LSPR生物传感器的制备与测试硕士论文.doc

中图分类号：学校代码：10055UDC：密级：公开硕 士 学 位 论 文LSPR生物传感器的制备与测试The Preparation and Testing of Localized Surface Plasmon Resonance Phenomena Biosensor论文作者 指导教师 申请学位 工学硕士 培养单位 信息技术科学学院 学科专业 电路与系统 研究方向 传感技术与智能系统 答辩委员会主席 评 阅 人 南开大学研究生院二一一年五月南开大学学位论文使用授权书根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：(1)学位获得者必须按规定提交学位论文(包括纸质印刷本及电子版)，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；(2)为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；(3)根据教育部有关规定，南开大学向教育部指定单位提交公开的学位论文；(4)学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学术期刊(光盘)电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。论文电子版提交至校图书馆网站：http:/202.113.20.161:8001/index.htm。本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。作者暨授权人签字： 年 月 日南开大学研究生学位论文作者信息论文题目姓名学号答辩日期年 月 日论文类别博士 学历硕士 硕士专业学位 高校教师 同等学力硕士院/系/所专业联系电话Email通信地址(邮编)：备注：是否批准为非公开论文注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写(一式两份)签字后交校图书馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名： 年 月 日非公开学位论文标注说明(本页表中填写内容须打印)根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明为空白。论文题目 申请密级限制(2年) 秘密(10年) 机密(20年)保密期限20 年 月 日至20 年 月 日 审批表编号批准日期20 年 月 日南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效)注：限制2年(可少于2年);秘密10年(可少于10年);机密20年(可少于20年)摘要近年来，金纳米材料因为其本身所具有的独特的光学、电磁学以及力学特性而被人们广泛关注。而对金纳米颗粒的局部等离子共振特性（LSPR）的研究更是成为在很多研究领域中的重中之重。本论文主要研究了金纳米颗粒的制作、组装、修饰以及检测。在此基础上，对金纳米颗粒的局部表面等离子共振（LSPR）特性进行了分析。本论文的具体工作主要包括以下几个方面：（1） 总结了金纳米颗粒特性以及LSPR的基本原理；通过阅读大量的文献，总结和概括了现有的制备金纳米颗粒的方法，分析了各自的特点。（2） 我们采用了柠檬酸钠还原法制备了球形的金纳米颗粒溶液，并在玻璃片上进行组装，通过紫外-可见分光光度计，TEM和AFM的测量来比较金纳米颗粒的各项性能指标，以此来研究金纳米颗粒的特性。（3） 我们通过对金纳米颗粒进行蛋白修饰来研究金纳米颗粒表面覆盖多层膜的光谱特性，以及蛋白修饰后的金纳米颗粒对周围环境折射率变化的灵敏度。在这篇论文中我们通过调节柠檬酸钠与氯金酸的摩尔比可以控制金纳米颗粒的尺寸大小，制备了多种尺寸的金纳米颗粒；同时根据我们对金纳米颗粒的消光光谱分析以及对周围环境折射率变化产生的光谱变化的研究发现，当金纳米颗粒尺寸大约为33nm时，对周围环境折射率的变化灵敏度是最高的；同时我们实现了对金纳米颗粒的蛋白修饰，并测量得出其对周围环境折射率变化的灵敏度为103nm，相关结论对LSPR生物传感器的进一步研究具有参考意义。