项目名称： 表观遗传变异在肺癌发生发展中的作用和机制 首席科学家.doc

项目名称：表观遗传变异在肺癌发生发展中的作用和机制首席科学家：孔祥银 中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2010.9至2015.9依托部门：中国科学院 上海市科委二、预期目标（一）总体目标本项目围绕“表观遗传变异是肺癌发生发展的关键”这一核心问题，从表观遗传变异产生机制、表观遗传变异规律、表观遗传变异影响的重要信号通路、细胞重编程机理诸方面有机地整合在一起，系统研究表观遗传变异在肺癌发生、肿瘤转移等各阶段的作用以及对肿瘤微环境的影响, 为发展肺癌的早期诊断和有效治疗提供新思路和新方法。本项目的实施将进一步加强国内多学科领域的衔接和交叉，形成高水平的学术研究人才梯队；将深入揭示表观遗传变异在肺癌发生、发展中的作用和机制，使我国肺癌的表观遗传学研究迈入国际先进行列，为严重影响人类健康的重要疾病，肺癌的早期诊断和有效治疗奠定坚实的基础。（二）五年预期目标1、发现新的参与肺癌发生发展的组蛋白修饰酶；发现肺癌发生发展各阶段表观遗传修饰因子的突变和异常表达规律；阐明表观遗传修饰因子的突变在肺癌发生发展中的作用；揭示肿瘤表观组变异起源和细胞重编程机制；2、发现肺癌发生发展各阶段，表观遗传变异规律，揭示受累关键基因和关键信号通路；3、阐明表观遗传变异在肿瘤微环境形成和肿瘤转移中的作用；提出并验证转移性肿瘤干细胞学说；4、力争取得在1-2项在国际上具有重大影响的研究成果，研究成果被国际学术会议作为特邀演讲交流达15余次以上。SCI论文3050篇，力争在影响因子10以上的专业学术期刊发表论文10余篇以上，及国家发明专利、实用专利等受理或授权10项左右。5、培养国家教育部“长江学者奖励计划”岗位或讲座教授1-2名，中科院“百人计划”入选人才2-3名，国家杰出青年科学基金获得者2-3名。培养博士后2030名，培养科研型博士生50名，硕士生100名。三、研究方案（一）学术思路表观遗传变异不仅是肺癌发生的早期事件、是肺癌发生的原动力；可以讲，没有不存在表观遗传变异的肿瘤；即使是遗传性肿瘤，如RB基因突变引起的视网膜母细胞瘤，突变基因的主要作用也是通过表观遗传变异实现的。表观遗传变异的作用贯穿于肿瘤发生发展全过程，赋予肿瘤细胞高度多样的表型特征，获得转移能力。我们紧密围绕“表观遗传变异是肿瘤发生发展的关键”这一核心问题，研究肺癌表观变异的起源、表观遗传修饰变异作用的基因位点、表观遗传修饰变异影响到的关键基因和信号通路、表观遗传修饰因子在癌细胞表观重编程中的作用以及表观遗传修饰变异如何促进肿瘤发生、转移；特别关注表观遗传变异在肿瘤干细胞形成、维持、以及转移性肿瘤干细胞形成中的作用；同时考虑表观遗传修饰变异在肿瘤微环境中的角色，探讨肿瘤细胞和微环境的依存关系。通过上述相互补充、相互关联、层层深入的研究，深入揭示表观遗传变异在肺癌发生、发展中的作用和机制，使我国肺癌的表观遗传学研究迈入国际先进行列，为严重影响人类健康的重要疾病，肺癌的早期诊断和有效治疗奠定坚实的基础。（二）技术途径第二代测序技术、芯片技术、ChIP-Sequencing技术的出现改变了人们传统的研究策略，更多地从表观组的角度进行研究。