4757.膜分离茶多酚工艺初步研究 论文正文.doc

毕 业 论 文（设计） 题 目 膜分离茶多酚工艺初步研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010年5月30日摘 要研究膜分离技术制备低咖啡因高表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量茶多酚生产工艺。主要采用高速离心、微滤、超滤、纳滤技术，高效液相色谱检测，结果表明，高速离心具有较好的澄清效果，微孔膜在孔径为5m,压力0.1MPA，流速为20mL/min分离咖啡因去除率0.23%，EGCG损失率0.18%。超滤膜5kdal（膜单位道尔顿）在压力0.5MPA，流速7mL/min分离咖啡因去除率0.18%，EGCG损失率0.11%；超滤5kdal跟1kdal分离咖啡因去除率0.28%，EGCG损失率0.04%。纳滤膜浓缩压力0.5MPA，流速5mL/min咖啡因去除率0.23%，EGCG损失率0.25%。膜的使用及选择结合木质纤维素树脂分离技术，在一定程度上降低咖啡因的含量使其达到标准(0.4%)，提高EGCG的含量达到标准(50%)。所得产品得率为7.3%，咖啡因的纯度为0.36%，EGCG纯度为59.50%。关键词：膜分离；微滤；超滤；纳滤；咖啡因；EGCG目 录引言.11材料与仪器21.1实验材料.21.2实验试剂.21.3试验仪器.22实验方法32.1分离液制备.32.1.1提取液制备.32.1.2提取液离心分离.32.2微孔膜分离.32.3超滤膜分离.32.4树脂分离.42.4.1上样液调配.42.4.2柱平衡及上样洗脱.42.5纳滤膜浓缩.52.6分析方法.52.6.1HPLC分析条件52.6.2标准曲线制作.52.6.3茶多酚含量计算方法.53结果与分析.63.1标准曲线制作.63.2微孔膜分离效果.73.3超滤膜分离效果与比较.83.4纳滤膜浓缩效果.94总结与讨论10参考文献.11引言膜分离技术是21世纪最具有发展潜力的高新技术，分离过程以选择性透过膜为分离介质，在压力差浓度差等推动力下,原料侧组分选择性地透过膜,以达到分离、提纯的目的1。由于其兼有分离、浓缩、纯化的目的，选择合适的膜与操作参数，可得到较高的回收率，处理系统可密闭循环，防止外来污染，不外加化学物质，透过液可循环使用，降低成本，减少对环境的污染。在各种工业生产中得到广泛的应用。已开发应用的膜分离技术有反渗透(RO)、纳滤(NF)、超滤(UF)、微滤(MF)四种2。大多数膜分离过程中物质不发生相变化,分离系数较大,操作温度在室温左右。微滤用于悬浮液（粒子粒径为0.110m）的过滤；超滤以低能耗、无热效应、无相变化、结构简单、占地小、操作简便、使用的压力低、产水量较大易于实现自动化的特点而广泛地应用于多种物质的分离、浓缩、净化等领域；纳滤膜介于超滤与反渗透之间，能截留分子量为3001000的小分子物质，其集浓缩与透析为一体，可使溶质的损失达到最小，反渗透膜能将水与低分子量物质分离，其典型应用是海水脱盐3-4。将膜分离技术应用于茶多酚制品的生产工艺中具有深远意义。由于浸提过程中的富集，一般茶提取物中咖啡因的含量都远远高于鲜叶，将茶提取物作为功能成分在食品和药物上利用时，脱去咖啡因是提高产品附加值的前提基础条件5-6。目前膜分离浓缩茶多酚的研究报道较少，浙江一企业需要咖啡因低于0.4%,EGCG高于50%，在之前的研究中，咖啡因的含量0.61%，EGCG的含量45.50%达不到所需要求。因此膜的使用研究变的尤为重要，本文就对微孔膜、超滤膜分离，纳滤浓缩作了一些研究，膜使用让结果达到了所需要求，并能扩大中试生产。1 材料与仪器1.1实验材料茶叶（炒青大宗茶沫，购于金华浦江） 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG（实验室提供）1.2实验试剂95%乙醇（食用级），柠檬酸、酒石酸亚铁、磷酸氢钠、磷酸二氢钾等均为分析纯试剂，乙醇（色谱纯），冰乙酸，水为蒸馏水。