关键词：金纳米颗粒 局部表面等离子共振 柠檬酸钠还原法 消光光谱 蛋白修饰AbstractDue to its own unique optical, electromagnetic and mechanical properties，gold nanomaterial has drawn extensive attention in recent years. The study of gold nanoparticles on localized surface plasmon resonance（LSPR）is the priority among priorities in many research fields. In this paper, most research is put on the producing, assembly, modification and testing of gold nanoparticles. On that basis, we make a further study of LSPR.Specific work of this paper includes the following aspects:(1) Summary of the characteristics of gold nanoparticles and the basic principles of the LSPR; By reading a large number of references, this paper summarizes the existing methods of producing gold nanoparticles, and gives an analysis of their own characteristics.(2) We produce the solution of spherical gold nanoparticles, using sodium citrate reduction method and assemble it on glass. UV-visible spectrophotometer, measurements of TEM and AFM are used to compare its performances in order to study the characteristics of gold nanoparticles(3) Through the protein modification of gold nanoparticles, we study the spectral properties of multilayer films on their surfaces, as well as the sensitivity of proteins modified gold nanoparticles to the refractive index changes of the surrounding environments In this paper we can control the size of gold nanoparticles and produce a variety of sizes of gold nanoparticles by adjusting the molar ratio of Sodium citrate and chloroauric acid. Basing on our extinction spectrum analysis of gold nanoparticles and the Spectral changes according to refractive index changes of the surrounding environment, we find