生物化学第7章蛋白质的分离纯化和表征课件.ppt

第,7,章,蛋白质的分离、,纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质,二、蛋白质分子的大小与形状,三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,四、蛋白质分离纯化的一般原则,五、蛋白质的分离纯化方法,六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,(,Isolation,purification and characteristics of proteins,),表征：事物显露在外的征象,一、蛋白质的酸碱性质,蛋白质的等电点和等离子点,对某一种蛋白质来说，在某一,pH,下，它所带的,正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个,pH,叫该蛋,白质的等电点（,Isoelectric,point,）。,在没有其它盐,类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数,与质子受体基团接受的质子数相等时的,pH,叫该蛋白,质的等离子点（,isoionic,point,）。等离子点是蛋白,质的一个特征常数？,二、蛋白质分子的,大小与形状,根据化学组成测定最低分子量,用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质（原,子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设,蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以,计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含,铁量为,0.335%,，其最低分子量可按下式算出：,16700,100,335,.,0,8,.,55,100,335,.,0,?,?,?,?,?,铁的原子量,蛋白质的分子量,%,335,.,0,%,100,铁的原子量,蛋白质的分子量,?,根据化学组成测定最低分子量,若蛋白质中含有,n,个被测原子，则分子量等于,最低分子量,n,.,若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过,测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白,质的分子量。,渗,透,压,测,定,的,示,意,图,Vant Hoff,公式,在理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关,系可用,Vant,Hoff,公式表示：,V,RT,M,g,V,nRT,r,?,?,?,?,r,r,M,cRT,M,RT,V,g,?,?,?,?,式中,是渗透压（,N/m,2,，即,Pa,），,V,是溶液的体,积（,m,3,），,n,是溶液中溶质的摩尔数，,g,是溶质的质,量（,g,），,c,是溶质的浓度（,g,/m,3,），,T,是绝对温度,（,K,），,R,是气体常数（,8.314J/K,mol,），,M,r,为溶质,的分子量或摩尔质量（,g,/mol,）。,渗透压法测定蛋白质的分子量,在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。,但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。,在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示：,?,?,?,?,?,?,?,?,2,Kc,M,c,RT,r,?,RTKc,M,RT,c,r,?,?,?,c,RT,M,c,r,?,0,lim,?,?,RTKc,c,RT,M,r,?,?,?,当,c,趋向于,0,时，,RTKc,趋向于,0,，但,/c,不趋向于,0,，而,是趋向于一定值。,渗透压法测定蛋白质,的分子量,测定几个不同浓度下的渗透压，以,/c,对,c,作图，,并外推至,c,为,0,时的,/c,，再代入上式求得,M,r,。,为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分,布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围,内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作,膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。,沉降分析法测定蛋白质,的分子量,用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量,需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每,分钟,6,万,8,万转，这样高的转速使得被离心的分,子受到的离心力达到,40,万,70,万,g,。