香蕉枯萎病菌GFP标记和β葡萄糖甘酶基因克隆.doc

香蕉枯萎病菌GFP标记和-葡萄糖甘酶基因克隆学 科 门 类：农学一级学科名称：植物保护二级学科名称：植物病理学研 究 方 向：分子植物病理学与植物生理学研 究 生：指 导 教 师：完 成 时 间： M.S. Thesis of Fujian Agriculure and Forestry UniversityCloning Beta-Glucosidase Gene and Transformation of the Green Fluorescent Protein Gene in Fusarium oxysporum f.sp.cubense, Causal Agent of Banana Fusarium Wilt Discipline: AgronomyFirst Rank Discipline: Plant ProtectionSecond Rank Discipline: Plant Pathology Research Field: Molecular Pathology and Physiology of PlantPostgraduate: Li Yan DanSupervisor: Prof. Xu Wen YaoRes. Dr. Liu BoSubmitted Time: April, 2010独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。不保密，本论文属于不保密。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：目 录目 录i中文摘要IAbstractI第一章 前 言11 香蕉枯萎病重要性12 香蕉枯萎病菌的分子病理研究进展22.1 香蕉枯萎病菌的分子鉴定研究进展22.2 香蕉枯萎病菌的-葡萄糖苷酶研究概况23 丝状真菌的转化33.1 研究概况33.2 真菌DNA转化方法44 绿色荧光蛋白(gfp)基因在丝状真菌研究中的应用55 本研究的目的和意义6第二章 香蕉枯萎病菌的分离与分子鉴定61 材料72 方法72.1 香蕉枯萎病症状观察72.2 真菌的分离72.3 枯萎病原菌的纯化与保存72.4 分子鉴定73结果与分析83.1 香蕉枯萎病菌的分离83.2 香蕉枯萎病菌的鉴定114 讨论13第三章 构建香蕉枯萎病菌遗传转化体系151 材料152 方法162.1 原生质体制备162.2 绿色荧光蛋白的转化162.3 转化子的抗性鉴定172.4 转化子的分子鉴定172.5 转化子荧光检测173 结果与分析173.1 香蕉枯萎病菌原生质体形成173.2 绿色荧光蛋白的转化183.3 转化子的抗性鉴定193.4 转化子的分子鉴定213.5 转化子荧光检测224 讨论234.1 尖孢镰刀菌转gfp基因遗传转化体系的建立与优化23第四章 gfp基因标记香蕉枯萎病菌后的生物学特性241 材料242 方法242.1 转gfp基因尖孢镰刀菌Foc-3076的生长特性242.2 转gfp基因尖孢镰刀菌Foc-3076的侵染特性242.3 转gfp基因尖孢镰刀菌的香蕉植株致病性测定253 结论253.1 转GFP尖孢镰刀菌的生长特性253.2 转gfp基因尖孢镰刀菌的侵染特性263.3 转gfp基因尖孢镰刀菌的香蕉组培苗侵染速度283.4 植株中分离出的转化子荧光稳定性测定283.5 转gfp基因尖孢镰刀菌的香蕉植株致病性测定294 讨论294.1 绿色荧光蛋白基因转化香蕉枯萎病菌30第五章 香蕉枯萎病菌-葡萄糖苷酶cDNA克隆311 材料312 方法312.1 中间序列的引物设计312.2 采用TRIZOL Reagent提取尖孢镰刀菌Foc-3076菌株总RNA322.3 中间序列的序列的扩增322.4 3/RACE332.5 5/RACE342.6 尖孢镰刀菌-葡萄糖苷酶基因的多样性分析362.7 PCR产物的克隆与测序372.8 序列的同源性比较372.9 -葡萄糖苷酶基因的多样性分析373 结果与分析373.1 提取的RNA质量分析373.2 简并引物扩增部分373.3 3/RACE扩增结果393.4 5/RACE扩增结果403.5 -葡萄糖苷酶基因同源性分析403.6 -葡萄糖苷酶基因的多样性分析404 讨论42第六章 总结与展望431总结432 展望43参考文献43个人简历49致 谢50中文摘要尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc）引起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害，它能侵染几乎所有的香蕉品种，特别是4号生理小种（Foc4），给我国香蕉的生产带来严重威胁。目前，国内外尚无十分有效的化学防治方法，也未培育出稳定的高抗性品种，主要因为香蕉枯萎病是由维管束侵染的系统性病害，一般的化学药剂不能奏效，且而长期不清楚香蕉枯萎病菌的致病机理造成的抗病育种靶标不明确。