that when the gold particle size is about 33nm, it has the highest sensitivity to the changes of the refractive index to the surrounding environment; At the same time we realize the protein modification of gold nanoparticles and obtained from the measurement that its sensitivity to changes of the refractive index to surrounding environment is 103nm. These results offer references for advanced research on LSPR biosensor.Key words: Gold nanoparticles, Localized surface plasmon resonance, Citrate reduction, Extinction spectra, Protein modification目 录第一章 绪论1第一节 金纳米材料11.1.1 金纳米材料的历史11.1.2 金纳米的定义31.1.3 金纳米颗粒的特性4第二节 局部表面等离子共振(LSPR)71.2.1 LSPR的原理81.2.2 LSPR理论模型91.2.3 LSPR与SPR的比较10第三节 本论文的主要研究目的及内容11第二章 金纳米颗粒的制备12第一节 物理方法122.1.1 真空蒸镀法122.1.2 软着陆法122.1.3 激光消融法132.1.4 光刻技术142.1.4.1 电子束刻饰技术142.1.4.2 纳米球光刻技术142.1.4.3 纳米压印光刻技术152.1.4.4 胶体光刻技术16第二节 化学方法172.2.1 柠檬酸钠还原法172.2.2 晶种法172.2.3 相转移法182.2.4 胶束与反胶束法20第三节 物理辅助方法20第三章 柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒22第一节 柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒223.1.1 试剂和仪器223.1.2 制备过程23第二节 对金纳米颗粒溶液的研究243.2.1 对金纳米颗粒溶液的TEM图的研究253.2.2 对金纳米颗粒溶液消光光谱的研究27第三节 金纳米颗粒在玻璃片上的组装29第四节 对组装在玻璃片上的金纳米颗粒的研究303.4.1 对同一尺寸、不同浓度的金纳米颗粒进行组装的研究303.4.2 对不同尺寸的金纳米颗粒进行组装的研究323.4.3 金纳米颗粒组装后在不同溶液中的研究34第五节 本章小结40第四章 金纳米颗粒表面进行蛋白修饰41第一节 金纳米颗粒与巯基丙酸的结合414.1.1 实验过程414.1.2 测试与结果434.1.3 硼氢化钠还原法47第二节 金纳米颗粒的蛋白修饰484.2.1 金纳米颗粒蛋白修饰的实验过程484.2.2 实验检测与结论50第三节 本章小结53第五章 总结与展望54第一节 总结54第二节 展望55参考文献56致谢59个人简历60第一章 绪论近年来，纳米材料1-3因为它们所具有的独特的光学、电磁学以及力学特性而被广泛关注。而在纳米材料中，贵金属纳米颗粒在紫外-可见光区域产生一个很强的吸收带，这在绝大多数的金属纳米材料中是不会发生的。科学研究表明，贵金属纳米颗粒的这些特有性质取决于光的强烈程度，而对纳米颗粒光学领域的研究又使得我们对于材料的成分、尺寸、形状以及周围环境等等之间的关系有了更深层次的理解。对贵金属纳米颗粒的特有性质的研究在理论和实践上都具有非常重要的意义。从理论上讲，它对于系统研究纳米量级结构和引起光学性质变化的局部环境因素，以及预测结构的变化等等方面都十分重要；从实践上讲，纳米结构的光学性质如果可调试，则可以应用于表面增强光谱、光学滤波器、等离子体设备和传感器等领域。