氧化还原酶-生物化学与分子生物学教研室课件.ppt

生 物 氧 化,主讲：贾彩云 讲师河南大学医学院 生物化学与分子生物学教研室,物质在生物体内进行氧化称生物氧化，主要指糖、脂肪、蛋白质等在体内分解时逐步释放能量，最终生成CO2 和 H2O的过程。又称为细胞呼吸或组织呼吸,糖,脂,蛋白质,CO2 and H2O,O2,Energy,ADP+Pi,ATP,Heat energy,生物氧化的概念,相当于分解作用或异化作用,*生物氧化与体外氧化之相同点,生物氧化中物质的氧化方式有加氧、脱氢、失电子，遵循氧化还原反应的一般规律。物质在体内外氧化时所消耗的氧量、最终产物（CO2，H2O）和释放能量均相同。,(CH)+O2H2O+CO2+热能,The differences between biologic oxidation and combustion in vitro,特点：（1）氧化在体内近中性，37、有水的环境中进行，为酶促反应（2）CO2由脱羧产生，水由底物脱下的氢经氧化呼吸链传递电子、泵出质子，最后与氧结合生成。(3）能量逐步释放，利用率高，能量用于合成ATP及维持体温.（4）氧化速率受生理功能需要和内外环境变化调控,生 物 氧 化 特 点 和 酶 类,(CH)+O2H2O+CO2+热能,乙酰CoA Acetyl-CoA,TAC,2H,呼吸链Respiratory Chain,ADP+Pi,ATP,CO2,*生物氧化的一般过程,I,II,III,营养物分解代谢的三个阶段,O2,H2O,线粒体结构,第一节 生成ATP的氧化磷酸化体系,6.1 生物氧化体系呼吸链(respiratory chain),线粒体内膜中由一系列电子传递复合体（氧化还原酶）按一定的顺序排列成链锁性氧化还原体系，代谢物脱下的成对氢原子(2H),在线粒体内膜上，通过多种酶和辅酶所催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合生成水，这一系列酶和辅酶称为呼吸链(respiratory chain)又称电子传递链(electron transfer chain)。,Cytc,Q,膜间隙,基质,线粒体内膜,呼 吸 链 组 成,呼 吸 链 组 成 和 功 能,*泛醌 和 Cyt c 均不包含在上述四种复合体中。,人线粒体呼吸链复合体,呼吸链的电子传递体,NADH/NAD+FMN and FAD铁流蛋白(Fe-S)辅酶 Q(CoQ,Ubiquinone)细胞色素类(Cyt),递氢体和电子传递体（2H 2H+2e）,The structure of NAD+and NADP+,R=H:NAD+;R=H2PO3:NADP+,尼克酰胺核苷酸,腺嘌呤核苷酸,NAD+（NADP+）和NADH（NADPH）相互转变,氧化还原反应时变化发生在五价氮和三价氮之间。,吡啶环,4,FMN,FAD,FAD:黄素腺嘌呤 二核苷酸Flavin Adenine Dinucleotide,FMN:黄素单核苷酸Flavin Mononucleotide,黄素蛋白及辅基Flavoproteins and prosthetic groups,核黄素(Riboflavin),其辅基结构中含核黄素，发挥功能的部位是异咯嗪环。,.,FMN/FAD FMNH/FADH FMNH2/FADH2,H(H+e),H(H+e),黄素蛋白辅基的作用(递氢)机制Mechanism of flavoprotein prosthetic groups,辅基铁硫簇(Fe-S)含有等量铁原子和硫原子，其中铁可进行:Fe2+Fe3+e,In a number of iron-containing proteins which take part in oxidoreduction reactions iron atoms which are not part of a haem but are linked to elemental and cysteine S atoms in the protein.Such proteins are called iron-sulfur proteins(Fe-S).铁流蛋白有几种可能形式铁硫中心是辅基即使铁硫蛋白包含几个铁原子，因为铁原子的相互靠近，铁硫中心只传递一个电子。,铁硫蛋白Iron-sulfur proteins(Fe-S),由多个异戊二烯连接形成较长的疏水侧链(人CoQ10,n=10）The structure of CoQ includes a long isoprenoid tail.Most often n=10.(CoQ10),泛醌是线粒体内膜电子传递链中脂溶性辅酶 CoQ 是一组苯醌衍生物中的一种，这组苯醌衍生物具有不同长短的类异戊二烯侧链 CoQ是线粒体内膜中一个可移动的质子电子载体.,泛醌(辅酶Q,CoQ,Q)Ubiquinone(Coenzyme Q,CoQ,Q),通过两步反应，泛醌获得两个质子两个电子被完全还原。