近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究毕业论文.doc

中国石油大学（华东）毕业设计（论文）近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究学生姓名： 学 号： 专业班级：环境工程 指导教师： 摘 要胶州湾和海南岛海域优美的自然环境与独特的地质演化进程吸引了众多中外科学家的关注。这种复杂的地质演化过程必然也伴随着生物的不断进化。本实验中涉及的hzo和amoA基因序列可用于物种多样性的分析，相对于比较DNA所有序列，更简便并具有代表性。本实验通过对胶州湾A5站位微生物hzo基因以及海南岛海域E505站位amoA基因的PCR扩增，转入感受态大肠杆菌，酶切分析，测序比功能比对等一系列步骤，分别建立这两站位的微生物系统树。本实验所采集的样品来自于胶州湾和海南岛海域，实验采用对沉积物进行hzo和amoA基因文库构建进一步测序分析进化关系的方法。通过建立的系统发育树可以对两个站位的微生物多样性进行评估。本次实验证明胶州湾A5站位hzo基因多样性较少而海南岛海域E505站位amoA基因有较高多样性。关键词：厌氧氨氧化；hzo基因；amoA基因ABSTRACT The beautiful natural sceneries and the unique process of geological evolution of Jiaozhou Bay and Hainan Island waters are attracting more and more Chinese and foreign scientists. The complex geological evolution may go with continuous evolution of living beings. This study analyzed the archaeal and bacterial diversity by the construction of gene sequences that can be applied to the analysis of species diversity. In this experiment, sediment DNA from Jiaozhou Bay and Hainan Island coastal areas was extracted; hzo genes and amoA genes were amplified through PCR with degenerate primers justified by former researches, inserted into plasmids, which were then transformed with competent E.coli cells, analyzed by RFLP, and sequenced. After series of procedures, phylogenetic trees based on hzo and amoA genes were constructed, which is a good indication of microbe diversity. The sediment samples used in this study were collected from the Jiaozhou Bay and Hainan Island Waters. This study analyzed the archaeal and bacterial diversity by the construction of hzo and amoA gene libraries. From the two phylogenetic trees conducted, we can see hzo genes of staion A5 of Jiaozhou Bay has low diversity while amoA genes of station E505 of Hainan Island has high diversity.Keywords: Anammox; hzo genes; amoA genes目 录第1章 前言11.1 胶州湾生态环境11.2 厌氧氨氧化细菌11.3 该实验涉及的的分子生物学技术31.3.1 PCR技术31.3.2 限制性酶切61.3.3 琼脂糖凝胶电泳71.4 本文的研究目的及意义81.4.1 本文的研究目的81.4.2 本文的研究意义9第2章 实验部分102.1 材料及仪器102.1.1 胶州湾的地理位置及站位来源102.1.2 