目前作为贵金属纳米颗粒的研究对象我们主要采用两种材料，那就是金和银。这两种贵金属纳米颗粒材料的光学特性在各方面都对我们的研究具有很大的吸引力。我们知道贵金属纳米颗粒，譬如说金和银，在可见光区域内都有很强的消光效果，通常被认定为局部表面等离子体共振（LSPR）现象。这种LSPR现象发生时，入射光子的频率与贵金属纳米颗粒或者传导电子的整体振动频率是基本上一致的。纳米量级的金和银颗粒在紫外可见光区域也同样表现出独特的光学响应，同时它们的消光效率也会随着光子能量的减少而呈指数衰减。在我们的研究过程中，因为金纳米颗粒是最稳定的贵金属溶胶之一，具有很多独特的与形貌尺寸特性相关的性质。近年来关于通过对金纳米颗粒进行功能团修饰来进行生物检测标记物的研究也是层出不穷，人们对金纳米颗粒在生物、医学等领域的应用的研究非常关注。因此在我们这篇论文中，我们选择贵金属金作为纳米材料研究对象来进行一系列的研究。第一节 金纳米材料1.1.1 金纳米材料的历史金的提取开始于公元前五千年的时候4，在大约公元前1200-1300年，当时埃及人在建造Touthankamon雕像时，提取量就已经达到了10吨每年，而且 “可溶性”金的出现是在埃及和中国。在古代，金被赋予了审美以及医疗目的这样的社会生态意义。胶体金曾经被用于制造红宝石玻璃以及用于陶瓷着色，这些应用到现在也仍在继续。最著名的例子就是公元前五世纪到四世纪建造的Lycurgus杯，它在传输光时颜色是宝石红，而在放射光时颜色则是绿色，这些都是因为金溶胶的缘故。直到中世纪，由于对各种疾病，如心脏病、性病、痢疾、癫痫、肿瘤以及对梅毒的诊断等都有着惊人的药效，可溶性金引起了人们的广泛关注，变得名声大振。这是在一本由哲学家和医学博士Francisci Antonii于1618年发行的著作里有详细描述，该书被认为是关于胶体金的第一著作。这本书在关于胶体金溶液的形成及其在医学上应用方面包括了可观的信息量，其中还包括成功的实例。1676年德国化学家Johann Kunckels出版了另一本书，这本书的第七章是关于“含有金属金的中性、淡紫色溶液中的可服用金对几种疾病有惊人的医疗效果”。他总结“金必须以肉眼看不到的形式存在” ，这在Michael Faraday前就已经描述的很充分了。在十七世纪流行的一种叫“Purple of Cassius”的玻璃着色剂就是由金颗粒和二氧化锡混杂凝聚制备的胶体。而关于胶体金的完整论述的著作则是在1718年由Hans Heinrich Helcher出版。在这篇论述中，这位哲学家和博士表明在可服用金的制备过程中加入煮过的淀粉会明显增加金颗粒的稳定性，此观点在18世纪已经形成共识，这在1769年的法国词典中就有指出。在“或者可饮用”的前面标明了“可服用金必须是以元素形式存在的，而不是以极端亚分离的形式悬浮在溶剂中”。1794年，Fuhlame女士在一本书中报道她用胶体金给丝绸染色。1818年，Jeremias Benjamin Richters给出了一个为什么在可服用金的制备过程中会有不同颜色的解释：粉色或紫红溶液所含的金是分散的、不团聚的最好尺寸，而黄色溶液则是颗粒已经聚集了的结果。在1857年，Farada报道了用磷在二硫化碳（CS2）中还原一种氯金酸盐的水成溶液得到深红色的胶体金溶液，这个实验非常的著名。他通过干燥胶体金溶液制备金薄膜并研究其光学特性，而且研究观察它的颜色变化。尽管在中世纪胶体金在医学上的主要应用是来诊断梅毒，这种方法一直用到二十世纪，但是这种方法并不是完全可靠的。在二十世纪，各种不同的制备金胶体的方法被报道和使用。尤其是在Schmid5,6和Brust7取得突破性进展之后，由于胶体金的基本原理和应用方面都与量子效应有关系，这一点在二十一世纪的文献中多半才被提到，因此胶体金这个课题更多地被集中研究。1.1.2 金纳米的定义在上一节中我们所提到的可服用的金就是指的金纳米颗粒，它是保存在溶液中的金纳米颗粒。金纳米颗粒是指直径在1-100nm之间的金材料。金纳米颗粒在溶液中并不是溶解在溶液中的，而是呈现出透明的悬浮状态，因此我们把金纳米溶液也称之为金纳米胶体。