植物离体培养育种课件.ppt

第八章 植物离体培养育种,园艺植物育种学离体培养育种,第八章 植物离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及应用第二节 组织与器官培养第三节 花药和花粉培养与单倍体育种第四节 植物细胞培养及其突变体筛选第五节 原生质体培养与体细胞杂交,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用一、植物离体培养的概念植物离体培养（Plant in vitro culture）：即广义的植物组织培养（Plant tissue culture），是指通过无菌操作，将植物的组织、器官、细胞以及原生质体等接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。是现代生物技术的一个重要组成部分。,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用二、植物离体培养的类型按外植体的种类和培养目的来分:1、胚胎培养（embryo culture）2、组织培养（tissue culture）3、器官培养（organ culture）4、花粉培养与花药培养（pollen and anther culture）5、细胞培养（cell culture）6、原生质体培养（protoplast culture）,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用二、植物离体培养的类型按外植体的种类和培养目的来分:1、胚胎培养（embryo culture）:以胚及具有胚的器官作为外植体，在离体培养条件下，使其再生完整植株的技术。包括胚（幼胚、成熟胚）、胚乳、胚珠、子房。2、组织培养（tissue culture）：以植物各部分组织为外植体的离体培养技术。如分生组织、形成层组织、表皮组织、薄壁组织等,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用二、植物离体培养的类型3、器官培养（organ culture）以植物的某一器官的全部或部分或器官原基作为外植体的离体培养技术。如根尖、茎尖、茎段、叶片等4、花粉培养与花药培养（pollen and anther culture）花粉培养通常是指以未成熟花粉作为外植体的离体培养技术。又称游离小孢子培养。花药培养通常是指以未成熟花药作为外植体的离体培养技术。,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用二、植物离体培养的类型5、细胞培养（cell culture）以能保持较好分散性的单细胞或很小的细胞团作为外植体的离体培养技术。6、原生质体培养（protoplast culture）以除去细胞壁而获得的原生质体作为外植体的离体培养技术。,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用1、扩大变异范围 植物组织细胞培养物及其再生植株并非是遗传上同一的。体细胞无性系变异，变异谱甚广，且是随机的。2、克服远缘杂交的一些障碍 用胚珠和子房培养进行试管授粉和受精，可以克服由于柱头或花柱等障碍所造成的杂交或自交不亲和性。胚培养克服杂种不育性。胚挽救,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用3、获得体细胞杂种 通过原生质体融合途径可以部分克服有性杂交种间的障碍，获得体细胞杂种。不同种间、属间甚至科间通过该技术可以广泛杂交，这对于无性繁殖的园艺植物具有更特殊的意义。对称融合、非对称融合。,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用4、倍性控制 通过植物的胚胎、器官及细胞培养，可以实现对再生植株的倍性控制。胚乳培养 三倍体植株 花粉、花药培养 单倍体植株 细胞培养（染色体加倍）多倍体植株,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用5、突变的诱导和离体选择 培养组织或细胞处在不断地分裂分化状态，它容易受到培养条件和外加压力的影响而产生突变，而且这种突变可以在实验室相对均一的条件下进行选择，提高选择效果。诱变物质：物理和化学物质,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用6、加速亲本材料的纯化 通过花药及花粉培养再生单倍体植株，再使单倍体植株的染色体加倍，便可获得纯合稳定的二倍体植株。7、快速无性繁殖 名特优新品种、优良自交不亲和系、雄性不育系等,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用8、获得脱毒苗 农作物中有很多植物都带有病毒，特别是无性繁殖作物，所带病毒多是通过营养体繁殖，严重影响作物产量和品质。9、种质资源的试管保存 利用茎尖及细胞培养结合低温或超低温冷冻贮藏保存种质资源。,园艺植物育种学离体培养育种,第一节 植物离体培养的概念及其应用三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用10、可作为外源基因转化的受体系统 利用植物组织、细胞及原生质体作为受体。,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养一、实验室二、培养条件三、步骤与方法,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养一、实验室1、无菌操作室2、培养室3、化学实验室、洗涤消毒室和细胞学实验室,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养二、培养条件1、培养基2、无菌操作3、培养的环境条件,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养二、培养条件1、培养基种类：固体培养基 液体培养基营养成分：无机成分、有机成分、天然复合物、植物生长调节剂配方：常用的有MS、ER、B5、SH、HE等。