实验药品102.1.3培养基112.1.4主要仪器设备112.2 实验步骤122.2.1 宏基因组DNA的提取122.2.2 hzo与amoA基因序列的PCR扩增142.2.3 PCR产物的乙醇沉淀152.2.4 PCR产物纯化162.2.5 纯化PCR产物的连接162.2.6 感受态细胞的制备162.2.7 转化172.2.8 克隆的PCR扩增182.2.9 PCR产物酶切反应192.2.10 测序及保种192.2.11 测序结果分析20第3章 实验结果分析223.1 PCR图223.1.1 胶州湾A5站位PCR图223.1.2 海南岛海域E505站位PCR图243.2 酶切图263.2.1 胶州湾A5站位酶切图谱273.2.2 海南岛海域E505站位酶切图谱313.3 结果分析373.3.1 建立系统发育树383.3.2 结果分析与讨论38致谢42参考文献43第1章 前言1.1 胶州湾生态环境胶州湾位于胶南威海造山带与胶莱坳陷东南缘的复合部位的中部，是黄海伸入内陆的天然海湾，地质构造复杂，具有港口、外贸、旅游和海洋科研等多种开发功能，对青岛的经济发展有着举足轻重的作用。胶洲湾水域总面积约423km3，平均水深6.8 m，是一个典型的半封闭海域。 近年来，由于城市化进程的加快，工业和城市废水以及养殖污水大量排放，导致近岸海域水体富营养化较为严重。胶州湾的主要污染物是营养盐N、P1，沿岸有许多市区工业废水和生活污水的排污河，故N、P入海量相对逐年增长。因此，胶州湾环境和浮游植物都发生了很大变化，这对胶州湾海洋生物资源影响巨大，引起了海洋生物种类和数量的变化，造成赤潮频繁的发生和其面积扩大。1.2 厌氧氨氧化细菌 厌氧氨氧化(ANAMMOX：Anaerobic Ammnonium Oxidation)是指在厌氧的条件下，微生物直接以NH4+作为电子供体，以NO2-作为电子受体，将NH4+和NO2-转变成N2的生物氧化过程。在此过程中，氨氮的氧化无需分子态氧的参与，而亚硝酸盐的还原也无需有机物的参与。 Craaf等采用N的示踪实验研究表明，Anammox是通过生物氧化的途径实现的，过程中最可能的电子受体是羟胺（NH2OH），而羟胺本身是由亚硝酸盐产生的。他们提出可能的反应途径见图1-1所示。NH4+ NH2OH NO2- NO3- 2H N2H4 2H N2H2 N2 图1-1 厌氧氨氧化反应模型2氨被羟胺氧化形成联氨：联氨产生氮气和还原当量，后者被用于亚硝酸盐产生更多的羟胺亚硝酸盐被氧化成硝酸盐产生还原当量用于细胞生长厌氧氨氧化过程涉及的化学反应为：NH3+NH2OH N2H4+H2ON2H4 N2+4HHNO2+4H NH2OH+H2ONH3+HNO2 N2+2H2OHNO2+H2O+NAD+ HNO3+NADH2 根据上述的模型，厌氧氨氧化菌以羟胺为氧化剂，把氨氧化成联氨：联氨再氧化成氮气。在这个模型中，亚硝酸盐具有三种功能：一是作为羟胺的前体；二是作为电子汇，处置反应产生的电子；三是作为能源，在其氧化为硝酸盐的过程中产生还原当量。 Hooper等3对亚硝化单胞菌属细菌N. eurapaea的生物化学进行了相当充分的研究，主要集中在氨单加氧酶和羟胺氧化还原酶HAO。Van de Graaf等4用15N标记N化合物研究厌氧条件下的氨氧化，在Hooper等研究的基础上，提出了厌氧条件下以亚硝酸盐为电子受体的氨氧化代谢途径，如图1-25H-NIRHH NH2OH4e 细胞质HAO H2N=NH2 Anammox体4H+ NO2- NH3 N2 图1-2 Brocadla anammoxidans生化反应模型 按照这个模型机理，亚硝酸盐还原酶（NIR）定位于细胞膜的细胞质一侧，催化亚硝酸盐还原成羟胺；假设存在一个跨膜的联氨水解酶(HH)，催化羟胺和氨缩合成联氨氧化酶（HZO，可能是HAO）定位于细胞膜的厌氧氮氧化体一侧，催一化联氨转化为氮气；释放的电子通过传递链交给亚硝酸盐还原酶。 以上即为厌氧氨氧化细菌体内的生化反应机理。厌氧氨氧化菌的发现，改变人们对传统氮的生物地球化学循环的认识：反硝化细菌并不是大气中氮气产生的唯一生物类群。越来越多的证据表明，细菌厌氧氨氧化与全球的氮物质循环密切相关，估计海洋细菌的厌氧氨氧化过程占到全球海洋氮气产生的一半左右。由于氮与碳的循环密切相关，因此可以推测，细菌的厌氧氨氧化会影响大气中的二氧化碳浓度，从而对全球气候变化产生重要影响。另外，由于厌氧氨氧化菌实现了氨氮的短程转化，缩短了氮素的转化过程，因此为开发更节约能源、更符合可持续发展要求的废水脱氮新技术提供了生物学基础。1.3 该实验涉及的的分子生物学技术 1.3.1 PCR技术 1.3.1.1 PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理是以欲扩增的PCR为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。