对照）,度水浴热击，迅速冰上冷却,两管中分别加入液体培养基，匀，度振荡培养,涂平板：）分别取、加入重组质粒的感受态细胞悬液涂布于含抗生素的平板）抗生素板重组质粒的感受态细胞悬液）对照组感受态细胞抗生素平板）正面向上放置片刻，后度倒置培养,诱导重组蛋白的表达,重组阳性克隆菌接至（）液体培养基中，度培养,过夜菌比例接种至支试管中（每支试管含()），扩大培养，测量值为，停止,分别使用（最后总浓度为）诱导,离心并照相,!,参考资料,郝福英 周先碗 朱玉贤 主编基础分子生物学实验 北京大学出版社 年月第一版,