SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进毕业论文.doc

编号： 2011届本科毕业论文（设计）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进 学 院 生 命 科 学 学 院 专 业 生 物 科 学 学 号 200740810235 姓名 指导教师 职称 副教授 完成日期 2011 年 5 月 诚 信 承 诺我谨在此承诺：本人所写的毕业论文SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了注释，若有不实，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年 月 日目录摘 要1关键词1ABSTRACT1KEYWORDS1引言11. 材料与方法21.1 实验材料21.1.1 试剂21.1.2 主要仪器、设备21.2 实验方法21.2.1 溶液的配制21.2.2 制胶31.2.3 电泳41.2.4 染色51.2.4.1 传统考马斯亮蓝染色法51.2.4.2 水浴加热法51.2.4.3 微波炉加热法51.2.5 染色结果观察62. 结果与分析62.1 染色效果与操作的简便性62.2 不同染色方法凝胶成像结果72.3 染色时间73结论与讨论8参考文献8致 谢10SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进 摘 要：针对传统的SDS- PAGE染色法耗时长，脱色所用甲醇有毒，乙醇会同时把考马斯亮蓝颜色脱去，使蛋白质条带不清晰等问题，对常染法进行了改进。本文用水浴或微波加热处理，同时改变染色液和脱色液成分，用乙醇、蒸馏水代替甲醇，大大缩短了染脱时间，经过比较，认为改进后的水浴法所耗时间大大缩短，染色效果也较好。关键词：SDS- PAGE；考马斯亮蓝；水浴法；染色；脱色A Modified Method for SDS-PAGE Staining Abstract: For the traditional SDS-PAGE time-consuming staining, Coomassie brilliant blue colorcan be taken off by the ethanol used for bleaching, methanol is toxic,the protein bands is not clear, and other issues,an improved method for the common dyeing is coming.By using a water bath or microwave heat treatment, at the same time changing the composition of dyeing and bleaching liquid,ethanol,distilled water instead of methanol,reducing the time of dyeing off greatly.By comparision,that the bathing method improved reduces the time significantly, dyeing better.Keywords：SDS- PAGE；coomassie brilliant blue；water bathing ；staining； decolorization引言继人类基因组计划之后，蛋白质组学已经成为21世纪生命科学研究的热点，对蛋白质高分辨率的分离和准确鉴定变得至关重要。目前分离蛋白质的主要方法之一就是采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS- Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS- PAGE），它的支持介质是三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。在催化剂的作用下，单体丙烯酰胺（acrylamide，Acr）与N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide，交联剂 ，Bis）发生聚合反应，生成凝胶介质。由于不同蛋白质分子大小和所带电荷的不同，从而对蛋白质进行分离，而分离后的电泳凝胶检测的染色方法也有多种，其中考马斯亮蓝染色法由于具有很强的特异性、较少的干扰因素、操作简便等优点，而成为蛋白质电泳检测和定量分析的一种常用方法。