所谓胶体我们可以用以下实验来定义：如果将一把泥土放在水中，大颗粒的泥沙很快沉淀下去，浑浊的细小颗粒的泥土因受重力的影响最后也沉淀到容器底部，而泥土中的盐类物质则溶液成真溶液，但是混杂在真溶液中的还有一些极为微小的土壤颗粒，它们既不会沉淀，也不会溶解，人们就把这些即使在显微镜下也观察不到的微小颗粒称之为胶体颗粒。由于金纳米的尺寸、形状各不相同，折射和吸收峰不同，因此金纳米颗粒在溶液中的颜色也各不相同。根据金纳米颗粒的结构形态不同，我们可以把它分为以下几种类型：（1）零维材料 就是纳米颗粒的三维尺寸都在我们所规定的纳米尺寸内。包括球形（nanosphere）、三角形（nanotriangle）、纳米立方体(nanocube)以及纳米环(nanoring)等等。如图1.1所示：图1.1 几种零维纳米材料的形状（2）一维材料 就是纳米颗粒的三维尺寸有一个不在所规定的纳米范围内。比如说纳米棒（nanorods）和纳米线（nanowires）。当他们的长度大于100nm时就是一维的金纳米材料。如图1.2所示： 图1.2 一维纳米材料示意图，左边是纳米棒，右边是纳米线（3）二维材料 就是纳米颗粒的三维尺寸中有两个不在所规定的纳米尺寸范围内。比如纳米盘（nanoplate）。除了这些结构之外，再加上其他的空心结构以及核壳结构，综合起来，纳米颗粒的结构有以下这些种，如图1.3所示图1.3 各种纳米颗粒结构的示意图1.1.3 金纳米颗粒的特性金纳米颗粒有很多非常独特的性质，例如说局部等离子共振特性、表面增强拉曼散射特性、荧光特性、电化学特性和超分子与分子识别特性等等，下面我们就一一介绍下这几种特性。1.局部表面等离子共振特性（LSPR）局部表面等离子共振是由于入射光的电磁场引起的金纳米颗粒表面电子云的集体振动，当入射光的电磁场频率和金纳米颗粒表面电子云振动频率二者相一致的时侯，就会在波长520nm附近产生一个很宽的消光峰。这一特性的结果就是使得金纳米颗粒呈现不同的颜色，这一性质对我们将来的研究非常的重要。局部表面等离子共振特性是金纳米颗粒最重要的特性之一，对于此特性的研究无论对于科学研究，还是对于应用发展都有着极其重要的意义。局部表面等离子共振的原理在1908年被Mie理论8所解释。根据Mie理论和Maxwell-Garnett理论9,金纳米颗粒随着粒径的变化以及形状大小的变化，消光峰的位置和带宽都会相应的发生变化，基本上是随着尺寸的不断增大，消光峰会发生红移。当金纳米颗粒表面被修饰，其消光峰也会发生移动和峰形的变化，我们根据这些性质，就可以利用金纳米颗粒来检测一些生物指标，这个我们在接下来的论文中会做详细的介绍。2.表面增强拉曼散射10,11（SERS）金纳米颗粒除了可以产生局部表面等离子体共振（LSPR）之外，还能发生表面增强拉曼散射效应（SERS），两者是同时发生的，如图1.4所示：图1.4 受到光激发的时候，（a）LSPR和（b）SERS同时发生的示意图从图1.4中我们可以看到，当有入射光照射金纳米颗粒时，就会同时发生LSPR现象与SERS现象，我们需要用特殊的仪器来检测出SERS现象所产生的拉曼光谱。拉曼光谱(Raman spectroscopy)是用来表征分子振动能级的指纹光谱,它在很多领域的应用都是非常广泛的。拉曼光谱的优点很突出，譬如说我们已经知道的它有很高的光谱灵敏度以及非常好的空间分辨率。但是除此之外，拉曼光谱也有着很明显的缺陷就是它的散射截面极小，这样就很容易导致背景荧光经常会把它直接淹没。因此，利用一般的拉曼散射就无法去探测那些容易产生荧光和低浓度的生物样品。但是金纳米材料的拉曼散射非常强，比传统的拉曼散射要提高了大约1010个数量级，这就使得信噪比得到了很好的提高。下图就是一个表面增强拉曼的散射示意图，如图1.5所示：图1.5 表面增强拉曼的散射示意图目前，科学界公认SERS主要是由两种因素的共同作用形成的，一种是电磁场增强（EM机理），另一种是化学增强（CT机理）。EM机理的作用受到很多因素的影响，主要有纳米材料的种类、形状和尺寸等等。CT机理的作用受材料种类以及表面吸附的分子影响，而且在目前的研究领域中，我们一般可以忽略CT机理的作用；从另一方面我们也可以说EM机理对SERS的贡献远远超过CT机理的贡献。