本项目将根据研究任务和目标，充分利用北京基因组所高通亮测序技术，已有实验技术平台和公共信息资源，集中优势力量，以”肺癌表观遗传变异”为核心，以生化、遗传、细胞生物、表观组和生物信息等为主要研究手段，阐明表观遗传变异在肺癌发生发展中的作用与调控机制。1、表观组变异研究：利用高通量二代测序技术发现基因组范围表观修饰因子突变，利用ChIP-Sequencing和甲基化位点测序获得表观组修饰信息；利用RNA-seq和芯片杂交获得全基因组基因表达信息。2、信号通路分析和网络构建：利用生物信息技术整合各种实验数据，构建肺癌表观遗传变异改变的重要信号通路，分析细胞重编程的实现路径和重要表观遗传变异事件。3、搭建关键技术平台研究表观变异作用：如我们利用前期建立的肿瘤干细胞平台研究肿瘤干细胞的表观遗传，利用PB转座子插入突变小鼠研究表观遗传修饰因子在肺癌发生中的作用;利用三维立体模型研究表观遗传对肿瘤细胞极性的调控；利用活体成像研究肿瘤转移。4、多层次、多方位展开研究：我们不仅研究肿瘤细胞本身，还研究肿瘤细胞赖以生存的为环境、环境中的趋化因子、miRNA等，从正常肺组织、到肺癌组织，从肿瘤干细胞到转移肿瘤干细胞。点面结合，全方位综合研究肺癌发生机制。四、年度计划第一年：研究内容：1. 肺癌及正常人样本的收集及整理，完成60例肺癌样本的外显子测序，发现肺癌细胞中表观遗传修饰因子突变。2. 从肺癌样品提取肺癌干细胞。建立甲级化DNA文库和mRNA文库为高通亮测序作准备。3. 通过半定量免疫荧光染色法和western blot法比较分析肺癌组织、癌旁组织中H3K4、H3K9、H3K27、H3K36和H4K20等各种甲基化的水平变化，分析各甲基化组蛋白与肺癌恶化程度的相关性。检测候选组蛋白去甲基化酶AlkB4-7，UTX和JMJD3的蛋白表达和mRNA表达水平，分析其表达水平的变化与组蛋白甲基化水平的关联。4检测极性蛋白表达异常情况；研究转录中介体是否参与并调控ras-active肺癌细胞株生长、成瘤等肿瘤生物学特性。 5肺癌细胞组蛋白乙酰化高通量测序；建立肺癌不同转移能力细胞系模型； 建立从肺癌细胞中分离CSC, CSCM及non-CSC的方法。6构建过表达CXCL16/CXCR6或低表达（Knockdown）的lentivirus 表达系统及相应的稳定表达细胞系。测定体外CXCL16刺激前后肺癌细胞的细胞的生物学行为变化。分析肺癌细胞分泌的微泡中含有的miRNA表达谱，以及肺癌细胞和周围正常组织细胞中miRNA，mRNA的表达谱。目标：1 完成首批60例肺癌样本的外显子测序，发现数个肺癌细胞中表观遗传修饰因子突变。2 建立肺癌及正常人样本甲级化DNA文库和mRNA文库3 完成肺癌组织、癌旁组织中H3K4、H3K9、H3K27、H3K36和H4K20等各种甲基化的水平测定。4 完成构建过表达CXCL16/CXCR6或低表达（Knockdown）的lentivirus 表达系统及相应的稳定表达细胞系。第二年：研究内容：1 完成肿瘤干细胞和正常细胞的全基因组DNA甲级化文库和转录组文库的测序。利用生物信息学的方法，分析出不同细胞的全基因组甲级化图谱和转录组图谱。2利用sequenome技术，以400例正常人为对照，对外显子测序中发现的突变进行验证。构建肺癌模型小鼠。3利用ChIP-seq方法建立肺癌发生发展过程中的组蛋白甲基化图谱，筛选与肺癌相关的组蛋白甲基化调控蛋白。