建立PEG介导香蕉枯萎病菌遗传转化体系，对于香蕉枯萎病菌研究基因的表达调控机理、基因功能等具有重要意义；将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，gfp）基因转化入香蕉枯萎病菌，研究转化后菌株的生物学特性以及在香蕉植株体内的侵染特性，为进一步研究香蕉枯萎病菌致病机理和生防提供理论基础；本研究克隆香蕉枯萎病菌的-葡萄糖甘酶基因，为研究此基因功能奠定基础。主要研究结果如下：1. 香蕉枯萎病株采自福建省漳州，经单孢分离及形态学与分子鉴定，获得28个尖孢镰刀菌古巴专化型，其中21个为4号生理小种。2. 建立香蕉枯萎病菌的PEG介导原生质体法遗传转化系统，香蕉枯萎病菌的原生质体的制备是整个转化中最关键的一步，影响原生质体制备因素很多主要包括合适的酶液、菌丝的菌龄、制备原生质体的溶菌温度和溶菌时间。本文转化方法采用的是0.8 mol·L-1的NaCl溶解的崩溃酶 (Drislase)和溶壁酶（Lysing Enzyme）；菌龄10-14 h的新鲜菌丝；28 ，70 r·min-1消化酶解2-3 h。3. 对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Foc-3076菌株进行gfp标记。标记后菌株的菌丝、分生孢子、厚垣孢子的形态与亲本菌株形态基本相同，且在紫外光下都呈现绿色荧光。PCR验证表明，目的基因已转入到Foc-3076菌株。且标记后菌株较之原始菌株的抗潮霉素能力大大增加。在无选择压力条件下继代培养6代，转化子仍然保持强烈的绿色荧光。gfp基因标记前后的菌株在菌落形态、最佳pH值和菌丝生长速度基本一致，菌株致病力未有明显改变，发病率均达到90 以上。4. 利用激光共聚焦显微镜扫描观察结果表明，标记病原菌侵染香蕉是以孢子萌发或菌丝体从根部侵入植株体内，并沿着寄主细胞间隙扩展与蔓延，经植株的维管束组织向上生长至植株的假茎顶部。5.通过GenBank上近缘物种-葡萄糖甘酶基因序列设计简并引物，提取尖孢镰刀菌古巴专化型Foc-3076菌株的RNA，通过RT-PCR扩增中间序列及3'RACE-PCR从Foc-3076 菌株cDNA一链中克隆得到一个1473 bp的-葡萄糖甘酶基因序列。关键词：香蕉；尖孢镰刀菌古巴专化型；绿色荧光蛋白基因；-葡萄糖甘酶；生物学特性；侵染AbstractFusarium wilt of banana caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), is one of the most serious fungal diseases in banana, and reported to be one of the major limiting factors for banana production worldwide. Especially, Foc race 4 is able to infect almost the banana cultivars and brings great threat to banana production. To date, few effective and economically safe methods to protect banana from Fusarium wilt disease have been developed. The main reasons are that pathogen infects vascular tissues and leads to typical wilt symptoms, common chemicals do not well work, and pathogenic mechanisms are still unclear for resistance breeding target.The PEG-mediated transformation system of Foc was established to study expressing regulation and functions of genes. Transform Foc isolate with the gfp gene, was made a useful tool to study Foc infection. It helps to further study pathogenic mechanisms and biocontrol mechanisms for banana fusarium wilt. Beta-glucosidase genes coloning for the Foc isolates is the foundation to