,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养二、培养条件2、无菌操作污染来源培养基及玻璃器皿无菌操作室、所用器械外植体,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养二、培养条件2、无菌操作材料的消毒消毒剂的种类：Ca(Cl)2、NaClO、H2O2、AgNO3、HgCl2、酒精等消毒方法：材料修整流水冲洗药剂消毒（常用75%乙醇浸渍30s 0.1%升汞浸泡210min或2%10%NaClO浸泡1030min无菌蒸馏水冲洗35次）,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养二、培养条件3、培养的环境条件光照：白色荧光灯，光强10005000Lx，1216hr，用自动定时器控制光照时间温度：多为252湿度：容器内湿度：100%环境湿度：要求70%80%,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养三、步骤与方法1、无菌培养的建立2、营养繁殖体的增殖3、生根4、试管苗移栽大田,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养三、步骤与方法1、无菌培养的建立 主要考虑外植体能够存活,没有菌的污染2、营养繁殖体的增殖 使繁殖体实现最大限度地增殖。增殖方式：诱导腋芽的发生诱导产生不定芽体细胞胚胎发生,园艺植物育种学离体培养育种,第二节 组织与器官培养三、步骤与方法3、生根 生根产生完整植株，要求培养基中含促进生根的生长素类物质。4、试管苗移栽大田 主要目的是提高移栽成活率。,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种一、单倍体在植物育种上的重要性二、花药和花粉培养技术三、单倍体植株的染色体加倍,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种一、单倍体在植物育种上的重要性单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体有利于远缘杂交新类型的培育和稳定与诱变育种相结合可加速育种进程可作为外源基因转化的受体系统,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种二、花药和花粉培养技术1、花药培养材料的选取：大多数为单核中晚期材料灭菌接种培养再生单倍体植株,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种二、花药和花粉培养技术1、花药培养接种培养 接种：尽量避免损伤花药 彻底去除花丝 培养：方式：固体培养和液体培养 培养条件：一些作物培养初期需黑暗培养,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种二、花药和花粉培养技术1、花药培养再生单倍体植株胚状体途径愈伤组织 器官分化途径,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种二、花药和花粉培养技术2、花粉培养 花粉的分离：机械分离法：在液体培养基中，轻轻挤压花药或花蕾，200目镍丝网过滤，34次离心（500r/min 35min)自然散落法：花药直接接种，自然开裂时移走花药继续培养或离心收集花粉后培养。,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种二、花药和花粉培养技术2、花粉培养花粉的培养：浅层液体培养法看护培养法,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种二、花药和花粉培养技术3、影响花药及花粉培养的因素供体植株的基因型培养基小孢子发育阶段供体植株的生理状态及培养前的预处理培养方式,园艺植物育种学离体培养育种,第三节 花药和花粉培养与单倍体育种三、单倍体植株的染色体加倍自然加倍人工诱导加倍从愈伤组织再生二倍体植株,园艺植物育种学离体培养育种,第四节 植物细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养二、细胞突变体的筛选,园艺植物育种学离体培养育种,第四节 植物细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养 单细胞培养是指从植物组织器官或愈伤组织游离出单细胞，在无菌条件下，使其再生完整植株的技术。1、单离细胞的方法物理方法：外植体愈伤组织液体培养基中振荡过滤离心（500r/min 510min）化学方法：草酸钙、秋水仙碱、水解乳蛋白酶法：果胶酶和纤维素酶,园艺植物育种学离体培养育种,第四节 植物细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养2、单细胞培养方法液体浅层培养微滴培养平板培养看护培养饲喂层培养条件培养,园艺植物育种学离体培养育种,第四节 植物细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养3、培养细胞的密度及活力测定起始培养的细胞密度：每毫升培养液104108个细胞细胞活力测定：染色法 荧光素双醋酸盐（FDA）酚藏花红 Evans blue(Evans 蓝）植板率的测定,园艺植物育种学离体培养育种,第四节 植物细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养3、培养细胞的密度及活力测定植板率的测定：植板率是平板培养中常用的一个术语，用来反映植板效率的高低，其含义是每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分率。