与活体内DNA的半保留复制一样，PCR反应中，引物不仅能以原始DNA为模板进行扩增，而且也能以新合成的复制链为模板进行扩增。随着反应的不断重复,原始模板DNA的数量保持不变而新合成的复制链则逐渐增加。理想的情况下，PCR反应中DNA分子是以指数增长的，即每一个PCR反应结束，DNA的数量将变成2n个，n代表循环次数。但在实际反应中，由于聚合酶的活性不同，模板的纯度，PCR反应仪器的差异等因素的影响，不同的PCR反映扩增效率不同，DNA的数量不是以2n增加,而可用(1+X)n计算，X表示平均每次反应的扩增效率。另外，在反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的，它取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率及DNA聚合酶的活性及非特异性产物的竞争等因素。通常情况下,每完成一个循环需210分钟，PCR反应到26-28个循环就基本达到平台期,此时就可以结束PCR反应。因此经过24小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。在这个毕业设计课题中，我们选择的是30个循环，可以说是刚刚到达平台期。这段时间所复制的DNA片段已经足够多，所以平台期的差值可以忽略不计。PCR反应体系由引物、Taq酶、dNTP、模板、Mg2+组成，其中各成分的功能如下： 引物:引物是一段寡核苷酸序列,类似于半保留复制中的冈崎片段。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。在PCR反应中,引物一旦与模板链结合,在DNA聚合酶的作用下，引物就会从3'端开始延伸。随着反应的进行，反应体系中引物的量会不断减少。 Taq酶全名为Taq DNA多聚酶（Taq DNA Polymerase），它在DNA的复制中起聚合作用。 dNTP:即四种核苷酸,随着反应的进行,反应体系中dNTP的量会不断减少。 模板:典型的PCR反应是用DNA做为模板核酸（靶基因）,它的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一。 Mg2+浓度:由于DNA聚合酶活性需要一定的离子环境,所以Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR 反应中,Mg2+浓度过高,反应特异性降低，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。 1.3.1.2 PCR污染及对策 PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。在我们的实验中，出现污染的原因主要有以下几个方面：一、模板间交叉污染：DNA模板在提取过程中，由于移液枪污染导致模板间污染。二、PCR试剂的污染:主要是由于在PCR体系配制过程中，由于移液枪、离心管、ddH2O及其它溶液被DNA模板污染。三、PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。在防止污染方面，我们应该注意以下几点：(一)移液枪：移液枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。(二)防止操作人员污染，使用一次性手套、枪头、小离心管应一次性使用。(三)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准模板为宜，并注意交叉污染的可能性；每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增模板的样品作阴性对照。(七)选择质量好的离心管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出。 1.3.2 限制性内切酶酶切 限制性内切酶（Restriction Endonuclease）是一类能够识别DNA的特异序列并在识别位点剪切双链DNA的内切酶。主要存在于原核生物中，大多数来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制修饰体系，限制外源DNA、保护内源DNA5。限制性内切酶可分为三类6:I类和II类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。