氧化还原反应时可生成激活性中间产物半醌型泛醌。,Ubiquinone(Q,or coenzyme Q),细胞色素是一类以铁卟啉为辅基的催化电子传递的酶类，根据它们吸收光谱不同而分三类(a、b、c)。,Cytochromes are是具有亚铁血红素辅基的蛋白质 在氧化还原反应中铁原子在Fe3+and Fe2+转换Cytochromes are根据 categorized into different groups according to the light wavelength共轭双键使他吸收可见光Cytochromes are是单电子传递体呼吸链中有几种不同的细胞色素,namely,cytochromes b,c1,c and aa3.The cytochrome aa3 is also termed 细胞色素氧化酶，它催化呼吸链最后一个化学反应，分子氧被还原成水.Cytochrome c is a small,water-soluble protein with a single heme亚铁血红素group.,细胞色素 Cytochromes(Cyt),各类细胞色素的主要差别在：,铁卟啉辅基的侧链铁卟啉与蛋白质部分的连接方式,*Ubiquinone or Cytochrome c is not part of an enzyme complex,电子传递链酶复合体及其功能,复合体:NADH-泛醌氧化还原酶,NADH CoQ,FMN;Fe-SN-1a,b;Fe-SN-4;Fe-SN-3;Fe-SN-2,功能：把 NADH+H+两个电子经传递至Q使Q摄取基质2个H+转变为QH2泵出4个H+到膜间隙,Complex II:Succinate Oxidoreductase 复合体:琥珀酸-泛醌氧化还原酶,Function:Succinate to Ubiquinone(将电子从琥珀酸传递给泛醌),The enzyme has two transmembrane subunits,C and D;the cytoplasmic extensions contain subunits B and A.Just behind the FAD in subunit A is the binding site for succinate.Subunit B has three sets of Fe-S centers;ubiquinone is bound to subunit C;and heme b is sandwiched between subunits C and D.A cardiolipin molecule is so tightly bound to subunit C that it shows up in the crystal structure.Electrons move from succinate to FAD,then through the three Fe-S centers to ubiquinone.,(复合体没有H+泵的功能),复合体:泛醌-细胞色素c氧化还原酶,将电子从泛醌传递给细胞色素c泵出4个H+到膜间隙,Q循环：复合体III把2分子QH2的2个电子传给Cyt C，另2个电子传给Q生成1分子Q和1分子QH2，并同时偶联泵出4个H+到膜间隙的过程,Complex IV:cytochrome oxidase复合体:细胞色素c氧化酶,功能：其中Cyt a3 和CuB形成的活性部位将电子交给O2（将电子从细胞色素c传递给氧）,Cytochrome oxidase(complex IV)carries out the following irreversible reaction:O2+4 H+4 e-2 H2OThe four electrons are transferred into the complex one at a time from cytochrome c.,1、NADH氧化呼吸链NADH 复合体Q 复合体Cyt c 复合体O2,2、琥珀酸氧化呼吸链 琥珀酸 复合体 Q 复合体Cyt c 复合体O2,NADH氧化呼吸链,FADH2氧化呼吸链,线粒体中某些底物氧化的呼吸链,标准氧化还原电位 还原状态呼吸链缓慢给氧 特异抑制剂阻断 拆开和重组,呼吸链成分的排列顺序由以下实验确定,呼吸链和相关电子载体的氧化还原电位Standard Reduction Potentials of Respiratory Chain and Related Electron Carriers,e-,电子载体排列顺序的确定方法Method for determining the sequence of electron carriers,当被氧化时电子载体吸收光谱属性发生改变。给处于完全还原状态的电子载体突然供氧，每个电子载体氧化速率显示它在呼吸链中的位置（光度计测量）。