4分析特定极性蛋白的启动子区域受甲基化调控的规律，结合课题一构建的不同类型细胞全基因组DNA甲基化图谱和转录组，分析肺癌细胞中极性蛋白表达异常，以及表观遗传修饰对极性蛋白表达的调控机制，构建肺癌小鼠模型。 5分析用DNA甲基化和组蛋白去乙酰化的化学抑制剂抑制表观修饰后对肺癌转移的影响；在体外和体内模型中分析和验证肺癌干细胞分离不同亚群的干性和转移能力。6分析改变CXCL16/CXCR6基因在肺癌细胞的表达能否影响细胞的生物学行为和调控信号传导通路。目标：1 完成肿瘤干细胞和正常细胞的全基因组DNA甲级化文库和转录组文库的测序。构建不同细胞的全基因组甲级化图谱和转录组图谱。2 构建PB插入突变肺癌模型小鼠。3 筛选出数个肺癌相关的组蛋白甲基化调控蛋白。第三年：研究内容： 1分析比较不同细胞间DNA甲级化和转录组的差异，探索DNA甲级化对基因表达调控的影响，进一步揭示表观遗传变化对体细胞转换为肿瘤细胞的作用机制。使用第二代测序仪对全基因组测序的结果进行验证。2利用表观遗传修饰因子突变小鼠与肺癌模型小鼠，研究在表观遗传修饰因子突变背景下肺癌发生、发展的变化和不同的临床表型。3利用ChIP-seq方法建立肺癌发生发展过程中的组蛋白甲基化图谱，筛选与肺癌相关的组蛋白甲基化调控蛋白。 4完善肺上皮细胞的3D培养系统，鉴定表达异常的极性蛋白对肺上皮细胞的恶性转化作用；筛选与Ras信号有协同作用的极性蛋白；探究转录中介体与Ras-active肺癌的发生发展过程相关性。在动物体内研究Mediator复合体相关亚基是否参与、调控了肿瘤的发生发展过程。 5利用PB插入突变研究肺癌转移关键表观遗传因子对癌转移的影响。分析用RNAi干扰的方法抑制表观修饰或相关基因后对肺癌转移的功能。分析组蛋白乙酰化酶CBP以及LIFR/gp130-STAT3通路在肺癌细胞中的信号转导机制和对肺癌细胞表观修饰的调控作用。6构建CXCR6-/- 和CXCR6GFP 及FAP-/- 和FAPGFP的小鼠模型。分析微泡miRNA在细胞通讯中的作用。目标：整合所有实验数据，确定几个通过调控组蛋白甲基化干预肺癌发生发展的标志物，发表5-12篇SCI研究论文,1-2篇IF>10的研究论文,申请专利2-3项。第四年：研究内容1通过生物信息分析，建立肺癌发生发展过程中受表观遗传调控的核心分子网络。对网络中的关键及核心元素开始进行功能分析。2 整合表观遗传修饰因子突变数据、表达谱数据、DNA甲基化数据等，建立肺癌细胞重编程的网络，探讨表观遗传修饰因子在肿瘤细胞重编程中的作用和机制。3 构建组蛋白去甲基化酶调控靶点的基因敲除小鼠（传统型或者组织特异型），研究被敲除基因与肺癌发生的关系。综合分析组蛋白，去甲基化酶与其作用靶点在肺癌发生发展中的作用机制。利用细胞为载体，研究组蛋白甲基化程度的调控机制，甲基化酶与去甲基化酶对组蛋白作用的时空关系。4 在极性基因表达异常的3D系统中，通过差异基因表达谱技术，鉴定出肺癌发生的重要信号通路因子；鉴定此系统中极性基因表达异常在改变细胞极性，及其肺癌细胞的侵袭力中的作用；探究转录中介体于Ras-MAPK信号通路的相互作用机制。根据上述研究所得，在体小鼠模型中验证肺癌相关重要信号通路。5 继续分析PB插入突变研究肺癌转移关键表观遗传因子对癌转移的影响。分析LIFR/gp130-STAT3通路对肺癌细胞转移性能的调控作用。