I类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而III类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。II类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列8。II类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，有少数酶识别更长的序列或简并序列。II类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端。在我们这个实验中来源于不同菌株的DNA分子，由于结构和序列的不同，用MspI和HhaI限制性内切酶作用后会形成大小不等的一些片断。这些片断通过凝胶电泳可以分离开来，经EB染色后，在紫外光下会形成具有生物种或株特异性的图谱。分析比较这些图谱就可以达到我们区分不同基因序列的目的。在这个研究中，我们选择的是MspI（以后简称M酶）和HhaI（以后简称H酶）两种限制性内切酶，通过这两种酶切图谱的分析，我们便可以将不同基因序列初步划分的。 1.3.3 琼脂糖凝胶电泳 1937年首创纸电泳技术后，电泳的种类和应用在深度和广度两方面均发展迅速，已成为分子生物技术中分离生物大分子的重要手段。电泳技术的发展已有近80年的历史，在早期电泳技术得到了迅猛发展，许多新的电泳技术不断涌现，尽管最近几年电泳发展的脚步缓慢了，但在某些领域仍取得了突破，如空间电泳技术的出现。如今电泳技术正向着全面化、综合化、简便化及实用化方向发展，同时电泳芯片的发展也必然会给电泳技术带来一场新的技术革命8。其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选的标准方法9。这当中又以琼脂糖凝胶电泳作为基础。 琼脂糖凝胶电泳的原理10:琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是-半乳糖和3.6-脱水-l-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于ldh、ck等同工酶的检测。整个过程如下：凝胶制作配制凝胶的浓度据实验需要而变11一般在0.83.0之间。随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度12。在这里，我们选择的是后一种方式。点样将移液器基本垂直点样孔，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头尖端进入点样孔即可将样品注入孔内，千万不可将枪头尖插至孔底，并点上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。在这个过程中，我们一般选择的是25个点样孔的凝胶，每个点样孔注入样品量为3l。电泳在PCR产物电泳时，选择电压90V，时间50min。而在酶切电泳中，我们选择的是电压65V，时间上在1h、1h20min、1h40min时各成一次像（其中HhaI酶切体系要在2h时再成一次像）。 在我们这个实验中，需要注意的问题有：一、灌胶模具要保持清洁无污染，除了无核酸、蛋白及其它可见杂物进入凝胶外，最主要是排除EB在制胶模具的沉积。二、电泳缓冲液一般可重复使用多次，但若出现浑浊情况就应及时更换，否则影响电泳分辨率。每次电泳前将电泳缓冲液重新摇匀，使正负极的pH基本一致。三、琼脂糖应完全熔化呈清澈、透明的液体。当胶冷却至5060时加入EB（EB见光易分解，但耐高温，在230以上才会分解），充分摇匀；在5060时倒人模具制胶，动作要轻，避免产生气泡，若温度过低，则胶冷却后不均一，电泳谱带弯曲。要保证胶的凝固时间，确保凝胶形成稳定均一的孔径，一般在胶冷却3045min后再拔梳子点样电泳。四、上样Buffer一般采用甘油增加样品比重13，但放置一段时间后会使其沉降不均。因此，使用时应先摇匀后再取用，否则样品会漂移散失。1.4 本文的研究目的及意义 1.4.1 本文的研究目的近年来，由于城市化进程的加快，工业和城市废水以及养殖污水大量排放，导致近岸海域，水体富营养化较为严重。因此，胶州湾环境和浮游植物都发生了很大变化，这对胶州湾海洋生物资源影响巨大，引起了海洋生物种类和数量的变化，造成赤潮频繁的发生和其面积扩大。近期的研究发现，厌氧氨氧化菌实现了氨氮的短程转化，缩短了氮素的转化过程，因此为开发更节约能源、更符合可持续发展要求的海水脱氮新技术提供了生物学基础。在厌氧氨氧化细菌的脱氮过程中，联胺氧化还原酶无疑起着关键性的作用，而hzo基因即控制联胺氧化还原酶合成的片段基因，所以，我们要截取这段关键的基因片段来进行我们的研究。海南岛海域位于我国南海西北部，处于热带北缘，具有丰富的热带海洋生物资源。