其实等离子共振可以产生电磁场增强效应，但这并不是唯一一种方法，根据金属椭球模型的计算，还有一种叫做避雷针的效应，它可以在一定范围内使的拉曼信号得到最大增强。这两者如果共同作用就会产生非常强大的电磁场增强效应。我们可以简单地理解，吸光后，首先产生LSPR，电子云震荡开始，相当于表面粗糙了，表面积增大，因此拉曼散射提高了很多倍。SERS的过程可以用图1.6来表示：图1.6 SERS过程图1.6 SERS过程如下：（1）激光入射在金属基底上；（2）产生LSPR现象；（3）散射开始；（4）一部分拉曼散射回到里面重新振荡，一部分散射到空气中；（5）得到拉曼散射信号。3.荧光特性目前对于金纳米颗粒荧光特性的研究在很多方面都已经展开了4,12,13。例如如果芘基、聚辛基苯硫基等探测体覆盖在金纳米颗粒周围时，当入射光照射时就会产生共振能量转移，从而引起荧光特性，这方面的研究目前深受人们的重视并引起了生物光子学和材料科学的广泛兴趣。金纳米的荧光特性与金纳米颗粒的尺寸和形状，以及跟金纳米颗粒自组装修饰的分子都有很大的关系，在很多研究领域人们已经利用这些关系设计了很多与现实生活相关的产品，例如光控开关等。4.其他特性除了以上我们所说的几种比较重要的特性之外，金纳米颗粒还包括很多其他特性4,14-17，比如说超分子和分子识别特性、电化学特性以及其他应用于很多方面的电子特性等等。这些特性之中对我们实验检测比较有帮助的就是超分子与分子识别特性，这一特性对现在的生物传感器以及医学检测领域都有着非常重要的意义。上面介绍了很多金纳米颗粒的特性，在我的论文中主要研究的就是金纳米颗粒的局部表面等离子共振特性（LSPR），这个性质作为金纳米颗粒最重要的特性之一，在很多方面有着广泛的应用。我们主要用LSPR来检测生化量，未来我们可能更多的会去研究和发展表面增强拉曼散射特性（SERS）和荧光特性。第二节 局部表面等离子共振(LSPR)LSPR现象18-21是贵金属纳米颗粒特性中最重要的特性之一，它主要发生在金属纳米颗粒表面。LSPR现象随着金属纳米颗粒的种类、形状以及大小等很多因素的不同会表现出非常独特的光学性质，而这些性质在传感器领域都具有得天独厚的优势，备受关注。下面我们就重点介绍一下贵金属纳米颗粒的局部表面等离子共振特性。1.2.1 LSPR的原理在介绍LSPR的原理之前，我们不得不先简单的介绍一下表面等离子共振（SPR）现象。SPR22是一种物理光学现象，我们知道当一束光从高折射率的介质中入射到低折射率的介质的界面时，如果入射角高于一个临界角时，就会产生全反射，入射光能量几乎全部发射回高折射率介质中。根据这一理论，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质表面（比如玻璃表面的金属镀层）时，金属表面的自由电子就会产生表面等离子振荡，这样就使得自由电子消耗了一部分入射光能量，从而使反射光强度在一定角度内大大减弱。我们称这种现象是表面等离子共振现象（SPR）。SPR随着表面折射率的变化而变化，而折射率的变化和结合在金属表面的生物分子质量成正比，这样我们就可以利用这个关系来检测生物分子。而局部表面等离子共振（LSPR）则与之有些不同。由于纳米颗粒具有大的比表面积，自由电子的运动往往受到颗粒边界的强烈影响，因而光学性质主要由表面自由电子的性质来决定。许多金属表面的自由电子都可以形象地看作电子云，电子云的集体激发称作等离子体，如果激发只局限在表面区域，就叫做局部表面等离子体。图1.7为球形金属纳米颗粒的局域表面等离子体共振示意图。当一束光照射在球形金属纳米颗粒上时，金属纳米颗粒里的传导自由电子就会在振荡电场的影响下产生移动，当电子云偏离原来的位置时，因为电子云带负电，原子核带正电，它们之间就会产生一个静电回复力，把电子云往回拉，这样就使得电子云相对于原子核做来回的振荡。当入射光的频率和金属内这个来回振荡频率相同时，就会产生共振，这种共振在宏观上就表现为金属纳米颗粒对光的吸收。这种现象我们就称之为局部表面等离子体共振，简称LSPR23。其共振频率与电子密度、电子有效质量、电子分布形状和大小等密切相关。