,用特异的阻断剂说明电子载体排列顺序Studies with specific inhibitors help to reveal the orders of the electron carriers,Conceptually Simple,Structurally Complex,用去污剂溶解线粒体内膜收集内膜片段,获得线粒体内膜超分子复合体每个复合体能完成线粒体一步电子传递,CO2 and H2O,O2,Energy,ADP+Pi,ATP,Heat energy,Respiratory chain,Phosphorylation,6.2 氧化磷酸化将氧化呼吸链释能与ADP磷酸化生成ATP偶联,*（一）定义:代谢物脱下的氢，经呼吸链电子传递过程中释出的能量使ADP磷酸化，生成ATP，这种氧化和磷酸化偶联在一起的过程称氧化磷酸化,也称偶联磷酸化。,氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation),氧化磷酸化偶联部位：复合体、根据自由能变化和P/O比值,氧化磷酸化偶联部位Sites of ATP formation,电子传递链自由能变化,These spans can provide sufficient energy for ATP formation from ADP and phosphate.,P/O:指代谢物在线粒体氧化时，每消耗1mol氧原子 所消耗无机磷的mol数，即生成ATP的mol数。,2.P/O比值(Phosphorus/Oxygen ratio),A measure of how many moles of ATP are formed from ADP by phosphorylation per gram atom of oxygen used.,每消耗1mol氧原子,所消耗无机磷的mol数,1个氧原子 无机磷的个数,2e+OO2-ADP+PiATP,一对电子通过呼吸链 生成ATP的个数,Historically,the experimental values seemed to be about 3 for NADH and 2 for succinate.With the XP model they should be an integral number.However,the chemiosmotic model can lead to non-integral values.The accepted values are 10/4=2.5 for NADH and 6/4=1.5 for succinate.,（二）氧化磷酸化的偶联机制,Peter D.Mitchell(1920-1992),20世纪50年代Slater 及Lehninger 提出化学偶联学说 1964年Boear 又提出构象变化偶联学说 1961年英国生化学家Mitchell提出化学渗透假说(Chemiosmotic coupling hypothesis),电子经呼吸链传递时，可将质子(H+)从线粒体内膜的基质侧泵到内膜胞浆侧，产生膜内外质子电化学梯度储存能量。当质子顺浓度梯度回流时驱动ADP与Pi生成ATP。,1.化学渗透假说(Chemiosmotic hypothesis),Intermembrane space,Matrix,Chemiosmotic Model,-Peter Mitchell,2.ATP合酶,亲水部分 F1(33subunits),Intermembrane space,Matrix,F1 and F0,疏水部分F0(a1b2c912 subunits),Binding-change model for ATP synthase,H+由膜间隙向基质回流推动C环逆时针方向转动，带动在头部中央孔隙转动。头部亚基未接触时为松驰（L）型构象，可结合ADP和Pi；接触转动来的后变构为紧密（T）型构象，催化ADP和Pi合成ATP；转动离开后又变构为开放（O）型构象，释出合成的ATP；之后，自动恢复为L型构象。如此LT OL不断变构，使ATP不断合成。,6.3、影响氧化磷酸化的因素,抑制剂,ADP的调节作用,甲状腺激素,线粒体DNA突变,1.呼吸链抑制剂 Inhibitors of repiratory chain 阻断呼吸链中某些部位电子传递。2.解偶联剂 Uncouplers of oxidative phosphorylation 使氧化与磷酸化偶联过程脱离。如：解偶联蛋白(uncoupling protein)3.氧化磷酸化抑制剂Inhibitor of oxidative phosphorylatio 对电子传递及ADP磷酸化均有抑制作用。如：寡霉素(Oligomycin),.