study the gene function. These major results are as follows:1. Fusarium strains collected from banana wilt disease in Zhangzhou, Fujian Province, by single spore isolation and molecular characteristics, were 28 Foc strains, of which 21 Race 4 strains.2. The PEG-mediated transformation system of Foc was established. Preparation of Fusarium protoplast is the key step during the transformation. Many factors affect the quality and quatity of the protoplast including the appropriate enzymes, mycelium age, the digestion temperature and time of the cell wall. This transformation was used in 0.8 mol L-1 of NaCl dissolved collapse enzyme (Drislase) and dissolved wall enzymes (Lysing Enzyme); culturing 10-14 h of tender mycelium; digest temperature in 28 then shaking at 70 r min-1 at for 2-3 h. 3Strain Foc-3076 was transformed with gfp gene by protoplast method. The morphology of mycelium, conidia, chlamydospores of labeled-gfp strains were the same as the parent strains, and all transformants appeared green under ultraviolet fluorescence. PCR amplification showed that gfp gene has been transferred into strains Foc-3076. And the transformants resistance ability to hygromycin B increased greatly than the original strain. Transformants were quite stable and remained strong green fluorescence after six successive subcultures. The morphology，pH value and growth rate of the gfp-tagged transformants are the same as the wild type strain. The pathogenicity of the wild type strain and the gfp -tagged strain was over 90 percent.4 Using laser scanning confocal microscope, colonization and infection were visualized: the colonization sites on the root surface by spore germination or mycelium, then along the extension of host cells within the gap, and spread upward through the plant vascular tissue growth to the top of pseudo stem.5 A degenerated primer was designed basing on the conserved domains of nucleotide sequence of known fungus beta-glucosidase genes through GenBank. After extracting RNA from strain Foc-3076, beta-glucosidase gene cDNA was amplified with PCR by using the