1.3实验仪器核酸蛋白自动测定仪（SHQT-6A上海琪特分析仪器有限公司）；N2000色谱数据工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）；分光光度计（752N上海精密科学仪器有限公司）；分析天平（SPS202F梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）；喷雾干燥器（SY-6000上海世远生物设备工程有限公司）；冷冻干燥仪（1-2LD德国ALPHA）；超声波清洗器（KQ-500DA昆山市超声仪器有限公司）；层析柱（16×40mm，40×800mm上海亚荣生化仪器厂）；旋转蒸发仪（RE-52AA上海亚荣生化仪器厂）；真空泵（SHB-III郑州长城科工贸有限公司）；微孔过滤膜(上海市新亚净化器件厂)；超滤膜小试平板超滤膜设备FlowMem0250(厦门世达膜科技有限公司)；卷式膜小试设备（RNF-0460 厦门世达膜科技有限公司）；高速离心机DL-5型(上海安亭科学仪器厂)。2 方法2.1分离液的制备2.1.1提取液制备称取1000.0g绿茶沫，以1:12比例加30%酒精浓度的溶剂，65水浴超声加热提取，30min(每15min停2min)，纱布过滤提取液、重复一次，合并滤液，即得提取液17L。2.1.2提取液离心分离得到提取液，高速离心机离心，离心料液共17L，转速10000转/min，流速10m3/h，压力0.5MPA，流速5L/min，所得澄清溶液16L左右，取16L进行分离即为待分离的分离液。2.2微孔膜分离1.原料液槽 2.输液泵 3.压力表 4.微滤组件 5.循环阀微滤膜主要应用于截留颗粒物,液体的澄清以及大部分细菌的去除,并作为超滤过程的前处理。取分离液16L溶液通过孔径为5m滤芯，压力为0.1MPA，流速20mL/min，收集滤液，水洗浓缩液，关机后收集系统残留液，抽取透过液和截留液的溶液过滤分别取滤液做检测分析。试验工艺图2.1如下： 图2.1微孔膜试验流程示意图2.3超滤膜分离超滤膜能截留分子量在上千至数十万的大分子,除能完成微滤的除颗粒、除菌和澄清作用外,还能除去微滤膜不能出去的病菌、热源、胶体和蛋白质等大分子化合物。超滤以全回流方式进行，在超滤时一般情况下，膜压力为0.5MPA，流速7mL/min经微孔膜过后取15L透过液先通过截留分子量5kdal的膜饱超滤，再通过截留分子量1kdal的膜饱超滤。开机进料液并收集滤液，水洗浓缩液，关机后收集系统残留液。抽取透过液和浓缩液的溶液过滤分别取滤液做检测分析。试验工艺图2.2如下：1.原料液槽 2.输液泵 3.压力表 4.反渗透（超滤、纳滤组件）5.流量计 6.循环阀 7.浓液阀 8.流量计阀图2.2超滤、纳滤试验流程示意图2.4树脂分离2.4.1上样液调配将精滤液按比例调配成pH=4，酒精度为10%的绿茶溶液，为上样液。2.4.2柱平衡及上样洗脱柱平衡：用10%酒精，柠檬酸调pH=4平衡树脂柱，使整个树脂柱体系处于酒精度为10%， pH=4。上样量取500ml，上样：以V=1.5L/min流速上样，上样完成后静置10min。10%洗脱：以5BV（层析柱床程）体积的10%酒精pH=4洗脱，流速控制在1.6L/minV 1.8L/min。40%洗脱：以3BV体积的40%酒精洗脱，流速控制在1.7L/minV 1.9L/min。70%洗脱：以2BV体积的70%酒精洗脱，流速控制在1.7L/minV 1.9L/min。2.5纳滤膜浓缩采用NF-200 卷式纳滤组件， 在压力0.50MPa、流速5ml/min 室温条件下操作运行，试验流程如图2 所示。取40%洗脱液进行纳滤操作，开机进料液并收集浓缩液，关机后收集并洗出系统残留浓缩液，浓缩液分别做检测分析。浓缩液即得茶多酚成品。