肝癌原发灶及胆管癌栓样本差异基因表达谱的分析东方肝胆外课件.ppt
肝癌原发灶及胆管癌栓样本差异基因表达谱的分析东方肝胆外科医院胆道一科 谭蔚锋 罗祥基 姜小清,第六届中国肿瘤学术大会,现状 合并胆管癌栓（Bile duct tumor thrombi，BDT）的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)约占原发性肝癌病人总数的1.66%4.9%。据此推算，我国每年合并胆管癌栓的肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma with bile duct tumor thrombi，HCCBDT）的新发病例约为500015000人，因此，虽然HCCBDT发生率相对较低，但是罹患者的绝对数量较大。,第六届中国肿瘤学术大会,HCCBDT是HCC中的一种特殊类型，它具有很强的侵袭和转移能力，术后早期复发和转移率高，术后1年复发率高达50%，5年生存率在20%左右，总体预后差，该病疗效亟待改善。,第六届中国肿瘤学术大会,1.临床资料 4例原发性肝癌伴胆管癌栓患者，男性3例，女性1例，均经手术切除肝癌原发灶，并切开胆管取出癌栓。,材料和方法：,第六届中国肿瘤学术大会,2.实验方法 采用GIBCOBRC 公司Trizol试剂盒及其方法抽提肝(肝癌)组织总RNA，采用RNeaSy Mini试剂盒及其操作手册方法纯化RNA。核酸定量后，采用美国Agilent公司的Whole Human Genome Oligo Microarray芯片和有关试剂盒及其方法，样本RNA使用cy3荧光标记后检测肝癌原发灶和胆管癌栓样本中等量RNA的转录水平。,材料和方法：,第六届中国肿瘤学术大会,差异基因筛选：4组数据进行配对t检验，1-sample t-test。P-value2 or 0.5的基因为差异表达基因。我们定义fold change为胆管癌栓/癌原发灶，比值取2的对数后大于1为上调基因，比值小于1为下调基因。,材料和方法：,第六届中国肿瘤学术大会,与GeneBank比对，随机选择其中的差异表达基因，采用RT-PCR进行验证,材料和方法：,第六届中国肿瘤学术大会,结果：Agilent公司Whole Human Genome Oligo Microarray 芯片共捡测41000个人类基因，共筛选到150个差异表达基因（其中胆管癌栓样本中49个基因上调，101个基因下调，P0.05）。,散点图,第六届中国肿瘤学术大会,Gene Ontology分析 通过使用GO（Gene Ontology）分析方法结合国外文献相关报道，分别按照生物学过程（biological process)，细胞组分(cellular component)，分子功能(molecular function)三种独立的方式对这些差异基因进行分类。并发现生物学过程分类中，差异基因与developmental process,cell adhesion,defense response,inflammatory response,secretion；在细胞组分分类中，与extracellular region；在分子功能分类中，与carbohydrate binding,protein binding,transferase activity,transferring acyl groups,glycosaminoglycan（糖胺聚糖）binding显著相关，p0.05。这些结果提示我们差异表达基因可能通过影响细胞的粘附、炎症反应等具体生物学功能参与肝癌中胆管癌栓的发生发展过程。,GO分析,第六届中国肿瘤学术大会,差异表达基因分子互作网络 通过整合三种蛋白相互作用数据库的数据，建立了胆管癌栓中差异表达基因的相互关系网络图。150个差异表达基因通过两两之间的相互作用，共同组成了一个复杂的网络图。这一结果提示我们差异表达蛋白之间可能通过相互作用实现彼此之间的功能调节，同时还提示我们其中某些重要基因的表达可能具有至关重要的作用，具体的功能还需要进一步的分子生物学实验来证实。,差异表达基因分子互作网络,第六届中国肿瘤学术大会,部分RT-PCR验证结果,第六届中国肿瘤学术大会,部分RT-PCR验证结果,2010开题报告,部分重要差异基因的生物学功能,第六届中国肿瘤学术大会,与肿瘤转移关系非常密切的细胞外基质蛋白2（extracellular matrix protein 2，ECM2）在胆管癌栓样本中的表达水平明显低于原发灶样本（P=0.002）。一般认为，恶性肿瘤的侵蚀、转移是一个动态的、连续的过程。而胞外基质蛋白是肿瘤转移的重要组织屏障，与之相关基因的表达水平降低将会直接导致肿瘤细胞转移能力的增强。,讨论,第六届中国肿瘤学术大会,与分泌相关的基因白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的表达在胆管癌栓样本中的表达水平则较对照组发生了显著的升高（P=0.029）。LIF是一种抑制细胞分化的细胞因子，可以由许多细胞分泌，它的表达能使细胞处于一个相对去分化的状态。而这类去分化或未分化的肿瘤细胞对于肿瘤的增殖和转移又是必须的，,讨论,癌栓在胆管内并不具备良好的生长环境，一方面胆汁主要偏碱性，具有一定的腐蚀性，另一方面在胆管内缺乏充分的血供，在如此环境中，癌栓仍能保持较快速度的生长，说明癌栓具有较强的生存能力。本项研究发现：胆管癌栓样本中BAX基因的表达水平显著低于原发灶。蛋白凋亡家族成员Bcl2蛋白相关X蛋白（BCL2-associated X protein，BAX），它与BAK一起被认为是启动细胞凋亡的必需信号。,讨论,第六届中国肿瘤学术大会,另外，胆管癌栓中锚蛋白重复域11(Ankyrin repeat domain 11,ANKRD11)表达水平均较原发灶显著下降（P=0.028），最新的研究表明ANKRD11与抑癌基因P53为共激活因子。这些基因表达水平的改变提示癌栓肿瘤细胞有可能通过抑制自身凋亡来适应胆管内的碱性环境并维持增殖。,讨论,2010年工作计划,谢谢,