degenerated primers. And we cloned one cDNA of beta-glucosidase from strain Foc-3076 by 3/RACE ,including 1473 bp nucleic acids.Key words: banana; Fusarium oxysporum f.sp.cubense(Foc); green fluorescent protein(GFP); beta-glucosidase; Biochemical characterization; infection第一章 前 言香蕉清甜柔软，口感润滑，天然无籽、食用方便等独特的风昧和营养价值深受人们的喜爱。同时，香蕉因产量高、投产早、供应期长（可全年供应）、效益好而深受生产者的欢迎1。目前共有120个国家和地区生产香蕉，其中大部分属于发展中国家，主要分布在北纬18°-30°之间2。我国是香蕉原产地之一，分布在广东、广西、海南、福建、云南等热带与亚热带地区，2005年我国香蕉产量为639.00万t，占世界香蕉总产量的8.80 %，居全球第三位，为我国国民经济的发展做出了重要的贡献3,4。但随着种植面积的扩大，香蕉病害问题也日益突出。目前全世界报道的香蕉病害现今生产中重要的有束顶病、叶斑病、枯萎病、冠腐病类及炭疽病等5。香蕉枯萎病被评价为高度危险外来物种，在我国2007年5月被正式列入进境植物检疫性有害生物名录6,7。本研究建立起一套完整的尖孢镰刀菌古巴专化型遗传转化体系，并进行转化子生物学特性的变化测定，以了解转基因对尖孢镰刀菌生物学特性的影响，并利用转化子研究在香蕉植株体内的侵染特性和体内分布状况等问题进行研究。同时，克隆香蕉枯萎病菌的-葡萄糖苷酶基因cDNA序列，以期将来探索-葡萄糖苷酶基因在香蕉枯萎病菌侵染香蕉过程中作用等进一步研究提供基础。1 香蕉枯萎病重要性香蕉枯萎病又名香蕉巴拿马病、黄叶病，是一种世界性广泛分布的毁灭性病害8，也是香蕉产区最为严重和著名的毁灭性病害之一9；1874年Joseph Bancroft在澳大利亚首先报道了此病, 1910年巴拿马香蕉就此病损失惨重；我国台湾于1967年首次发现该病危害Cavendish栽培品种类香蕉，并对香蕉产业造成巨大破坏；目前广东、福建、海南、广西等蕉区也都发现有枯萎病的发生9-13。在香蕉枯萎病发生区，一般病园发病率为3.7 %20 %，严重的在60 %以上14。香蕉枯萎病现几乎蔓延到所有的香蕉种植国家与地区15。香蕉在幼龄期感病无明显的症状，到成株期时最下部叶片及其叶鞘呈橙黄色，从叶边缘向中脉逐渐扩展，叶片自下而上相继发黄，叶柄在靠近叶鞘处折曲，病叶凋萎，倒挂在假茎旁。有些病株则从假茎外围的叶鞘近地面处开裂，渐向内扩展，层层开裂直到心叶，并向上扩展，裂口褐色干腐。在病株内部，有黄褐色病变的维管束，根部木质导管变为红棕色，一直延伸到球茎内，后来黑褐色而干枯16-18。香蕉枯萎病是一种的植物土传病害，由尖孢镰刀菌古巴专化型（fusarium oxysporum f.sp.cubense）引起19-21。该菌主要形态特征是马铃薯葡萄糖培养基上（PDA）菌落呈放射状生长，菌落颜色为淡紫、粉红及白色等，可产生大型分生孢子，小型分生孢子以及厚垣孢子。迄今尚未发现尖孢镰刀菌的有性阶段。分生孢子萌发的温度范围是8-36 ，最适温度是28-30 ，pH 值范围是3-10，最适pH 是5-7。 菌丝生长的温度范围是8-34 ，最适温度是26-28 ，pH 值范围是3-10 ，最适pH是6-722。在相对湿度100 %的条件下，病原菌分生孢子萌发率最高；碳源营养条件比氮源更有利于分生孢子萌发；光照可以促进分生抱子的萌发23。目前已报道香蕉枯萎病菌有4个生理小种，1号生理小种呈世界性分布，侵染龙芽蕉类；2号生理小种只侵染杂种三倍体棱香蕉Bluggoe(ABB)，且仅局限于中美洲，对香蕉栽培品种危害较小；3号生理小种只侵染野生蝎尾蕉属Heliconia；4号生理小种在亚洲与非洲的部分国家以及澳大利亚发生危害，严重威胁世界香蕉第一大种植品种Cavendish的生存，以及Taiwan Latundan(AAB)、Gros Michel(AAA)、Pisang Lilin(AA)和Bluggoe(ABB)，其寄主范围大于生理小种1号，毒性最大24,25。目前国内4号危害最为广泛和严重4,26,27,17。2 香蕉枯萎病菌的分子病理研究进展2.1 香蕉枯萎病菌的分子鉴定研究进展对于香蕉枯萎病菌分子生物学的研究，集中在基因组DNA和RNA。病害症状诊断以及常规病原物分离培养检测这样的传统技术，要求要有一定的病原菌分类知识与经验，还有费时、且漏检率高的缺点28。随着分子生物学的发展，以PCR为基础的技术广泛地运用于植物病原物鉴定。国外Koenig等利用RFLP技术分析了全世界的165个Foc分离菌株，并将所有菌株划分起源的系谱21。