,超速离心机工作原理,制备型超速离心机,分析型超速离心机,被离心分子的受力分析,沉降速度法,在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受,到三种力的作用：,x,m,F,p,c,2,),(,?,?,离心力,x,v,m,x,V,F,p,p,b,2,2,),(,?,?,?,?,浮力,dt,dx,f,v,f,F,f,?,?,),(,摩擦力,离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力：,),1,(,2,2,2,?,?,?,?,v,x,m,x,v,m,x,m,F,F,p,p,p,b,c,?,?,?,?,?,式中,m,p,是分子颗粒的质量（,g,）；,是转头的角,速度（,rad/s,）；,x,是旋转轴心至界面的径向距离,（,cm,）；,2,x,是离心加速度；,V,p,是分子颗粒的体积；,是溶剂的密度（,g/cm,3,）；,是蛋白质的偏微分比容,（偏微分比容：当加入,1g,干物质到无限大体积的溶,剂中时，溶液体积的增量）；,V,p,或是被分子颗粒,排开的溶剂的质量；,f,是摩擦系数；,v,是沉降速度，,即,dx/dt,。,v,沉降速度法,f,F,F,F,b,c,?,?,dt,dx,f,v,x,m,p,?,?,),1,(,2,?,?,f,v,m,x,dt,dx,p,),1,(,2,?,?,?,?,当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩,擦力大小相等，方向相反：,即,整理得,等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定值，,可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将此定值称,为沉降系数（,sedimentation coefficient,），用,s,（小,写）表示。,沉降速度法,dt,x,d,dt,x,d,dt,x,dx,x,dt,dx,s,2,2,2,2,log,303,.,2,ln,?,?,?,?,?,?,?,?,是,logx,对,t,作图所得直线的斜率，因此测得在,t,1,t,2,t,3,时间相应的,x,1,x,2,x,3,，作图求出斜率，,代入上式即可求出沉降系数,s,，沉降系数的单位是,秒。,dt,x,d,log,沉降速度法,蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数,介于,1,10,13,到,200,10,13,秒之间。为了使用方,便，以,10,13,秒为一个沉降系数的单位，称为斯维,得贝格单位（,Svedberg,unit,），或称沉降系数单,位，用,S,（大写）表示。如人血红蛋白的,s,为,4.46,10,13,秒，即,4.46S,。,沉降速度法,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,),(,),(,20,20,20,b,t,p,w,w,p,b,t,b,t,w,s,s,?,?,?,?,?,?,由于测定时温度和溶剂性质对,s,值都有影响，需,要校正成标准条件下的,s,值，这样才便于比较。标准,条件是,20,，溶剂是水。标准条件下的,s,值记为,s,20,w,。,校正公式如下：,由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使,得,s,值减小。为排除因蛋白质浓度造成的测定误差，,可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的,s,值，然后,外推至浓度为,0,时的,s,20,w,。,蛋白质分子颗粒的质量,，爱因斯坦萨,德兰德方程：,。式中,M,r,是蛋白质的分子量，,N,为阿伏加德罗常数，,f,为摩擦系数，,R,为气体常数，,T,为绝对温度，,D,为扩散系数。,将上述两式代入,得,沉降速度法,N,M,m,r,p,?,ND,RT,f,?,f,v,m,s,p,),1,(,?,?,?,),1,(,?,v,RT,ND,N,M,s,r,?,?,?,),1,(,?,v,D,s,RT,M,r,?,?,此式称为,Svedberg,方程，代入各种数据可计算,出蛋白质的分子量。蛋白质的,约为,0.74,cm,3,/g,v,氨基酸残基的偏微分比容,氨基酸,偏微分比容,(cm,3,/g),氨基酸,偏微分比容,(cm,3,/g),Gly,0.64,Cys,0.61,Ala,0.74,Trp,0.74,Ser,0.63,Tyr,0.71,Thr,0.70,His,0.67,Val,0.86,Arg,0.70,Leu,、,Ile,0.90,Lys,0.82,Pro,0.76,Asp,0.60,Met,0.75,Glu,0.66,Phe,0.77,Gln,0.67,沉降平衡法测蛋白质,的分子量,沉降平衡法,利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较低离,心转速下进行的（,8000,20000r/min,），离心开始,时，分子颗粒发生沉降，一段时间以后，沉降的结,果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩,散运动，当反向扩散与离心沉降达到平衡时，浓度,梯度就固定不变了。