图1.7 LSPR原理示意图从原理上我们可以看出，LSPR现象相当于离散的SPR现象，相当于SPR的现象不再是连续的了，而只是集中在单个的纳米颗粒上，因此LSPR的灵敏度不如SPR。1.2.2 LSPR理论模型最简单的纳米颗粒光学响应模型是Mie理论24-27，这是由G.Mie在1908年的时候提出来的，这也开辟了微粒对光散射和吸收作用的新方向，也描述了球形金属纳米颗粒的消光情况。具体形式如式1.1所示： （1.1）其中，E()为消光量，即吸收和散射的总和；NA是纳米颗粒的局部密度；a是金属纳米球体的半径；m是金属纳米球体周围介质的介电常数（假设为正实数，且与波长不相关）；是入射光波长，i是金属纳米球体介电常数的虚部；r是金属纳米球体介电常数的实部。容易看出，当分母中的共振项(r+2m)2接近零时，这就是发生LSPR共振的条件所在。从Mie理论的模型中可以看出，金属纳米球体颗粒的LSPR光谱特性与纳米颗粒的半径a、纳米颗粒材料（i和r）以及纳米颗粒周围介质的介电常数m这四个参数有关。更深一步的进行研究表明，如果纳米颗粒不是球体时（通常为实际情况），消光光谱将取决于纳米颗粒的直径、高度和形状。在这种情况下，分母中的共振项应写作其中是形状因子项，用来描述纳米颗粒形貌比例。5:1的纳米颗粒形貌比率所对应的的值随着二者（对于球体来说）同17的差值而增加。此外，很多样品为沉积在衬底表面的纳米颗粒集合。因此，LSPR还取决于颗粒间距和表面绝缘常数。从式(1.1)中还可以看出，贵金属纳米颗粒的最大消光位置高度取决于周围环境的电介质性质，并且纳米颗粒最大消光波长的移动能够被用于检测纳米颗粒周围由分子引起的变化。1.2.3 LSPR与SPR的比较经过很多的研究表明，现在基于LSPR的纳米生物传感器是SPR生物传感器的拓展和延伸28,29。而且现在因为在LSPR传感技术中采用了具有特殊光学性质的纳米颗粒，因此这种技术相对于SPR传感器技术，有着其独特的优势：1.由于LSPR的共振条件对温度不敏感，不需要额外添加温度控制系统，所以较以往的SPR传感器简单。2.不同形状的纳米颗粒所表现出来的敏感度不同，可以通过选用不同的纳米颗粒形状来配合检测系统中激发光源的波长，以此提高检测敏感度。3.几种纳米颗粒可以通过统一的光谱响应来检测，这样就可以将多种颗粒集成在一个芯片上，以达到对多种生化分子同时完成快速、实时检测。4.LSPR可以采用更简单的光路设计，更容易实现大规模的阵列式检测，大大提高了检测的效率；而且容易实现设备的小型化和低成本化。5.样品扩散至纳米颗粒表面会比扩散至连续膜层表面更快，可以加快分子之间的反应速率。由于LSPR中的消光现象是由于纳米颗粒对光的吸收作用和瑞利散射作用共同作用引起的，我们对LSPR的效果的实验就不需要像我们实现SPR（表面等离子体共振）那样，必须要有很多很复杂的实验装置。因此我们利用LSPR生物传感技术能够制作出体积小、系统设置简单和操作便捷的生物传感器，与传统的SPR生物传感器有很大的差别。我们通过总结和比较，总结出LSPR与SPR之间的区别和共同点。首先SPR与LSPR检测系统的检测方法就不同，SPR是根据共振角的偏移来测量最后的实验结果，而LSPR是根据消光光谱的消光峰的偏移来检测实验的结果。其次它们都是基于金属表面的等离子体共振对外界环境的影响来探测生物分子的特异性结合的，所以具有灵敏度高，无标记检测，实时性强等优点。相比于SPR的折射率灵敏度2×106nm/RIU，LSPR的折射率灵敏度低，为2×102nm/RIU。因为SPR的折射率灵敏度高，对温度的影响也不能忽略，所以一般需要温控的设备，增加了SPR检测系统的设计成本。再次SPR检测系统已经成熟，可规模化生产，其成本大约为$150,000-$300,000，而LSPR检测系统的成本为$5,000（多颗粒），$50,000（单颗粒），由于成本更低，而且不需要温控等设备，所以当研发条件成熟以后，可规模化生产，也有着很高的商业价值。最后由于LSPR是在单个纳米颗粒或者多个纳米颗粒的表面引起的共振反应，而SPR是在整个金属表面的共振反应，所以LSPR传感器的空间分辨率高，有更好的小分子灵敏性。