目前有许多根据RAPD、PCR-RFLP、巢式PCR手段等对镰刀菌进行检测和鉴定的研究，其中针对ITS序列的检测更是研究中的热点。漆艳香等利用RAPD分子标记方法对海南省香蕉枯萎病菌1、4号生理小种进行遗传多样性分析，且寻找到1、4号生理小种的特异条带，为在分子水平上进行香蕉枯萎病菌生理小种鉴定提供了方便26。刘景梅等用SCAR标记广东蕉区存在的尖孢镰刀菌古巴专化型的Race 1和Race4这两个小种29。王国芬等对根据香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum) ITS序列设计合成的三条引物，可用于香蕉枯萎病的早期鉴定和病原菌的检测 30。台湾学者Ying-Hong Lin等已设计了香蕉枯萎病4号生理小种（Foc-4）特异引物Foc1/Foc231。廖林凤等用RAPD随机引物中筛选出两条引物产生的片段设计SCAR上下游特异引物，其中一个引物成功地建立了4号生理小种的快速诊断32。农业部公告第1298号于自2010年2月1日将实行香蕉镰刀菌枯萎病诊断及疫情处理规范。2.2 香蕉枯萎病菌的-葡萄糖苷酶研究概况-葡萄糖苷酶(EC3, 2, 1, 21) , 属于水解酶类，其英文名beta glucosidase，又称-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶或苦杏仁苷酶33。是纤维素酶的主要成分之一，纤维素酶是由包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和-葡萄糖苷酶3个主要成分组成的诱导复合酶系34。-葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要成员，而纤维素酶组分种该酶含量最少、活力普遍较低，因此成为纤维素酶解的瓶颈。该酶分布较为广泛,尤其是植物的种子和微生物中尤为普遍35,36。 不同来源的-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同导致差异也很大。该不同来源的-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、比活力、分子量、等电点、pH 值稳定性范围、最适反应pH 值、适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别33。酶的相对分子质量一般在40000-250000之间。众多研究结果表明，-葡萄糖苷酶为酸性蛋白酶，其最适反应pH 值一般都在3.0-7.0范围内，其中有许多酵母、细菌的胞内该酶的最适反应pH 值接近6.0左右；一般该酶的pH 值稳定性范围较广，在pH 值3.0-10.0范围内，糖苷酶的稳定性较好。-葡萄糖苷酶的最适温度在40-110 之间都有分布。对大部分-葡萄糖苷酶而言，它们的pI值都在酸性范围，一般在3.5-5.5之间，变化不大，。如来源蜜蜂的-葡萄糖苷酶，其pI值接近4.5-4.833,37。目前已经发现的产生-葡萄糖苷酶的生物类群包括真核生物、原核生物、古细菌3个界，几十个属，共几百个种。虽然-葡萄搪苷酶广泛得存在于微生物与植物中，然而植物来源的-葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低38，所以目前的研究主要集中在微生物上。-葡萄糖苷酶基因现已从燕麦、茶叶、旱金莲、长春花、黑檀等植物中进行了克隆和表达，目前在真菌中，木霉属和曲霉属的研究比较多。总之，-葡萄糖苷酶具有广泛的作用，引起了广大科研工作者的重视，但在植物病害防治上还需要进一步得深入研究36,39。关于病原菌产生的细胞壁降解酶在致病中的作用，国内外都有过一些报道，发现在致病过程中，纤维素酶(Cx、-葡萄糖苷酶)以及果胶酶(PMG、PMTE)都起着很重要作用40,41。尖孢镰刀菌在致病过程中会产生多种致病物质，比如毒素（如FA、镰孢酸等）、细胞壁降解酶（PMG、-葡萄糖苷酶等）42。国外报道采用固体发酵技术 (SSF)让尖孢镰刀菌的一个菌株产生N-乙酰-D-葡萄糖苷酶，发现在固体发酵条件下该菌株产酶的最大酶活期在培养的第12 天，最大产酶量为23.6 Ug-1，进一步分离纯化N-乙酰-D-葡萄糖苷酶，N-乙酰-D-葡萄糖苷酶，确定其最适温度为40 、最适pH值分别为5.0和6.0，并且测定该酶的分子量67 kDa43。Iwona等在蔗糖诱导羽扇豆对尖孢镰刀菌的防御反应中发现，植物的组织在被病原菌侵染之后，-葡萄糖苷酶与苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性都能剧烈增加44。Gianni等以玉米秸秆为材料，培养尖孢镰刀菌生产纤维素酶和木聚糖酶，该方法能获得大量的-葡萄糖苷酶45。国内王纯利等报道-葡萄糖苷酶作为一种细胞壁降解酶，能够破坏细胞壁结构，使病原菌易于侵入细胞42。