6 利用CXCR6-/- 和CXCR6GFP的小鼠模型中，检测阻断CXCL16/CXCR6趋化因子轴旁分泌环后，肺癌的生长及与炎性细胞的浸润的相关性。分析肺基质中的正常成纤维细胞及癌旁CAF、基质干细胞表达CXCR6。确定微泡miRNA在细胞通讯中的作用。目标：整合所有实验数据，确定几个通过调控组蛋白甲基化干预肺癌发生发展的标志物，发表10-18篇SCI研究论文,4-5篇IF>10的研究论文,申请专利3-4项。第五年：研究内容：1 继续对网络中的关键元素进行分析，研究和发现相关的诊断或治疗癌症的新方案。2 利用裸鼠制备肺癌模型，验证此类标志物与肺癌进展的相关性。结合临床，获得大量肺癌病人的癌组织与血液，检测上述基因的表达水平，探讨此类基因在临床上作为肺癌预测，发展进度监测的标志物的可行性。 根据组蛋白甲基化调控机制，以及组蛋白甲基化与肺癌发生发展的相关性，探讨通过干预组蛋白甲基化治疗肺癌的可行性。3 寻找极性蛋白在转录水平所直接调控的下游信号因子，进一步运用ChIP-seq实验分析受该极性蛋白调控的靶基因；利用microarray技术分析差异表达基因，筛选可能受Mediator复合体相关亚基调控的参与到肿瘤细胞恶性转化和转移的调控过程的基因。4 分析肿瘤环境中表观遗传因子PB转座子突变对肺癌细胞转移能力的影响。5 用FAP-/- 和FAPGFP的小鼠模型研究FAP基因 对肿瘤的影响及对 CXCL16/CXCR6趋化因子轴旁分泌环的反应。鉴定微泡特异性高表达的miRNA的靶基因，并研究微泡miRNA对细胞微环境和肿瘤细胞迁移的影响。6 结果总结和汇报，论文撰写。目标：发现相关的诊断或治疗癌症的新方案.整合所有实验数据，确定几个通过调控组蛋白甲基化干预肺癌发生发展的标志物，发表15-20篇SCI研究论文,4-5篇IF>10的研究论文,申请专利3-5项。一、研究内容本项目以我国人口健康需求为导向，瞄准国际科学前沿，围绕上述关键科学问题，结合国外最新研究进展和国内已有工作基础，提出的主要研究内容为：综合运用分子遗传学、细胞生物学、生物化学、蛋白组学、生物信息和模式生物等交叉学科手段，以表观遗传变异调控机制为主线，以肺癌表观遗传的基因组水平的变异和来源、修饰因子突变、关键基因和信号通路、肿瘤和微环境互作研究为突破口，重点开展肺癌发生发展过程的表观遗传变异的作用和机理的研究，阐明肺肿瘤细胞恶性转化的表观遗传学机理。各课题组主要研究内容分列如下：课题1: 全基因组水平分析肺癌发生发展过程中的表观遗传变异在癌症发生过程中，伴随着基因的突变，表观遗传也产生了显著的变异。近来很多研究发现在一些癌症发生时，先产生了肿瘤干细胞，然后再分化，形成肿瘤。在形成肿瘤干细胞时，表观遗传产生了如何的变化，哪些关键的变化导致了癌症的产生，现在是知之甚少。因此，本课题将从全基因组水平上研究表观遗传变异，寻找癌症产生发展过程中关键的表观遗传变异。主要研究内容如下：1、利用CD133、CD34、Scal-1和CD45等细胞表面分子为标记分离肺肿瘤干细胞和正常肺干细胞。使用第二代高通量测序仪在基因组水平测定肺细胞、肺干细胞、肺癌细胞和肺癌干细胞的DNA甲基化和基因表达， 构建上述不同类型细胞全基因组DNA甲基化图谱和转录组。2、应用生物信息学方法，分析比较不同类型细胞DNA甲基化和基因表达图谱的差别，揭示在肺癌发生发展过程中DNA甲基化调控基因表达的规律。