,沉降平衡法,在离心力作用下，蛋白质颗粒的沉降速度为,dx/dt,，在此沉降速度下，时间,t,内浓度为,c,的溶液越,过横截面,A,的溶质量为,dt,dt,dx,cA,dm,?,因扩散作用沿相反方向越过横截面,A,的溶质量为,dt,dx,dc,DA,m,d,?,?,?,沉降平衡法,当达到平衡时,，,0,?,?,?,m,d,dm,dt,dx,dc,DA,dt,dt,dx,cA,?,dx,dc,D,dt,dx,c,?,将,和,代入上式得,x,v,f,m,dt,dx,p,2,),1,(,?,?,?,?,Nf,RT,D,?,dx,dc,Nf,RT,x,v,f,m,c,p,?,?,?,2,),1,(,?,?,xdx,c,dc,RT,v,N,m,p,?,?,2,),1,(,?,?,2,2,2,1,ln,),1,(,dx,c,d,RT,v,M,r,?,?,?,?,，,，,2,2,ln,),1,(,2,dx,c,d,v,RT,M,r,?,?,?,?,沉降平衡法,积分并代入积分限得,),(,),/,ln(,),1,(,2,2,1,2,2,1,2,2,x,x,c,c,v,RT,M,r,?,?,?,?,?,式中，,c,1,c,2,是距离旋转轴心,x,1,x,2,处的蛋白质,浓度，通过离心机上的光学系统可以测出这两个数,据。将各种数据代入上式可计算出蛋白质的分子量。,三、蛋白质的胶体性质与,蛋白质的沉淀,蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质颗粒是分,散相，水是分散介质。根据分散相的分散程度可以,把分散系统分为,3,类：分散相质点小于,1nm,的为真,溶液；大于,100nm,的为悬浊液；介于,1,100nm,之间,的为胶体溶液。,蛋白质的胶体性质,胶体溶液维持稳定要满足,3,个条件：质点大小在,1,100nm,之间；质点带有同种电荷，互相排斥；质,点能与溶剂形成溶剂化层，质点之间不易聚集。一,般情况下，蛋白质溶液满足这些条件。蛋白质溶液,也和其它胶体系统一样，具有丁达尔效应、布朗运,动以及不能透过半透膜等性质。,蛋白质的沉淀,当破坏蛋白质溶液的稳定条件时，蛋白质会发,生沉淀。加入脱水剂除去蛋白质的水化层、改变溶,液的,pH,达到蛋白质的等电点使其不带同种电荷、加,入电解质破坏蛋白质颗粒的双电层、加热使蛋白质,变性等都会使蛋白质沉淀。,蛋白质的沉淀,1,盐析法,（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）,2,有机溶剂沉淀法,（甲醇、乙醇、丙酮等）,3,重金属盐沉淀法,（,Hg,2+,、,Pb,2+,、,Cu,2+,、,Ag,+,等）,4,生物碱试剂和某些酸类沉淀法,（鞣酸、苦味酸、,钨酸、,KI,等，三氯醋酸、磺基水杨酸、硝酸等）,5,加热变性沉淀,(,少量盐类促进蛋白质加热凝固,),四、蛋白质分离纯化,的一般原则,1,前处理,：先尽量除去不必要组织和部分，破碎,细胞使蛋白质释放出来，加提取液溶解出蛋白质，,离心得到粗提液。若要提取某细胞器中的蛋白质，,也可通过差速离心先得到细胞器，再提取。,2,粗分级分离,：沉淀法、超滤法。,3,纯化,：运用各种方法除去杂质。,不同离心场下沉降的细胞组分,相对离心场,(g),时间,(min),沉降的组分,1,000,5,真核细胞,4,000,10,叶绿体、细胞碎片、细胞核,15,000,20,线粒体、细菌,30,000,30,溶酶体、细菌细胞碎片,100,000,310h,核糖体,五、蛋白质的分离纯化方法,根据分子大小不同的纯化方法,透析（,dialysis,）和超滤（,ultrafiltration,）,透析,超滤,磁力搅拌器,搅拌子,透析液,装有蛋白溶液的透析袋,根据分子大小不同的纯化方法,（密度梯度离心）,常用于生成密度梯度,的介质是蔗糖、聚蔗,糖（,Ficoll,），分离核,酸时还常用,CsCl,作为,介质。,柱,层,析,装,置,图,层析介质,（固定相）,蛋白质样品,流出液,洗脱液,（流动相）,多孔支持板,分离的蛋白质,根据分子大小不同的纯化方法,凝胶过滤的介质：它们都是化学惰性较强的凝,胶珠，内部是网孔，不同规格的介质有不同大小的,网孔，用于分离不同分子量范围的蛋白质。目前常,用的介质有交联葡聚糖（,Sephadex,G,）、聚丙烯酰,胺凝胶（,Bio-Gel,P,）、琼脂糖（,Sepharose,或,Bio-,Gel,A,）等。,（凝胶过滤层析）,凝胶过滤层析的原理,凝胶过滤层析的洗脱曲线,凝,胶,过,滤,法,测,蛋,白,质,的,分,子,量,利用溶解度差别的纯化方法,(,等电点沉淀,),当把,pH,调到目的蛋白的等电点时，目的蛋,白就会沉淀出来。这样沉淀出来的蛋白质保持,着天然构象，能重新溶解于具有适当,pH,和一定,浓度的缓冲液中。,pH,和离子强度对,乳球蛋白,溶解度的影响,随着离子强,度的增加，溶,解度增加。,（盐溶作用）,在,pH5.2,5.4,溶解度最小。,利用溶解度差别的纯化方法,(,盐溶和盐析,),盐溶作用主要是蛋白质分子吸附了盐离子后，,带电层使蛋白质分子互相排斥，而蛋白质分子与水,的相互作用增加，因而溶解度增加。