Sasaki报道灰葡萄孢的致病力与-葡萄糖苷酶有相关性46。王纯利等也得出尖孢镰孢菌致病力与-葡萄糖苷酶呈现正相关。这是由于当病原菌接触寄主细胞壁时，在细胞壁组分的诱导下，会产生一种特有的降解酶分解细胞壁，导致寄主萎蔫，酶活性越高，从而分解细胞壁的速度就越快42。肖荣凤等对瓜类尖孢镰刀菌-葡萄糖苷酶活性与致病性进行研究时，发现酶活性小于30 U·mL-1时，菌株的发病率与酶的活性正相关，酶活性大于30 U·mL-1时，发病率大于90 %47。3 丝状真菌的转化3.1 研究概况真菌为低等真核生物，已发现的真菌多达150万种，在自然界分布广泛48。真菌能产生较好的经济效益，所以近年来越来越受到关注。有些真菌是重要的工业菌株，用于生产酶、有机酸等物质；有些与农业生产有着重要的关系，一方面能引起农作物病虫害，如稻瘟病、镰刀菌等，一方面又具有防治植物病虫害的功能，如木霉菌等；另一些丝状真菌又与医药有着密切的关系，如产黄青霉49。自1973年Mishra和Tatum首次报道粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的DNA转化以来，丝状真菌遗传转化系统研究发展非常迅速。现在已经有许多丝状真菌己相继实现了DNA转化。DNA遗传转化是人们菌种改良、有用基因克隆或基因功能研究的重要途径。已转化成功的丝状真菌中有工业真菌(如黑曲霉等)、医用真菌(如产黄青霉、顶头孢霉)、植物病原真菌(如玉米黑粉菌等)、杀虫真菌(如白僵菌、绿僵菌等)、真菌上寄生真菌(如哈氏木霉)、食用真菌(如裂褶菌、鬼伞等)、菌根真菌(如卷边桩菇、漆蜡蘑等)等50。目前，应用于丝状真菌转化的方法很多，最常用的转化方法是CaC12-PEG介导的原生质体转化与限制内切酶介导整合，这两种方法在转化前都要求预先制备原生质体或者制备渗透敏感细胞。此外还有醋酸锂转化、电穿孔、质粒轰击及基因枪等方法。大多数植物病原真菌都可以利用聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导进行转化，但是对于有些真菌，其原生质体难制备或其只能够活体寄生，因此很难利用上述方法转化，对于这样的真菌所采用的转化方法是质粒轰击或农杆菌介导转化方法51。3.2 真菌DNA转化方法近年来，真菌遗传转化研究得到迅速的发展，已经建立了PEG介导的原生质体遗传转化、限制性内切酶介导的遗传转化（REMI）、电激转化、转座子介导的遗传转化、农杆菌介导的遗传转化(ATMT) 、基因枪法等多种方法。3.2.1 PEG介导原生质体遗传转化该方法是以原生质体为感受态细胞，将受体细胞悬浮于含质粒DNA以及一定浓度的CaCl2、PEG(聚乙二醇)缓冲液中混合，与PEG相类似的多聚物还有多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等，这些多聚物与二价阳离子(Mg2+、Ca2+等)以及质粒DNA在原生质体表面形成沉淀颗粒，再通过原生质体的内吸作用而进入细胞内50,52。原生质体的制备是PEG介导原生质体遗传转化的关键，影响原生质体制备和再生的因素很多包括菌丝体的培养温度、制备原生质体的溶菌温度和溶菌时间、破壁酶的选择、菌丝龄的大小、细胞预处理、高渗液的选择等等。刘士旺等还指出实验的再生率比较低，是制约获得大量转化子的因素，原生质体的再生受许多因素影响，除培养基和酶解时间以外，还有其他因素影响再生53。PEG介导原生质体转化法便于操作，且原生质体的群体数大，也较易获得纯合的转化子，但也存在着转化率低、不十分稳定、再生时间长等问题，不同的菌用PEG-CaC12介导原生质体转化法转化率有一定差异54,55。王敬国等用PEG-CaC12介导黑曲霉原生质体转化，每10 g质粒转化子可达500个左右56。刘士旺等对绿色木霉原生质体的激发子基因进行转化，其转化率为每微克DNA得到l-2个转化子57。3.2.2 电激转化法电激转化法的原理就是利用电场脉冲对受体细胞进行可恢复的电激穿，于原生质体膜上形成可逆的瞬间通道，质粒DNA分子才能穿过质膜进入受体细胞并发生DNA重组。电激转化法是一种物理技术，适用的范围很广，且具有简单、快速的特点，转化效率与PEG介导原生质体转化法相当，该法作为PEG介导原生质体转化法的一个补充，目前已经广泛应用于不同物种的完整细胞，细菌，哺乳动物以及丝状真菌等54,58。3.2.3 限制性内切酶介导转化(REMI)法其机理是在限制酶存在下，染色体DNA被相应限制酶位点切开，尽管大多数切点没有整合外源DNA又重新连接，但也有可能染色体DNA的粘性末端与外源DNA的粘性末端发生连接而插入，切口(nick)由DNA连接酶封闭后形成转化子。赵培宝等利用Hind线形化质粒和介导的串珠镰刀菌插入转化59。REMI插人突变技术操作简单，快速、高效实现转化，单拷贝插入概率大，对大多数已实现转化的真菌均实用。王政逸等用限制酶介导尖孢镰刀菌黄瓜专化型法比常规的原生质体法增加了1. 