常用的考马斯亮蓝有G-250，R350，和R-250三种，在游离状态下，考马斯亮蓝G-250为红色，其最大吸收值为488 nm；而它与蛋白质结合后颜色由红色变为青色，在595 nm 波长下二者的结合物光吸收最大，光吸收值和蛋白质的含量成正比关系，所以可用于蛋白质的定量测定1。考马斯亮蓝G-250是快染，能与蛋白质迅速进行结合反应，约2 min 即可达到平衡；它们的结合物在室温下1 h 内保持稳定。一般情况下传统考马斯亮蓝染色法染脱时间较长，约 6 24 h2 ，同时在多次漂洗、换液的过程中，凝胶表面容易被污染3，而且凝胶中的SDS会干扰考马斯亮蓝和蛋白质的结合，使染色效果受到影响。同时常染所用的甲醇易挥发，在人体代谢作用下会转化为甲酸，进而在人眼睛部位积累，对视神经细胞进行破坏，危害操作者健康4。本文采用考马斯亮蓝G-250进行染色，通过水浴和微波热处理法，对传统的考马斯亮蓝染色法进行改进，以期达到大大缩短凝胶染色、脱色时间，从而使操作更简便，所用试剂更少，成本更低，更有利于操作者的健康的目的。 1. 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 试剂 浓硫酸，甘油，巯基乙醇，N,N,N,N四甲基乙二胺（TEMED），浓缩胶缓冲液（1 M的Tris-HCl pH 6.8），无水乙醇，冰乙酸，双蒸水，牛血清白蛋白（68 kb），考马斯亮蓝G-250，丙烯酰胺，N,N-甲叉双丙烯酰胺，溴酚蓝，十二烷基磺酸钠(SDS)，甘氨酸，Tris碱，过硫酸胺。1.1.2 主要仪器、设备 直流稳压电源，水平脱色摇床（太仓科技器材厂），移液枪，垂直电泳槽，凝胶成像分析仪（金西盟北京仪器有限公司），pH计，量筒，烧杯，容量瓶，电子天平（奥豪斯仪器上海公司），低温冰箱(合肥美菱有限公司)，双蒸水蒸馏器，灌胶支架，电磁炉（九阳股份有限公司），水浴锅，微波炉等。1.2 实验方法1.2.1 溶液的配制51.2.1.1 30 %的丙烯酰胺 用电子天平分别称取丙烯酰胺29.2 g，N,N亚甲基双丙烯酰胺0.8 g，用60L热的双蒸水溶解，过滤，定容到100 L。（由于未聚合的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，操作均须戴口罩手套，并在通风处进行，保存于棕色瓶中，4 存放。）1.2.1.2 10%十二烷基硫酸钠（SDS） 用电子天平称取10 gSDS粉末，于90 mL双蒸水中加热至68 溶解，定容至100 mL，室温保存。1.2.1.3 10 %过硫酸胺（AP）称取0.5 g过硫酸铵于5 mL双蒸水中溶解，4保存（需新鲜配制）。1.2.1.4 分离胶缓冲液（1.5 M的Tris-HCl pH 8.8） 用电子天平称取18.16 gTris粉末，于80 mL双蒸水中溶解，pH计测量并用浓盐酸调节pH至8.8，后定容至100 mL，4 保存。1.2.1.5 Tris-甘氨酸5 X电泳缓冲液分别用电子天平称取6.0 gTris粉末和28.8 g甘氨酸，用900 mL双蒸水溶解，再加入1 gSDS，用容量瓶定容至1000 mL。1.2.1.6 5 X上样缓冲液 分别量取0.6 mL 1M Tris-HCl pH6.8缓冲液，5 mL 50%的甘油，2 mL 10 %的SDS，0.5 mL巯基乙醇，1 mL 1 %溴酚蓝，0.9 mL双蒸水，混合，4保存待用。1.2.1.7 蛋白质原液的配制 称取0.1 g的牛血清白蛋白，于100 mL双蒸水中溶解，即为1000 g/mL的蛋白质原液。1.2.2 制胶61.2.2.1 确定所要配制分离胶的浓度和体积。 表1 SDS-PAGE凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%）1512.5107.55.0蛋白质线性分离范围（ kDa）15-43515-60 18-75 30-120 60-212 由于实验所用标准蛋白的分子量为68 kb，并结合其他文献综合考虑应选择浓度为10 %的分离胶。先用洗涤剂分别把玻璃板，样品梳，Space洗净，双蒸水冲洗几次，吹风机吹干。 把Space安装到制胶架上，按要求用制胶模安装并固定好玻璃板(两边均匀用力)，插入梳子后，在距齿底约1 cm的地方用记号笔做个标记，去除加样梳，以有利于目测分离胶灌制的大致位置。1.2.2.2 配制8 ml 10 %的分离胶。表2 分离胶的配制比双蒸水1 MTris-HCl pH 8.8缓冲液30 %Acr-Bis10 %SDS10 %AP10 %TEMED 3.0 mL2.1 mL2.8 mL80 L56 L6 L TEMED为加速剂应最后加入，烧杯中迅速混合均匀后，向玻璃板间一次性缓缓灌制分离胶到标记处，并立即沿玻璃壁来回移动注入一层双蒸水，水封，以排空气7。约20 min后在分离胶和水层间出现一清晰界面，即表明胶已聚合5。