AOA能进行氨氧化作用，在海洋氮循环中起着重要作用。因此，人们可以通过本研究进一步分析该海域的氮循环状况及生态环境状况；此外，该海域受当地人们生产生活影响较大，其生态环境与人类活动密切相关，本研究也可以在海洋生态保护，海洋污染治理等方面提供基础信息。1.4.2 本文的研究意义越来越多的研究表明在海底深部沉积物中蕴藏着巨大的微生物生物量、生物和分子多样性以及复杂多样的生理生态功能过程。海底深部生物圈微生物正成为生命起源和进化、地球系统进化和演化、全球变化和海洋生物技术开发利用的研究焦点。我们所做的课题正是在这一大背景下应运而生。对胶州湾hzo基因以及海南岛amoA基因的研究目前还处在空白阶段，通过对其研究分析可以得出在人为影响下，对微生物发育进化的影响。通过微生物同源性的研究，思考在相似的生态环境微生物的相似度，对海底沉积物中厌氧氨氧化细菌以及氨氧化古菌的研究对于以后更深入的研究海洋氮循环、生命起源和进化、海洋生物技术的开发利用都具有非常重要的意义。第2章 实验部分2.1 材料及仪器 2.1.1 胶州湾的地理位置及站位来源图2-1 胶州湾的地理位置及站位来源图2-1 胶州湾的地理位置及站位来源 2.1.2 实验药品Fast DNA Spin Kit for Soil（MPTM, Biomedicals，cat#6560-200），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(OMEGA，D6492-01)，pMD18-T载体连接试剂盒（大连宝生物工程有限公司），质粒提取试剂盒（OMEGA，D6943-01），氨苄青霉素（AMP 50 mg/ml, BBI），dNTP（Fermentas），BSA(200ng/µl)，引物(hzoF1, hzoR1)，引物（M13-D和RV-M, 2.5µg/ml），5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal, 20mg/ml），异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG, 24 mg/ml），低熔点琼脂糖（Biowest），溴化乙锭（天根生化科技有限公司），Genefinder（厦门百维信），Taq酶（Fermentas），D2000 Marker（北京天根生化科技有限公司），100bp DNA Ladder（北京天根生化科技有限公司），HhaI限制性内切酶、MspI限制性内切酶和TaqI（Fermentas），蛋白胨（Oxoid），酵母提取物（Oxoid），NaCl（上海国药集团），琼脂粉（上海国药集团），MgCl2（上海国药集团），甘油。2.1.3 培养基SOC培养基；固体LB(+Amp+X-gal+IPTG)培养基；固体LB（+Amp）培养基；液体（+Amp）培养基；表2-1 100mL液体SOC培养基配方 试剂用量胰蛋白胨2g酵母膏0.5g1mol/LNaCl1ml1mol/L KCl0.25ml2mol/L葡萄糖1mlSOC培养基（PH=7.0）：SOB培养基经高压灭菌后冷却到60，加入20ml除菌的1mol/L的葡萄糖溶液。液体LB培养基配方如表2-2，向LB液体培养基中加入15g/L琼脂则为固体LB培养基。表2-2 1L液体LB培养基配方试剂用量蒸馏水1000mL蛋白胨10g酵母粉5gNaCl10g2.1.4主要仪器设备（1）Fast Prep-24核酸提取仪（MP）；（2）电泳仪（DYY-7C型，北京市六一仪器厂）；（3）高压蒸汽灭菌器（YXQ-LS-30SII型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；（4）电子天平（AL204型，METTLER）；（5）层析实验冷柜（YC-2型，北京德天佑科技发展公司）；（6）制冰机（XB100型，GRANT）；（7）微生物操作超净工作台（DW-CJ-2F型，苏净集团安泰公司）；（8）电热恒温振荡水槽（DK-S24型，上海精宏实验设备有限公司）；（9）恒温培养箱，烘箱（上海福玛实验设备有限公司）；（10）电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9146A型，上海精宏实验设备有限公司）；（11）蓝盾501可见光凝胶投射仪（厦门百维信生物科技有限公司）；（12）PCR仪（TGRADIENT型和Tpersonal型）；（13）冷冻高速离心机（EPPENDORF，5810R型）；（14）普通离心机（SIGMA，1-14型）；（15）凝胶成像分析系统（Alpha Innotech,7-800-823-0404型）；（16）超低温冰箱（MDF-382E型，SANYO）；（17）pH计（HANNA，211型）；（18）旋涡振荡仪（QL-901型，其林贝尔仪器制造公司）；（19）微波炉（Galanz）；（20）冷冻恒温震荡器（DHZ-DA型，培英，太仓市实验设备厂）；（21）Haier冰箱（青岛海尔股份有限公司）；2.2 实验步骤2.2.1 基因组DNA的提取采用土壤DNA快速提取试剂盒（FastDNA Spin kit for soil）及Fast Prep-24核酸提取仪进行提取。