抑制剂 Inhibitors,Rotenone 鱼藤酮Piericidin 粉蝶霉素AAmobarbital 异戊巴比妥,Antimycin 抗霉素ADimercaptopropanol,BAL 二巯基丙醇,CO、CN-、N3-及H2S,Inhibition of electron transfer,2,4-二硝基苯酚,羰基-氰-对三氟甲氧基苯肼(FCCP),双香豆素(血液凝固防止剂),解 偶 联 剂,Uncouplers of oxidative phosphorylation,Uncoupling agents dissolve in the membrane and function as carriers for H+,解偶联剂作用机制：,电子传递使H+跨膜转移,H+内膜内外电化学梯度,H+经ATP合酶的F0回流,合成ATP,H+经从其它途径回流,能量以热能散失,不能合成ATP,Q,基质侧 Matrix,Uncoupling protein,Intermembrane space 胞液侧,Mechanism of the Uncoupling protein(Uncoupled Mitochondria in Brown Fat Produce Heat),Mechanism of hormonally induced uncoupling of oxidative phosphorylation in brown fat mitochondria.,解偶联蛋白-1（UCP-1，也称产热素）：存在于棕色脂肪组织线粒体内膜，可被游离脂肪酸激活，将膜间隙质子转运到基质。,氧 化 磷 酸 化 抑 制 剂,Oligomycin(寡霉素),Oligomycin,Matrix,Intermembrane space,与F0的亚基结合阻止H+从F0回流,抑制ATP合成,H+电化学梯度异常,抑制磷酸化过程,抑制电子传递的氧化过程,任何组织任何时间合成ATP速度依赖于可利用的ADP and Pi量没有电子流就没有磷酸化，没有磷酸化就没有电子流.还原型底物,ADP and Pi and O2 是氧化磷酸化所必需.例如缺乏ADP和氧,电子流停止;还原型底物不被消耗ATP也不能合成。,代谢物对氧化磷酸化的影响,Respiratory Control,.ADP的调节作用,【ADP】oxidative phosphorylation【ADP】oxidative phosphorylation,呼吸控制率(respiratory control ratio,RCR)离体线粒体在过量底物(琥珀酸)条件下，加入ADP后的耗氧速率与仅有底物时的耗氧速率之比，称为呼吸控制率，是观察氧化磷酸化偶联程度的指标。,.甲状腺激素Thyroid Hormone,consume of O2,energy,Na+-K+-ATPase,ATP catabolism,ADP,oxidative phosphorylation,formation of ATP,诱导细胞膜上Na+,K+ATP酶生成，促进ATP分解甲状腺激素可使解偶联蛋白基因表达增加,Formation of ATP and catabolism of ATP,.线粒体DNA突变Mitochondrial DNA Mutations,Energy,Mt.DNA,13条多肽链的基因22个tRNA的基因2个rRNA的基因,裸露的环状双螺旋结构,Free radical,DNA mutation,Inhibition of oxidative phosphorylation,The mitochondrial genome,The Effect of Mutations in mtDNA,It is a circular piece of DNAInheritance is maternal,non-Mendelian13 proteins of the electron transport chain are coded 900 mitochondrial proteins are coded by the nuclear DNA and imported Mutations in mtDNA frequently seen as muscle or neurological problems(especially visual)Reactive oxygen species produced by e-transport chain are mutagenic,电子传递链及氧化 磷酸化系统概貌,H+跨膜质子电 化学梯度H+m内膜基质侧H+H+c 内膜胞液侧H+,目 录,生物体把能量用在生命活动的各个方面,6.4 ATP在能量的生成、利用、转移和储存中起核心作用,ATP,高能磷酸键与高能磷酸化合物,高能磷酸键水解时释放的能量大于21KJ/mol的磷酸酯键，常表示为 P。