2.6分析方法2.6.1 HPLC分析条件1）流动相配制：A相：0.5%冰醋酸+3%乙腈+水定容B相：0.5%冰醋酸+30%乙腈+水定容2）戴安PH680高效液相色谱仪，色谱柱：C18柱(250mm*4.6mm,5um)，v=1mL/min，波长280nm，进样量20ul，柱温30，检测器：UVD170U紫外检测器流动相变化如表2.1：表2.1HPLC流动相配比随时间变化表检测时间（min）A相B相045min100%0%4550min0%100%5060min100%0%2.6.2标准曲线制作配制标准溶液：准确称取表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）0.250g,准确称取咖啡因0.125g,配成母液5mg/ml,配成EGCG为0.5，1，1.5，2，2.5mg/ml的浓度，用于制作标准曲线。2.6.3茶多酚含量计算方法茶多酚得率计算经验公式如下：a% =A1×3.15×N1×V1 /A0×3.15×N0×V0 公式 2.1 公式中变量含义a%:得率；A0：原液茶多酚检测吸光度；A1：茶多酚检测吸光度；3.15：经验值（企业检测经验值）；N0：茶多酚检测过程原液稀释的倍数；N1：茶多酚检测过程第二次稀释的倍数；V0：原溶液体积；V1：第二次检测溶液体积； 3 结果与分析3.1标准曲线的制作将0、0.5、1、1.5、2，2.5mg/ml6个不同浓度的EGCG和咖啡因标准品，按照2.6.1检测方法，得样品浓度与样品出峰面积相应值依次为：0、185.938、376.523、531.483、714.3、856.011（EGCG）, 0、192.747、371.133、501.032、650.444、767.510（咖啡因）；将此浓度与出峰积分面积值在EXCEL中进行线性回归，制得标准曲线如图3.1、3.2所示：图3.1EGCG标准曲线图 图3.2 咖啡因标准曲线图由图3.1、3.2可得EGCG标准曲线为y = 344.01x + 14.035，R2=0.998;咖啡因标准曲线为y = 305.17x + 32.344，R2=0.9922。3.2微孔分离效果微孔膜分离取分离原液16L通过孔径为5m滤芯，压力为0.1MPA，流速20ml/min，收集截留液2L、透过液14L检测结果如图3.3所示：原液12透过液截留液2121 图3.3微孔膜分离原液、微孔截留液、微孔透过液液相检测分析图备注：1为咖啡因检测峰 2为EGCG检测峰；以下HPLC图谱做同样标识。结合茶多酚含量检测与图3.3检测分析结果，得出分离液16L稀释5倍A=0.649 茶多酚含量22.7%，咖啡因含量16.43%、EGCG含量19.03%。微孔截留液2L 稀释5倍A1=0.607 茶多酚含量21.23%。咖啡因含量10.50%、EGCG含量10.33%。微孔透过液14L 稀释5倍 A2=0.650 茶多酚含量 22.73%，咖啡因含量12.59%、EGCG含量15.54%，茶多酚得率=87.63%。由图3.3得出，微孔膜的使用降低咖啡因含量，同时EGCG含量也相应的减少了。3.2超滤分离效果及比较超滤膜分离膜压力为0.5MPA，流速7ml/min经微孔膜过后取14L透过液结果检测如图3.4下：5kdal透过液5kdal截留液2121 1kdal透过液1kdal截留液2121 图3.4超滤膜过分子量5kdal、1kdal截留液、微孔透过液液相检测分析图从图3.4中得出 5kdal截留液 2L稀释5倍 A3=0.650 茶多酚含量22.7%。咖啡因含量12.90%，EGCG含量10.35%。5kdal 透过液12L 稀释5倍A4=0.400 茶多酚含量13.99%，咖啡因含量10.34%，EGCG含量13.77%。茶多酚得率=52.75%。1kdal截留液 2L 稀释5倍A5=0.485 茶多酚含量16.96%咖啡因含量10.98%，EGCG含量11.60%。1kdal透过液 12L 稀释5倍 A6=0.358 茶多酚含量13.47%，咖啡因含量9.08%，EGCG含量14.91%。茶多酚得率=47.21%。从上述图谱可以看出，不管是过5kdal膜还是1kdal膜截留液中咖啡因含量都较高，说明二种膜孔径都能有效的去除一定的咖啡因，但EGCG含量也有所降低。