DNA提取的质量决定后续实验的准确性和可靠性。每个站位均用0.3g左右的沉积物样品进行DNA提取。具体操作过程如下：（1）向lysing MatrixZ tube中加入0.3g沉积物混合样，加入1100µl裂解液溶解，裂解液组成为978µl磷酸钠缓冲液和122µl MT缓冲液。（2）将上述离心管放入FastPrep Instrument中，设定速度6.0，离心时间40s。（3）离心机预冷15min，至4，将上述离心管以14000×g离心30s。（4）将上清移入新的15ml Lysing MatrixZ tube中加入250lPPS，并颠倒10次将其混匀。（5）将上述混合液以14000×g离心5min，将上清移入另一新的15ml的Lysing MatrixZ tube中，将Binding Matrix Suspension摇匀，悬浮，向上述上清中加入1ml Binding Matrix Suspension。（6）用手颠倒混匀2min，将管放置于管架上静置3min(4)。（7）吸出500µl上清，将之丢弃，使余下的上清与Binding Matrix混匀，将600µl的混合液移入纯化柱中14000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将剩余的Binding Matrix全部移入纯化柱中14000×g离心1min，倒掉收集管中的废液。（8）向纯化柱中加入500µl SEWS-M，14000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，重复三次后，以14000×g离心2min，以使SEWS-M洗脱液被全部除去。（9）将纯化柱移入新的收集管中，室温下空气中干燥纯化柱5min。（10）加入50lDES，并且用枪头清搅滤膜或用手指轻弹使DNA溶解，静置1min，以14000×g离心1min，使DNA转移到收集管中。再加30l重复以上步骤，最后共得到80lDNA样品。（11）提取的DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，Marker用DNA/Hind。-80冰箱保存。 2.2.2 hzo与amoA基因序列的PCR扩增（1）准备工作：4离心机、制冰机提前打开，黄色切头枪头-20冰箱中预冷，灭菌ddH2O，大小离心管，大小枪头超净工作台紫外灭菌15min。所有的酶、Buffer、引物等都进行分装，防止污染。取出DNA，冰上解冻，用冷却的无菌切头黄色枪头轻轻吹打DNA，4，10000rpm离心5min。取1.5l DNA稀释20×，取出10ul的原液。剩余DNA放回-80冰箱。（2）梯度PCR实验，PCR体系12.5l，模板梯度分别为稀释的0.5，1，2，4，原液0.5，1.0l，具体配方如表2.3表2-3 梯度PCR12.5µl体系试剂体积(l)ddH2O根据模板的量补足12.5lBuffer1.25dNTP（2.5mM）1MgCl2（25mM）0.75BSA（200ng/l）1引物hzoF1（20M0.25引物hzo R1(10M)0.25模板DNA0.5，1，2，4，原液0.5，1.0Taq酶0.1阴性对照：模板用无菌ddH2O。电泳检测：将已制备好的琼脂糖凝胶水平放入装有TAE缓冲液的电泳仪中，使缓冲液没过凝胶，用微量移液器向胶孔中加入Marker和混有Loading Buffer的待测DNA样品后，100V电压电泳约30min。放入凝胶成像仪进行成像检测，根据条带的位置和清晰程度判断所扩增的目的基因的质量。选取特异性高的，非特异性扩增少，条带清晰的并且产量较高的浓度。 （3）平行PCR实验：梯度PCR实验，平行PCR实验同一天完成，防止因DNA降解产生误差。25l反应体系：做8个平行。表2-4 平行PCR 25µl体系试剂体积(l)ddH2O根据模板的量确定加入量Buffer2.5dNTP（2.5mM）2MgCl2（25mM）1.5BSA（200ng/l）2引物hzoF1（10PM）0.5引物hzo R1(10PM)0.5模板DNA 梯度PCR后最好的浓度Taq酶0.3 2.2.3 PCR产物的乙醇沉淀（1）将检测后的平行PCR产物全部加在一起，估计体积。（2）调整单价阳离子浓度。若DNA溶液中含有高浓度的盐，可用TE稀释（pH8.0）稀释，否则加入盐。