3、运用系统生物学的方法寻找在癌症产生和发展过程中起核心作用的基因、信号通路及表观遗传变异，发现和构建出肺癌发生发展过程中受表观遗传调控的关键分子网络。课题2: 表观遗传修饰因子在肺癌发生发展过程中的作用及调控机制肺癌细胞存在大量表观遗传变异。表观遗传修饰因子的突变，以及异常的基因表达可能是细胞表观遗传变异大量产生的重要原因。表观遗传修饰因子的异常表达和突变在癌细胞表观重编程中无疑发挥了重要作用。本课题重点研究表观遗传修饰因子在肺癌发生、发展中的作用和机理。主要研究内容如下：1、利用外显子测序技术系统测定和分析正常肺组织、癌旁组织、肺癌细胞中表观遗传修饰因子突变和表观组变异之间的联系。研究和发现肺癌发生、发展各阶段表观遗传修饰因子的突变规律。2、利用表观遗传修饰因子突变小鼠与肺癌模型小鼠，研究在表观遗传修饰因子突变背景下肺癌发生、发展的变化和不同的临床表型；研究表观遗传修饰因子对肺癌发生、发展的作用；分析表观遗传修饰因子突变影响肺癌发生、发展的机理。 3、探讨表观遗传修饰因子在肿瘤细胞重编程中的作用和机制。肺癌发生存在细胞表观遗传修饰重编程过程，表观遗传修饰因子无疑在这一过程中扮演了重要角色; 但是，目前对于表观遗传修饰因子在细胞恶性转化过程中如何介导细胞表观遗传重编程知之甚少。我们计划整合表观遗传修饰因子突变数据、表达谱数据、DNA甲基化数据等，建立表观遗传修饰因子、转录因子、抑癌基因和癌基因、以及表观遗传修饰变化位点、基因表达之间的网络，分析引起细胞重编程的网络特征和关键节点和通路。课题3: 组蛋白甲基化及其酶在肺癌发生发展中的作用和机制组蛋白去甲基化酶调节组蛋白甲基化的程度和状态，调控癌症发生发展的相关基因启动子区域的组蛋白甲基化表观遗传。H4K20me3缺失发生在非小细胞肺癌前病变，并影响其预后的诊断。我们也证明了H3K27组蛋白甲基化修饰以及影响这一位点甲基化修饰的组蛋白甲基化酶EZH2和去甲基化酶UTX基因表达或酶活性在肺癌中发生变化，说明组蛋白甲基化调控与肺癌发生发展密切相关。为了进一步揭示组蛋白甲基化修饰在肺癌发生发展的作用和机理，为肺癌的诊断和治疗提供新的思路，本课题将进行以下研究： 1、利用免疫荧光染色、染色体免疫共沉淀和高通量测序等技术，绘制肺癌发生发展过程中组蛋白甲基化图谱及研究其调控酶的变化规律，发现组蛋白H3、H4甲基化状态、去甲基化酶活性及表达与肺癌恶性化的关联。2、从mRNA和蛋白质水平角度，检测肺癌发生发展过程中受组蛋白去甲基化酶调控的关键靶基因，包括肿瘤抑制因子和原癌基因；建立以组蛋白甲基化、去甲基化酶和靶基因三位一体为指标的肺癌恶性表型关联。3、综合运用生物信息学方法，蛋白去甲基化生化分析、质谱分析，以及蛋白荧光标记示踪技术，发现和鉴定肺癌发生发展过程中新组蛋白去甲基化酶。4、用小鼠模型研究组蛋白去甲基化酶UTX和JMJD3及候选基因ALKBH4-8与肺癌发生发展的关系（与第二研究组共同进行该项研究）。课题4: 肺癌发生发展过程中关键信号通路的表观遗传学调控极性蛋白参与胞内许多关键的信号转导通路的调控。其表达变异通常是导致上皮肿瘤癌变的早期和关键事件。多种极性蛋白的表达受表观遗传修饰调控。本课题将以信号通路上的极性蛋白为切入点，分析全基因组受表观遗传学调控的极性蛋白及其相关信号通路，以及他们与肺癌发生发展的关系。主要研究内容如下：1、应用课题1构建的不同类型细胞全基因组DNA甲基化图谱和转录组，分析肺癌细胞中极性蛋白表达异常，以及表观遗传修饰对极性蛋白表达的调控机制。