植板率=每平板形成的细胞团数/每平板接种的细胞总数 100%,园艺植物育种学离体培养育种,第四节 植物细胞培养及其突变体筛选二、细胞突变体的筛选1、细胞突变体筛选的一般技术细胞材料的选择诱发突变的方法突变细胞的选择方法,园艺植物育种学离体培养育种,第四节 植物细胞培养及其突变体筛选二、细胞突变体的筛选2、突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定3、农业上有用性状的突变体离体筛选对病害的抗性对土壤障碍的抗耐性对除草剂的抗性对温度的抗耐性,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交植物原生质体：是指除去细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。原生质体融合：也称体细胞杂交，指使不同的原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。一、原生质体的分离二、原生质体的培养三、原生质体的融合四、原生质体融合体的发育及杂种细胞的筛选五、体细胞杂种植株的再生及其鉴定,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体的分离1、分离原生质体的材料来源叶肉组织，无菌苗的子叶，愈伤组织及悬浮细胞最常用。,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体的分离2、分离方法机械法酶分离法 酶：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶 渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖等,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体的分离3、原生质体分离的操作程序 分离：两步法：果胶酶使细胞分离纤维素酶及半纤维素酶降解细胞壁一步法：果胶酶、纤维素酶及半纤维素酶混合处理,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体的分离3、原生质体分离的操作程序 纯化：过滤离心漂浮法界面法,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体的分离3、原生质体分离的操作程序过滤离心：4060 m镍丝网过滤离心（1000r/min 35min）清洗液悬浮离心35次漂浮法：原生质体悬浮液与0.30.6mol/L蔗糖溶液混合离心（8001000r/min 5min）吸管收集悬浮离心界面法：过滤 CPW-13%甘露醇溶液洗涤离心沉淀用8mL CPW-25%蔗糖溶液悬浮加入2mL CPW-13%甘露醇溶液离心,园艺植物育种学离体培养育种,界面梯度离心获得的原生质体聚集带,纯化后的原生质体,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交二、原生质体的培养1、原生质体的培养方法 同单细胞培养2、原生质体的分裂与增殖3、植株再生,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交二、原生质体的培养2、原生质体的分裂与增殖,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交二、原生质体的培养2、原生质体的分裂与增殖,小愈伤组织转至固体培养基,来自原生质体的小愈伤组织,来自原生质体的细胞团,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交三、原生质体的融合3、植物再生,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交三、原生质体的融合1、原生质体融合的类型自发融合诱导融合2、诱导融合的方法和步骤,园艺植物育种学离体培养育种,诱导融合的方法和步骤,1,2,3,原生质体融合过程（图版1,2,3是间隔2min拍摄到的同一个融合体）,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交四、原生质体融合体的发育及杂种细胞的筛选1、原生质体融合体的发育双亲细胞核同步有丝分裂，完成真正的核融合。双亲细胞核的有丝分裂不能同步或同步性不好，不能发生真正融合。2、杂种细胞的筛选 把杂种细胞从双亲细胞和同源融合体的混合群体中筛选出来，转移到适宜培养条件下进行培养。杂种细胞选择方法有多种，但不具有通用性。,园艺植物育种学离体培养育种,第五节 原生质体培养与体细胞杂交五、体细胞杂种植株的再生及其鉴定1、形态学鉴定2、细胞学鉴定3、生化鉴定4、DNA检测鉴定,园艺植物育种学离体培养育种,小结,植物离体培养技术包括组织培养、器官培养、胚胎培养、花粉培养与花药培养和原生质体培养。在园艺植物育种中的应用主要有扩大变异范围、克服远缘杂交的一些障碍、获得体细胞杂种、倍性控制、突变的诱导和离体选择、加速亲本材料的纯化、快速无性繁殖、获得脱毒苗、种质资源的试管保存、可作为外源基因转化的受体系统。组织培养的程序主要有无菌培养的建立、营养繁殖体的增殖、生根和试管苗移栽大田等过程。,园艺植物育种学离体培养育种,小结,花药培养与花粉培养、细胞培养和原生质体培养与其他组织培养有相同之处，也有其特殊的方面。重点了解在单倍体育种、突变体的筛选以及克服有性杂交种的障碍方面的应用。,园艺植物育种学离体培养育种,作业,1.植物离体培养有哪些主要类型？2.试述植物离体培养技术在园艺植物育种上的应用。3.试述植物组织培养的步骤和方法。4.简述单倍体在园艺植物育种上的应用。5.简述获得体细胞杂种的步骤和方法。,园艺植物育种学离体培养育种,谢谢大家,