3.3纳滤膜浓缩效果将40%洗脱液溶液通过蒸馏法检测含固率，同时结合高效液相色谱法测定咖啡因、EGCG含量得：咖啡因含量0.607%、EGCG含量60.77%，检测HPLC图谱如图3.5所示：图3.5 40%乙醇洗脱液HPLC检测图谱将40%洗脱液纳滤浓缩，整个浓缩时间跨度为24小时，浓缩冷冻干燥后测得：茶多酚得率为7.3%，其中咖啡因含量0.47%、EGCG含量45.63%，检测HPLC图谱如图3.6所示：图3.6 40%乙醇洗脱液干燥物HPLC检测图谱从图3.5、3.6比较得出纳滤能有效去除咖啡因，EGCG含量也降低（由于纳滤时间长，24小时），可能EGCG有部分被氧化原因造成，但在生产中采用大型的纳滤设备，浓缩时间大大减少，这个变化可以避免，这也正是下步在企业需要验证与解决的技术关键。4 总结与讨论本文主要研究膜分离技术制备低咖啡因高EGCG茶多酚工艺研究，研究表明微孔膜孔径为5m滤芯,压力0.1MPA，流速为20mL/min分离咖啡因去除率0.23%，EGCG损失率0.18%。超滤膜5kdal（膜单位道尔顿）在压力0.5MPA，流速7mL/min分离咖啡因去除率0.18%，EGCG损失率0.11%；超滤5kdal跟1kdal分离咖啡因去除率0.28%，EGCG损失率0.04%。纳滤膜浓缩压力0.5MPA，流速5mL/min咖啡因去除率0.23%，EGCG损失率0.25%。从这些数据看出，微孔膜、超滤膜(5kdal、1kdal同时使用)及纳滤膜咖啡因去除率相对较高，考虑经济成本，仅考虑微滤膜跟纳滤膜的使用，研究发现微滤膜、纳滤膜的使用，所得产品得率7.3%，咖啡因的纯度为0.36%，EGCG纯度为59.50%。微滤膜用于茶多酚浸提液的初步分离，造成一部分功能成分的损失，可研究孔径更小的微滤膜进行分离。超滤膜可有效地澄清茶多酚浸提液，固体杂质去除率高并截留了大部分的果胶、可溶性蛋白质、多糖等大分子物质，而使绝大多数的茶多酚透过。为减小超滤膜对茶多酚的截留率，操作过程中在保证除杂效果的基础上可适当增大膜的表面流速7-8。在保证茶多酚透过率的基础上也可考虑选用截留分子量更小的超滤膜来澄清茶多酚浸提液，从而提高后期茶多酚的纯度。而膜在连续使用一段时间后， 由于凝胶层的形成被污染，膜孔被截留的颗粒、胶粒、悬浮液、大分子和盐等所堵塞，水通量会逐渐下降，从而影响膜的正常使用，因此，为了提高效率，延长膜的寿命必须对膜进行充分的清洗9-10。微孔膜、纳滤膜清洗：首先清水冲洗半小时，然后用0.1%NaOH水循环洗半小时，最后清水冲洗至流出液为中性。超滤膜清洗：先用清水冲洗膜尽量使透过液变成无色液体，然后用4%的NaOH溶液冲洗，并使膜饱保存于该溶液中。随着膜分离技术在工业化过程中的广泛应用，其在茶叶功能性成分的提取过程中起着越来越重要的作用。参考文献1马利华，秦卫东，陈学红等膜技术分离纯化牛蒡多糖的研究J食品工业科技，2009，30(1)：231-2332陈建新，兰先秋，范新年等茶多酚工业提纯方法的比较研究J四川化工， 2005，8(2)：41-433陈荣仪茶多酚提取纯化及其改性的研究D四川大学，2005，3(4)：34-504孙艳娟，毛志方，沈瑞敏等不同分离膜在茶多酚提取工艺中的应用研究J中华茶叶加工，2009，(1)：27-295龚雨顺，刘仲华，黄建安等茶叶中儿茶素制备纯化研究进展J茶叶通讯， 2003，(1)：15-186高学玲，岳鹏翔，谢苏平等纳滤膜浓缩乌龙茶提取液的研究J茶叶科学， 2001，21(2)：112-1157王应平，杨艳，王文正等膜技术在多糖分离、浓缩中的应用研究进展J甘肃科技，2006，25(4)：63-668李季文，景明膜分离与树脂法联用提取分离胡芦巴总苷的研究J中国实验方剂学杂志，2009，15(1)：12-139夏炎，刘志昌，张莹等膜分离技术纯化白藜芦醇的研究J时珍国医国药，2009，20(1)：203-20410李燕妮超滤法分离纯化刺参酸性粘多糖工艺研究J化学与生物工程，2009，26(1)：39-41