75-5 倍的转化子60。但是用不同的限制内切酶转化效率有些差异，赵培宝等用Hind、Sac I、 Kpn I三种限制酶介导对串珠镰刀菌插入转化，均得到了转化子，Sac I每微克质粒平均可获得4-6个转化子，Kpn I每微克质粒仅1-2个转化子，用 Hind 线形化质粒和介导转化，每微克质粒则也可获得4-6个转化子59。3.2.4 农杆菌介导转化法(ATMT)根癌农杆菌（Atumefaciens）是一种革兰氏阴性菌，在自然情况下可通过伤口进入植物细胞，并将T-DNA转移至植物细胞并整合到基因组，据此建立了农杆菌介导的植物遗传转化体系。近年来的研究表明，Atumefaciens介导的方法不仅可以转化植物，而且广泛地用于转化细菌、动物和真菌58。E. D. Mullins等已经用ATMT方法在尖孢镰刀菌上进行了基因插入突变61。ATMT方法具有操作简便，不需要制备原生质体，转化效率高，单拷贝比例高，转化子稳定。到目前为止，已经有20多个种的真菌利用该方法成功实现了遗传转化。众多研究表明，影响根癌农杆菌转化真菌的因素比较多。乙酰丁香酮 (acetosyingone，AS)是根癌 农杆菌介导真菌转化的关键。共培养时间、选择标记、农杆菌菌株、双元载体的选择等都决定着农杆菌转化真菌的成败62。3.2.5 基因枪转化法其原理是在加入Ca2+ 的亚精胺等使外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，微粒在高压作用下高速(300600 rigs)的射入受体细胞或组织。小颗粒穿透力强，故不需去除细胞壁和细胞膜，从而进入基因组，实现稳定转化的方法。可采用菌丝或孢子进行转化，无需制备原生质体，节省时间，且孢子和菌丝比原生质体的萌发率高很多50。Mourad A.M用微粒轰击法把gfp基因融合入Fusarium oxysporum，每微克质粒则也可获得45个转化子63。基因枪介导转化法的优点是无宿主限制、靶受体类型广泛，不受组织类型限制、可控性高、操作简便快速等，而确定是价格昂贵、以及由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主后整合位点相对不固定而导致转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失等的现象64。4 绿色荧光蛋白(gfp)基因在丝状真菌研究中的应用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，gfp)基因是已被广泛应用的报告基因，1962年从发光水母(Aequorea victoria)中纯化出来65，gfp基因共编码238个氨基酸的蛋白质，分子量大小为27 kDa，395 nm和475 nm吸光波长，在508 nm波长时发光。由于其本身就是一种发光蛋白，并具有稳定、直观、方便的荧光性质和不需添加其他外源底物就可在活细胞中直接进行定位检测和观察等优点，克服了分子生物学研究中传统的报告基因的不足66。通过gfp基因不仅可探测基因表达和蛋白定位，也能在单个生物体中持续显影成像，而用其他报告基因标记蛋白，只能短时间观察，并且每个数据点都可以来源于不同的个体67。在外界信号刺激下在活细胞中还可以实时观察，目的蛋白的变化过程等现象。若使用激光共聚焦显微镜，细胞中的任何局部的变化，在短时间内就能检测到。在短短时间内，它已经被广泛应用到真菌的研究中，并取得了巨大的成果。Pieter van West等将Phytophthora palmivora分别用GFP标记与GUS标记，发现GFP标记的菌株40 %在荧光显微镜下可见，而GUS标记的菌株75 %产生GUS，然而显微放大倍数大时，GFP标记的菌株的优点优于GUS标记的菌株，相反，显微倍数小时GUS优于GFP标记68。张旭等绿色荧光蛋白gfp标记禾谷镰刀菌，接种于小麦小穗后，观察到标记后的病原菌会沿着柱头、子房或内、外稃内表面，再经过靠近穗轴的致密组织，侵入进入邻近小穗，进而感染整个麦穗，直到茎秆69。Anastasia等用gfp基因标记Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici后在激光共聚焦显微镜下观察西红柿的侵染过程，发现病原菌的最佳定位部位是在根部的周皮细胞的相接处等等70。玉米黑粉菌（Ustilago maydis）是第一个成功表达gfp基因的丝状真菌，然后是构巢曲霉（Aspergillus nidulans），（Aureobasidium pullulans）等。现在，已在12个丝状真菌属的16个种中报道了gfp基因的表达，其中包括Colletotrichum，Mycosphaerella，Magnaporthe，Cochliobolus，Trichoderma，Podospora，Sclerotinia，Schizophyllum