,当盐浓度更高时，盐离子夺取蛋白质的水化层,中的水，破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质分子,聚集沉淀。,同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用比单价,离子更强。,在等电点时中性盐对一氧化碳,血红蛋白溶解度的影响,K,2,SO,4,?,?,i,i,i,Z,c,I,2,2,1,利用溶解度差别的纯化方法,（有机溶剂分级分离法）,常用丙酮作为沉淀蛋白质的溶剂，不同浓度的,有机溶剂可以沉淀不同种类的蛋白质，沉淀某种蛋,白质所需的有机溶剂浓度受温度、,pH,、离子强度,的影响。,根据电荷不同的纯化方法,(,电泳,),带电颗粒在电场中将向与其电性相反的电极移,动，这种现象称为电泳。带电颗粒在电场中泳动时，,将受到两种方向相反的力的作用。,S,U,q,qE,F,?,?,),(,电场力,v,f,F,f,?,),(,摩擦力,式中，,q,为颗粒所带的电量，,E,为电场强度，,U,为,两,极,间,的,电,势,差,（,V,）,，,S,为,两,极,间,的,距,离,（,cm,）,，,f,为,摩,擦,系,数,，,v,为,颗,粒,的,泳,动,速,度,（,cm/s,）。其中摩擦系数与颗粒的形状、大小及介,质的粘度有关。,根据电荷不同的纯化方法,(,电泳）,当颗粒以恒定速度泳动时，受到的电场力与摩,擦力大小相等，方向相反。即,v,f,qE,?,f,q,E,v,?,在一定的介质中，对于某一种蛋白质来说，,q,和,f,都是定值，因此,v/E,也是定值，它被称为电泳迁,移率。对于某一种蛋白质来说，电场越强，泳动速,度越快。另一方面，不同的蛋白质因,q,和,f,不同，在,同样的电场下泳动速度不同，经过一段时间的电泳,就互相分开了。,电泳的介质,?,自由界面电泳：在溶液中进行,?,区带电泳：有支持物，支持物可分为,4,类。,?,滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚,酰胺薄膜）；,?,粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉末,与适当溶剂调和，铺板）；,?,细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，这,是一类微量电泳；,?,凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺,凝胶和琼脂糖凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,以丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的凝胶,作为介质，凝胶中有网孔，通过改变配方可以控制,网孔的大小。不同的蛋白质分子带的电荷不同，受,到的电场力不同，再加上分子筛效应，不同大小和,形状的蛋白质在泳动时受到的阻力不同，使得分辨,率大大提高。,聚丙烯酰胺凝胶,丙烯酰胺,N,N,-,甲叉双,丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,平板电泳装置,水平式和垂直式平板凝胶电泳装置,平板电泳装置和蛋白质电泳,染色结果,圆盘电泳装置,圆盘电泳槽结构图,电泳结果,圆盘电泳槽,俯视图,毛细管电泳装置,毛细管电泳原理图,SDS-PAGE,测蛋白质的分子量,（,SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,）,十二烷基硫酸钠（,sodium,dodecyl,sulfate,SDS,）,是一种去垢剂（表面活性剂），它能与蛋白质结合，,使蛋白质变性，解离成亚基，并使蛋白质分子（或,亚基）带大量的负电荷，屏蔽了不同蛋白质原有的,电荷差异，使得不同蛋白质的电泳迁移率仅受分子,量的影响。,SDS-PAGE,测蛋白质的分子量,在一定的范围内，蛋白质的泳动距离与其分,子量的对数成反比。根据已知分子量的标准蛋白,质的泳动距离及其分子量的对数作出标准曲线，,再测出同样条件下待测分子量蛋白质的泳动距离，,可在标准曲线上查出其分子量。,SDS-PAGE,测蛋白质的分子量,等电聚焦,根据蛋白质的等电点不同而把它们分开。介质,中形成一个,pH,梯度，不同等电点的蛋白质最后都停,留在相应,pH,处。,pH,梯度的形成有固定梯度和电泳时,产生梯度两种，后者要在介质中加两性电解质。,两性电解质商品名为,ampholine,，它是脂肪族多,胺和多羧基类的同系物，它们具有相近但不相同的,pKa,和,pI,值。,等电聚焦,双,向,电,泳,第一向,等电聚焦,第二向,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（或无,SDS,）,大肠杆菌蛋白质,双向电泳染色结果,离子交换层析,离子交换剂（离子交换介质）是在惰性的基质,上结合有离子交换基团。常用的基质有纤维素、交,联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖等；离子交换基团,有阳离子和阴离子两种类型，其中又分为强阳性,（酸性）离子交换基团和弱阳性（酸性）离子交换,基团，及强阴性（碱性）离子交换基团和弱阴性,（碱性）离子交换基团。