高能磷酸化合物:含有高能磷酸键的化合物,The two phosphoanhydride bonds(red)in ATP,which link the three phosphate groups,each has a G of 7.3 kcal/mol for hydrolysis.Hydrolysis of these bonds,especially the terminal one,drives many energy-requiring reactions in biological systems.,ATP,Creatine Phosphate CP(磷酸肌酸):Creatine is an amino acid that does not occur in proteins but is found in the muscle tissue of vertebrates both in the free form and as phosphocreatine;supplies energy for muscle contraction,磷酸肌酸作为肌肉和脑组织中能量的一种贮存形式。,除了ATP外，肌肉组织中还有另外一种高能化合物：磷酸肌酸。当磷酸肌酸水解时释放的能量用于ATP合成。然而；贮存人体的磷酸肌酸总数极其有限的，ATP水解释放的能量常常用来合成磷酸肌酸。,系统最重要的意义：ATP-PC是迅速利用的能源系统,ATP的生成和利用,ATP,ADP,Oxidative Phosphorylation(氧化磷酸化)Substrate level Phosphorylation(底物水平磷酸化),机械能(肌肉收缩)渗透能(物质主动转运)化学能(合成代谢)电能(生物电)热能(维持体温),ATP循环,氧化磷酸化:the synthesis of ATP from ADP that is coupled to the operation of the respiratory chain.The oxidative phosphorylation is the main source of energy in aerobic cell.底物水平磷酸化:phosphorylation of ADP coupled to a dehydrogenation(or a dehydration)of an organic substrate,independent of the respiratory chain,ATP,底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation)是底物分子内部能量重新分布，生成高能键，使ADP磷酸化生成ATP的过程。,1,3-二磷酸甘油酸转变成3-磷酸甘油酸,在以上反应中，底物分子内部能量重新分布，生成高能键，使ADP磷酸化生成ATP的过程，称为底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation)。,1,3-二磷酸 甘油酸,3-磷酸甘油酸,6.5 通过线粒体内膜的物质转运The Inner Membrane of Mitochondrion and Transporter,线粒体外膜通透性高，线粒体对物质通过的选择性主要依赖于内膜中不同转运蛋白(transporter)对各种物质的转运。,线粒体外膜孔蛋白，10kDa的物质通过,线粒体内膜不同的转运体,对物质有选择性,线粒体内膜的主要转运蛋白,腺苷酸转运蛋白Adenine nucleotide transporter,参与ADP与ATP反向转运。,ATP4-,ADP3-,H2PO4-,每分子ATP4-和ADP3-反向转运时，向内膜外净转移1个负电荷，相当于多1个H+转入线粒体基质。,胞浆中NADH+H+通过苹果酸-天冬氨酸穿梭作用（肝、心等）或-磷酸甘油穿梭作用（脑、骨骼肌等，）穿过内膜到基质而进入氧化呼吸链。因两种穿梭进入线粒体后产物不同，故进入的氧化呼吸链不同。前者进入NADH呼吸链，后者进入FADH2呼吸链。,胞 浆 中 NADH 的 氧 化,NADH+H+,FADH2,NAD+,FAD,线粒体 内膜,线粒体 外膜,膜间隙,线粒体 基质,磷酸二羟丙酮,-磷酸甘油,NADH+H+,NAD+,谷氨酸-天冬氨酸 转运体,苹果酸-酮 戊二酸转运体,苹果酸,草酰乙酸,-酮戊二酸,谷氨酸,胞液,线粒体内膜,基质,天冬氨酸,Malate-aspartate shuttle,其 他 不生成 ATP 氧 化 体 系,氧化酶(Oxidase)：催化底物脱氢，经铜离子传电子给氧，再与质子结合成水的酶类。,活性氧族 超氧离子(O2)、H2O2、羟自由基(OH)的统称。,Reactive oxygen species:H2O2分子(#5)次氯酸离子(#6)羟自由基(#3).他们是最活泼的。右图显示与羟基的区别。(#4).