（3）充分混匀溶液，准确加入2倍体积的冰冷乙醇（-20），再充分混匀（吹打）溶液。将此含乙醇的溶液置冰上或-20过夜使DNA沉淀形成。（4）第二天早上于0，13000rpm离心20min回收DNA。（5）小心移出上清液，注意不要搅动沉淀（有时沉淀是看不见的），用吸头吸尽附于管壁的所有液滴。（6）加500l 70%乙醇（先4保存），413000rpm离心4min。（7）重复步骤5。（8）离心管室温下敞口放置在实验台上，直至残留的液体挥发干。（9）将DNA沉淀重新溶解于适当体积（20µL左右）的缓冲液（一般为7.68.0TE）或无菌去离子水中，充分漂洗管壁。注：离心时离心管放置位置要有所标记，离心后，注意观察离心管底外侧，一般会有白色沉淀。 2.2.4 PCR产物纯化将乙醇沉淀后得到的DNA溶液用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，琼脂糖凝胶浓度1.5%，纯化方法按说明书操作。最后DNA溶解体积为20l。 2.2.5 纯化PCR产物的连接将目的基因连接到质粒载体PMD18-T上。表2-5 连接体系的配制组分体积(µl)PCR产物2PMD18-T Vector0.5Solution2.5于16连接2h后，4连接过夜。2.2.6 感受态细胞的制备（1）从新鲜的大肠杆菌Ecoli. DH5培养平板上接种一环菌落于5mlLB液体培养基，37培养过夜。（2）按0.5%1%的比例转接于100mlLB液体培养基，37培养24个小时，当菌液OD600约为0.3。（3）将菌液转移到预冷的50ml离心管中，冰浴30min，4000rpm离心10min。（4）去上清，沉淀悬浮于5ml预冷的0.1M的Cacl2溶液中，冰浴15min,4000rpm离心10min。（5）去上清，沉淀悬浮于2ml预冷的0.1M的CaCl2溶液中，冰浴10min，4000rpm离心10min。（6）去上清，沉淀悬浮于1ml预冷的0.1M的CaCl2溶液中，加入高压灭菌的甘油至终浓度15%。（7）取200l分装于1.5ml的离心管中，于-80保存，备用。2.2.7 转化准备转化用的液体SOC和固体LB培养基，以及100l/ml的AMP。LB固体培养基：每个平板至少30ml，每个库至少120ml。（1）用冷却的无菌吸头将重组载体加入200µl用CaCl2溶液制备的感受态细胞悬液中（重组DNA体积不超过10µl，DNA小于10ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。（2）将离心管放入预加温至42的循环水浴中，放置90s，不要摇动管。热激是一个关键步骤，准确达到热激温度非常重要。（3）快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。（4）每管加入800µl SOC培养基（提前备好，放于4待用），用水浴将培养基加温至37，然后将离心管转移到37摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因。（用低于50r/min的转速的摇床）。（5）将适当体积已转化的感受态细胞转移到含100µg/ml氨苄青霉素的LB固体平板上，用X-Gal（24µg/ml）和IPTG（40µg/ml）作为显色指示剂。进行梯度涂布，作50µl、100µl、200µl、400µl四个板。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。（7）倒置平板，于37培养，12-16h后可出现菌落。（8）取出培养板于4放置数小时使之显色。（9）从克隆数约200个的同一个平板上用平头牙签随机挑选约200个白色菌斑，将挑选出的阳性克隆在含100µg/ml氨苄青霉素的LB固体平板上用平头牙签划菌落，一个板15个左右标号，防止交叉污染，于37培养过夜（第四天下午挑克隆）。（10）第五天挑菌进行菌落PCR，并封好平板保存于4，并保持15天转接一次。或挑至试管，进行保种。 2.2.8 克隆的PCR扩增 将灭菌大号离心管按所需提DNA的菌落编号作好标记；加入100µlddH2O；按照管号挑取相应编号的单菌落于无菌超纯水中（注意控制挑取菌落的量），沸水中煮菌5min，然后立即置于冰上，使其迅速冷却，时间约为5min。擦干离心管壁，以12000rpm离心5min；用移液器取上清液20µl作为PCR模板于干净的小号离心管中待用。表2-6 25µlPCR体系组分体积(µl)ddH2O15.8Buffer2.5dNTP2MgCl22M13-D1RV-M1Taq酶0.2模板DNA0.5PCR反应程序如下：（1） 94 预变性3min（2）94 变性45s（3）58 退火1min（4）72 延伸90s （5）72 延伸