,阳离子交换介质,阴离子交换介质,离子交换层析,蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定,的,pH,下，蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷，,它们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换，,使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。,改变,pH,和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白,质洗脱下来。,离子交换层析,在一定的上样和洗脱条件下，因不同的蛋白质,分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不,同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱,的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达,到分离的目的。洗脱可分单一溶液洗脱、阶段洗脱,和梯度洗脱，既可以改变洗脱液的离子强度，也可,以改变,pH,，也可以两者同时改变。,离子交换结合洗脱原理,梯度混合器,K=V,M,/V,R,层析聚焦,用特种多缓冲液（,polybuffer,）淋洗层析柱中,的特种多缓冲交换剂（,polybuffer exchanger,），,就会在柱中产生一个由上而下的,pH,梯度。随着,pH,梯度向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗,脱下来。,利用选择性吸附的纯化方法,1,羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙,（,Ca,10,(PO,4,),6,(OH),2,），它能吸附蛋白质，加大离子,强度可将蛋白质洗脱下来。,2,疏水作用层析：疏水层析介质有丁基琼脂糖、,苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水,作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱,液将不同蛋白质分别洗脱下来。,利用对配体的特异生物学,亲和力的纯化方法,将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基质上，,在适当的条件下，将蛋白质混合物上样，目的蛋白,结合在柱中，而杂蛋白直接流出。经洗柱,(,washing,),后，换用能减弱目的蛋白与配体结合力的洗脱液，,将目的蛋白洗脱,(,eluting,),。,（亲和层析）,亲和层析原理,高效液相层析和快速,蛋白质液相层析,分离纯化的原理与柱层析相同，只是用全自,动的仪器操作，它们有更高的效率、更高的分辨,率和更快的过柱速度。,自动部分收集器,六、蛋白质的含量测定,与纯度鉴定,蛋白质含量测定,1,双缩脲法,双缩脲试剂：称取,1.5g,CuSO,4,5H,2,O,和,6g,酒石酸,钾钠溶于,500ml,水中，在不断搅拌下，加入,300ml,10%,NaOH,，稀释至,1000ml,。,3ml,蛋白质溶液加,2ml,双缩脲试剂，,540nm,比色。,2,紫外吸收法,280nm,比色，测定后蛋白质溶液还能回收。,蛋白质含量测定,3,Folin-,酚法（,Lowry,法）,蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与,Folin-,酚,试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，,500nm,比色测定。,Folin-,酚试剂的配制比较复杂。,4,BCA,法,蛋白质还原,Cu,2,+,成,Cu,+,，与,4,4,-,二羧基,-2,2,-,二,喹啉（,BCA,）形成配合物，显紫色，比色测定。,蛋白质含量测定,5,染料结合法,蛋白质能结合考马斯亮兰,G250,，显蓝色，,595nm,比色。,染色液的配制：考马斯亮兰,G250,100mg,，加,50ml,95%,乙醇（或甲醇）和,100ml,85%,磷酸，加,水至,1000ml,。,蛋白质含量测定,6,胶体金测定法,胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，根据颗粒,大小的不同呈现不同的颜色（从小到大，从桔红色,到紫红色）。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金,Au,）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面,的是内层负离子（,AuC1,2,），外层离子层,H,+,则分散,在胶体间溶液中。蛋白质分子可结合在胶体金颗粒,的外层，使胶体金的颜色转变成蓝色。,蛋白质纯度鉴定,各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，,末端氨基酸测定一种，溶解度曲线单转折点。,