超氧阴离子，既是阴离子又是自由基(#2)自由基是带有不成对电子的一簇原子，这个不成对电子位于电子轨道的最外面，它是一个极不稳定的结构极易与其他的分子或自由基反应达到稳定态,一、抗氧化酶体系有清除反应活性氧类的功能,反应活性氧类(reactive oxygen species,ROS),ROS主要来源,线粒体：超氧阴离子O-2，是体内O-2的主要来源；O-2在线粒体中再生成H2O2和OH。过氧化酶体：FAD将从脂肪酸等底物获得的电子交给O2生成H2O2和羟自由基OH。胞浆需氧脱氢酶（如黄嘌呤氧化酶等）也可催化生成O-2。细菌感染、组织缺氧等病理过程，环境、药物等外源因素也可导致细胞产生活性氧类。,需氧脱氢酶和氧化酶Aerobic Dehydrogenases and Oxidases,抗氧化酶体系,The image above is the 3D structure of catalase from E.coli.,过氧化氢酶体内周转速度非常快40,000,000 molecules/second这对过氧化氢的解毒作用非常重要，防止血中二氧化碳的形成。过氧化物酶以血红素为辅基，催化H2O2直接氧化酚类或胺类化合物,谷胱甘肽过氧化物酶,H2O2(ROOH),H2O(ROH+H2O),2G SH,G S S G,NADP+,NADPH+H+,此类酶可保护生物膜及血红蛋白免遭损伤。,谷胱甘肽还原酶,含硒的谷胱甘肽过氧化物酶,Clinical Correlation,Glucose 6-P Dehydrogenase(G6PD)Deficiency,red blood cell(erythrocyte),G6PD,Lack of G6PD results in loss of NADPH production,Loss of glutathione antioxidant system,increased oxidative stress,membrane damage and red blood cell lysis,NADPH,glutathionereductaseactivity,X,X,increased H2O2oxidative stresshemolysis,溶血性贫血 Hemolytic anemia,What is favism?(蚕豆病),Favism is anemia caused by hemolysis or the destruction of healthy erythrocytes(red blood cells,RBC).The victim,usually a male,feels tired,nauseous,dizzy,and has dark orange urine indicating the passage of blood.The anemia is usually transient(short-lived),but if severe enough,it is fatal.The anemia is caused by a deficiency in an enzyme,glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD).如NADPH生成障碍（如缺乏6磷酸葡萄糖脱氢酶）谷胱甘肽则不能维持于还原状态，可引起溶血。这种溶血现象可因服用蚕豆及某些药物如磺胺药、阿司匹林而引起，称为蚕豆病。,催化以下类似的反应:O2-+O2-+2H+H2O2+O2歧化酶催化两个相同的底物，在这个过程中产生过氧化氢，由过氧化氢酶或过氧化物酶催化,2O2+2H+,SOD,H2O2+O2,H2O+O2,catalase,超氧化物歧化酶Superoxide Dismutase(SOD),O2-等对机体影响,1.生理量：参与生物转化、需氧脱氢反应、杀菌作用等。2.过量：氧化破坏不饱和脂肪酸，破坏生物膜损伤蛋白质含-SH基酶及蛋白质使DNA交联氧化、变性、突变加重炎症，促动脉粥样硬化，形成脂褐素使细胞功能下降等,Reactive oxygen species can be scavenged by some compounds,清除、抑制它们产生，对抗它们的作用物质叫抗氧化剂小分子抗氧化物（维生素E、C，泛醌，-胡萝卜素）等可与O-等经化学反应而消除。,微粒体中的酶类,微粒体加单氧酶系微粒体:一种细胞浆中的微小颗粒，典型的组成是附着有核糖体的内质网碎片。还原型底物获得一个氧原子被氧化，另一个氧原子游离水中,RH+NADPH+H+O2,ROH+NADP+H2O,加单氧酶故又称混合功能氧化酶或羟化酶。,上述反应需要细胞色素P450(Cyt P450)参与。功能：参与类固醇激素、胆汁酸等生物合成及生物转化,混合功能氧化酶的催化机制,RHP450Fe2+,RHP450Fe3+O2-,RHP450Fe3+O22-,加单氧酶的多种功能：,类谷醇激素的合成、维生素D3的羟化、胆汁酸及胆色素的生成不饱和脂酸生成中双键的引入药物、毒物的生物转化,THANKS!,