分析可能受极性蛋白调控的细胞信号通路。2、应用人极性基因shRNA库在正常肺细胞系敲减极性基因表达，并在3维细胞培养条件下筛选影响细胞极性候选基因。然后在肺癌细胞中通过RNAi技术或者基因过表达改变细胞内的极性蛋白表达，观察这些候选基因对肺癌细胞转化、侵袭和迁移的影响，并分析受其调控的下游信号通路。3、Ras/MAPK信号通路是肺癌细胞中的一条重要的信号通路。极性蛋白Scribble抑制Ras-MAPK信号通路的传导，而Med23蛋白则是Ras-MAPK信号通路的靶标。Med23蛋白可能参与调控组蛋白表观遗传修饰。因此我们将深入探讨Scribble极性蛋白、Med23以及表观遗传修饰之间的相互作用，以及这种相互作用对肺癌发生发展的影响。课题5: 表观遗传调控在肺癌转移中的作用和机制癌症发生发展的最终形式是肿瘤的转移，而转移导致了90%以上的癌症患者死亡。可以说转移前后的肿瘤是两种完全不同的疾病状态。对肿瘤转移分子机制的研究是肿瘤学的核心问题。此前研究表明表观遗传变异可能对癌细胞的转移能力有重要的调控作用。本课题以肺癌的转移为核心，研究表观遗传变异在肺癌转移过程中的作用和机制，包括导致这些表观遗传变异的信号通路和受表观遗传变异影响的转移功能基因。主要研究内容如下:1、 分析肺癌转移过程中发生的表观遗传变异。利用ChIP-Seq技术，测定和分析肺癌转移细胞的全基因组DNA甲基化变异，以及基因组水平的组蛋白甲基化和乙酰化修饰图谱的变异。旨在发现肺癌转移过程中发生的特异性表观遗传修饰变异，为临床诊断和预后提供有价值的表观遗传修饰标记，并为以下的表观遗传在肺癌转移中功能和机理的研究提供线索。2、以上述研究发现的表观遗传修饰为目标，利用化学药物和shRNA干扰技术，以及表观遗传修饰因子的突变小鼠研究这些表观遗传修饰受到抑制或者其表观遗传因子缺失的情况下，癌细胞转移能力的变化。同时，利用基因表达芯片技术发现受这些表观遗传修饰所影响的基因，并研究它们在肺癌转移中的作用。3、研究表观遗传修饰关键信号通路对转移性肺癌干细胞的调控机制。为了研究肺癌转移表观遗传修饰的上游调节机制，我们将以前期工作为基础，重点分析LIFR/gp130-STAT3信号通路对癌细胞的表观遗传修饰因子的调节，以及此信号通路和受其调节的表观遗传修饰对转移性肺癌干细胞维持自我更新能力和转移能力的作用。课题6: 肺癌细胞表观遗传修饰对肿瘤微环境的影响和机制表观遗传变异不仅可以改变肿瘤细胞本身的生物学特性，而且可以通过改变肿瘤的微环境，从而间接的影响肿瘤的发生发展。研究发现，肿瘤细胞分泌的多种趋化因子基因的启动子甲基化状态与癌症发生发展过程中关键基因的转录活性密切相关。经过表观遗传修饰的肿瘤细胞很可能通过扰乱趋化因子及其受体的表达实现肿瘤对微环境的改造；或者通过微泡转运microRNA调节癌旁细胞的基因表达，从而影响肿瘤的发展、转移。本子课题主要研究内容如下：1、揭示肺癌细胞高分泌趋化因子的表观遗传学调控机制。2、探讨表观遗传调控的肺癌细胞高分泌趋化因子是否通过自分泌环直接促进癌细胞本身的恶性发展和转移。3、探讨表观遗传调控的肿瘤细胞高分泌趋化因子是否通过旁分泌环募集炎症细胞、淋巴细胞、CAF等, 形成肿瘤转移的微环境，间接推动肺癌的发展、转移。4、研究肺癌微环境中的微泡microRNA对肿瘤的增殖和转移的作用。