1.2.2.3 待分离胶聚合完全后，倒去上层双蒸水，并用滤纸吸干。再配制3.0 mL 6%的浓缩胶。表3 浓缩胶的配制比双蒸水1 MTris-HCl pH 6.8缓冲液30 %Acr-Bis10 %SDS10 %AP10 %TEMED2.0 mL400 L600 L36 L24 L4 L加入AP和TEMED后，迅速混合，将浓缩胶灌制到分离胶上，接近矮板顶端，立即平行插入样品梳，避免气泡，放置30 min-1 h，待胶充分聚合并老化。1.2.3 电泳1.2.3.1 装好模板（矮板于内侧），把胶条去掉并装入电泳槽中，拔出加样梳，用电泳缓冲液冲洗加样孔。将Tris-甘氨酸电泳缓冲液用双蒸水稀释5倍，加到电泳槽中，胶膜内侧液面不可超过高板，但要没过矮板。1.2.3.2 加样 （1）分别取不同浓度梯度（0.001，0.002，0.004，0.006，0.008，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/L）的蛋白质样品原液20 L与5 L 5 X样品缓冲液于离心管中混合，标记，用电磁炉沸水浴加热处理5-10 min，用移液枪进行点样，每个点样孔的上样量为5 L。（2）取相同浓度蛋白质样品原液20 L与5 L5X样品缓冲液于离心管中混合，加热处理5-10 min，进行点样，每个点样孔的上样量为5 L。1.2.3.3 电泳 连接直流稳压电源，打开电源开关，设定浓缩胶电压为75 V，时间50 min，待溴酚蓝进入分离胶后电压改为150 V，时间1 h。1.2.3.4 电泳结束后，关闭电源，取出凝胶模，用铲子小心撬开玻璃板一侧，凝胶便贴在其中一块板上，去除浓缩胶，并切去分离胶一角做标记，取下分离胶于容器中，以待染色。1.2.4 染色1.2.4.1 传统考马斯亮蓝染色法1（1）固定 将电泳后的凝胶浸泡于200 mL固定液（40 %甲醇，10 %乙酸，用双蒸水定容）中，于脱色摇床上轻微震荡30 min，以充分固定。（2）放大 将固定后的凝胶浸泡在200 mL 10%的乙酸溶液中，摇床上震荡20 min。（3）染色 把凝胶浸泡在考马斯亮蓝G-250染液（0.1 g考马斯亮蓝G-250溶解于200 mL固定液中）中摇床上染色2 h。（4）脱色 弃去染液（可收集回收利用），取出胶并在双蒸水中漂洗数次，室温下用200 mL脱色液(10 %甲醇，10 %乙酸，双蒸水定容)，于脱色摇床上震荡脱色3-4 h，其间换液2-3次，直至背景清晰。1.2.4.2 水浴加热法（1）电泳后先把胶置于200 mL双蒸水中，煮沸，于脱色摇床上摇几分钟冷却。（2）弃去水立即把凝胶放入热染液中（含染料、乙醇、乙酸），脱色摇床上进行染色20 min。（3）弃去染液后，把胶于沸水浴中脱色两次，再用200 mL脱色液（10 %乙酸溶液）常温脱色10 min，效果更好（染色脱色过程中可在容器上加一层薄膜，以免试剂挥发太快，影响染色效果）。1.2.4.3 微波炉加热法 （1）不经固定液固定，电泳后直接把胶浸于200 mL双蒸水中，用微波炉强火加热3 min，稍微冷却后再重复一次。（2）把胶没于20 0 mL染液中，不含甲醇和冰醋酸，只加考马斯亮蓝和双蒸水，微波炉中加热3 min，加快染色。（3）先用双蒸水把多余的染液洗去，再把凝胶置于200 mL双蒸水中，微波炉加热3 min，冷却后即完成脱色，暂时保存于纯水中。1.2.5 染色结果观察 把不同染色方法的凝胶转移至凝胶成像分析仪中，打开电源开关，选择白光，底座换为白板，调节光线和焦距，直至能清楚看到蛋白质条带，拍照并保存记录。2. 结果与分析2.1 染色效果与操作的简便性图1 三种染色方法的结果注：蛋白质上样量均为5 g/ 孔;A. 传统考马斯亮蓝染色; B. 水浴常染结合法; C. 微波炉加热法由图可知，水浴热染法较传统染色法条带更为清晰，微波炉加热法背景色太重，不容易彻底脱去，不易观察，且容易损坏胶片。另外，传统染色法脱色所使用的乙醇有可能会同时把考马斯亮蓝的颜色脱掉，从而使蛋白质条带不清楚，而水浴和微波法只使用冰乙酸脱色，操作更简便，更安全。2.2 不同染色方法凝胶成像结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 图2 3种染色方法的灵敏度检测注：1-10号蛋白质上样量依次为：0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/ 孔;A. 传统考马斯亮蓝染色; B. 水浴常染结合法; C. 微波炉加热法定量牛血清白蛋白加热变性后电泳，分别用三种不同的染色方法：传统考马斯亮蓝染色、水浴常染结合法、微波炉加热法对三块平行的凝胶进行染色，比较三者的灵敏度。由图中可知，三种方法的灵敏度差异不大，其中水浴法蛋白质测定的灵敏度都为0.1 g / 孔。