第三节 本论文的主要研究目的及内容对于金纳米颗粒LSPR现象的研究现在已经在生物学、医学、分子学等很多领域引起了足够的重视，我们的主要研究目的是研究金纳米颗粒的制作方法，通过不同的制作方法（包括物理方法和化学方法）制作不同尺寸、形状的金纳米颗粒，通过测量比较各种金纳米颗粒的优缺点，寻求最佳的尺寸形状，用于在生物医学传感器上的使用。本论文的主要内容安排如下：第一章绪论就如前所述，主要讲金纳米颗粒以及LSPR现象的基础知识，为之后的研究做个铺垫。第二章通过阅读大量文献，总结了目前比较被关注的各种金纳米颗粒的制备方法，分析它们各自的特点，选择合适的方法进行我们的实验。第三章是我们的重点，主要是用柠檬酸钠法还原法进行制备金纳米颗粒，并在玻璃上进行组装，通过紫外-可见分光光度计，TEM和AFM的测量来比较金纳米颗粒的各项性能指标，以此来研究金纳米颗粒的特性。第四章研究对金纳米颗粒进行蛋白修饰的方法，并研究修饰蛋白后的光谱特性，以及蛋白修饰后的金纳米颗粒对周围环境折射率变化的灵敏度。第二章 金纳米颗粒的制备金纳米颗粒作为最好的贵金属纳米颗粒之一，具有很多独特的性质，譬如说极其稳定、还有光学和电学特性，在现在的生物医学检测领域、材料领域以及物理化学领域都有着至关重要的作用，为了能够更好的研究金纳米颗粒的这些特殊性质，金纳米颗粒的制备就显得尤其重要。金纳米颗粒的制备在纳米科技开始发展的上世纪八十年代末九十年代初就有很多的课题组在进行探索了。比如说Turkevich30和Frens31等在很早之前就做了很多早期的工作。到目前为止，金纳米颗粒的制备方法有很多种，根据我们的总结和归纳，主要包括以下三个大方面：一是物理方法，二是化学方法，最后是物理辅助方法。接下来就从这三个大方面分别介绍金纳米颗粒的制备方法。第一节 物理方法2.1.1 真空蒸镀法真空蒸镀法是一种比较简单、常见的金纳米颗粒的制备方法，就是在在真空环境下对金进行高温加热或者电子束轰击使得金原子蒸发，并使其在冷的石英衬底上冷凝，这样就可以制备出粗糙的金纳米颗粒。虽然这种方法比较简单，但是通过这种方法制备的金纳米颗粒形状和尺寸都不均一，这种方法不好控制。这种方法的缺点非常明显，一般很少采用。2.1.2 软着陆法软着陆法其实类似于真空蒸镀法，但是由于在真空蒸镀法的过程中很难对金纳米颗粒的尺寸和形状进行精确控制，因此我们对此方法进行了改进。软着陆法就是在真空蒸镀法的基础上，在金原子蒸发的过程中不断地吹入氩气流，使得金纳米颗粒在轻轻地沉积在固体基底上之前，固体基底已经被一层冷冷的氩气覆盖，金纳米颗粒沉积在被氩气覆盖的基底上。这种方法制备的金纳米颗粒的形态完全不同于简单的真空蒸镀法制备的金纳米颗粒，它们更加趋于球形，而且尺寸分布比较均一，但是尺寸大小不太容易控制。这种方法用的也比较的少。2.1.3 激光消融法Henglein，Cotton和他们的同事发现了在液体下用激光消融法可以制备金属纳米颗粒32。最近Yeh和他的团队也用激光消融法制备了铜纳米颗粒。在最近的研究中，发现通过SDS（十二烷基磺酸钠）的水溶液中用激光消融金盘可以制备金纳米颗粒33。通过调节SDS的浓度和激光的波长可以控制金纳米颗粒的尺寸。激光消融法的具体结构图如图2.1所示：图2.1 激光消融法结构示意图从图2.1中可以看出，金盘（纯度大于99.99%）放置在玻璃容器的最底部，容器中装入10ml的SDS水溶液。金盘被波长为532nm的激光通过透镜会聚后进行照射，透镜的焦距为250mm，调节透镜和金盘表面的距离，使得金盘表面的光斑直径在1-3mm范围内。控制激光的输出能量最大在90mJ每一个脉冲。在激光束的照射下，溶液逐渐变成酒红色，这就制备出了金纳米颗粒，在整个制备过程中要使用表面活性剂来阻止金纳米颗粒的团聚。随着SDS浓度的不断提高，纳米颗粒的尺寸单分散性就越好。不过这种方法制备的金纳米颗粒尺寸一般在1-5nm之间，不太适合大尺寸纳米颗粒的制作，但是一个优点就是这种方法可以适用于很多种类金属纳米颗粒的制备，重复性高，操作比较简单。2.1.4 光刻技术在目前的研究成果中，纳米光刻技术发展的很快，有很多种不同的方法，早期比较常用的有电子