2.3 染色时间 表4 不同染色方法所用时间比较 时间 （min）方法固定和放大染色脱色总时间传统染色法水浴加热法微波热染法5059120203至少1801533504015 由表可知，传统考马斯亮蓝染色法所耗时间长达6 h，甚至需要进行过夜脱色；而水浴和微波加热法大大缩短了染脱时间，水浴法总消耗时间40 min，其5 min沸水浴脱色效果和传统染色的过夜脱色相当；微波加热法更短达15 min，所用试剂也较少，可循环使用。3结论与讨论高温有利于促进分子的自由扩散运动，加速试剂向凝胶中扩散和渗透。同时由于SDS 对热不稳定，在80 以下才相对稳定8，通过水浴或微波热处理，使SDS-PAGE凝胶的温度达到100 ，从而分解了SDS ，解除了SDS 对考马斯亮蓝染色的扼制，使考马斯亮蓝染色得以顺利进行9；加热使蛋白质被快速固定，大大节省了固定和染色时间，降低了凝胶被污染的机会；同时由于不使用甲醇，降低了成本，也有利于操作者的身体健康。水浴考马斯亮蓝染色法检测的蛋白质灵敏度为0.1 g / 孔。水浴法中固定和染色的时间可由传统考马斯亮蓝染色法的3 h缩短为25 min，微波加热法则在10 min左右，但微波炉加热法凝胶背景色较深，且容易损坏胶片，不容易把握，适用于蛋白质的快速分离。所以，总体上水浴法操作更简便快捷，效果更好，可用于蛋白质的测定。参考文献1. BradfordMM. A rap id and sensitive method for the quantitation of microgram quantifies of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal Biochem, 1976, 7: 2482254.2. CHEN C Q, BELANGER R R, BENHAMOU N, et al. Defence enzymes induced in cucumber roots by treatment with plant growth-promoting rhizobacteria and Pythium aphanidermatumJ. Physiol Mol Plant Pathol, 2000, 56: 13-23.3. 崔艳丽，王生余， 张真. 微波技术在尿蛋白谱检测中的应用J. 现代检验医学杂志，2002,17:35-36.4. 谢克昌. 甲醇及其衍生物M . 北京:化学工业出版社, 2002-06. 5. 汪家政，范明. 蛋白质技术手册M . 北京:科学出版社. 2000.6. 李林，张悦红. 生物化学与分子生物学实验教程. 北京:化学工业出版社,2007.7. Merril C R. Gel staining techniquesJ . Methods Enzymol ,1990 ,182 :477 - 488.8. 国家技术监督局. 十二烷基硫酸钠( GB/ T15963 -1995) S . 北京:中国标准出版社,1996-08-019. 叶长青. SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进. 湖北工业大学学报.2009，24:16-18. 致 谢在毕业论文即将完成之际，收获颇多，感触良深。论文完成的背后离不开可爱的亲们的支持和帮助。首先我要感谢我的指导老师姬云涛老师，姬老师严谨细致、一丝不苟的作风是我在人生路上的榜样。她在论文的选题以及实验方面给予了我无私的帮助，在忙碌的教学工作中抽出时间来审查我的论文，指出其中的不足，并不耐其烦的指导我进行论文的修改，在此特向姬老师表示我由衷的感谢；其次感谢屈长青老师，刘小丽和杨京霞老师，谢谢你们在实验过程中诸多方面给予我的指导，教会我科学的严谨态度和永不言弃的精神；也要感谢二楼和我一起做实验的“战友们”，我们一起走过大学最后的日子，在一次次“预实验”的失败之后，我们不断完善着自己，虽然忙碌但却很快乐；同时还要感谢07级生科二班的兄弟姐妹们，谢谢你们曾经给予我的关心和帮助，我们满怀希望，我们一腔热情，我们是一个可爱的大家庭。在这到处充溢着感伤的季节，在这离别的时刻，我心中满是不舍，但我想说“海内存知己，天涯若比邻”，我们不曾离开！还有我宿舍的姐妹们，感谢你们大学四年的帮助，在我最悲伤的时候安慰我，在我最无助的时候支持我，快乐的时候我们一起疯狂，烦恼的时候我们一块分担，是你们给了我温暖，让我感受到“家”的温馨；最后要我要感谢我亲爱的父母，感谢你们的养育之恩，你们是我力量的源泉，永恒的动力！ 大学四年即将结束，回头望去，有欢笑，有泪水，有遗憾，有感动我们一起携手走过这最为可贵的四年，最为难忘的四年。曾经，我们年少轻狂；现在，我们日渐成熟，我们都在经历华丽的“蜕变”。大学，虽然不尽完美，但却让我们学会更加珍惜，学会勇于追求自己想要的生活！