药用植物柴胡种子萌发特性与组织培养研究.doc

山西大学 硕士学位论文药用植物柴胡种子萌发特性与组织培养研究 姓名：徐丽霞 申请学位级别：硕士 专业：植物学 指导教师：郝建平 20060601 摘 要 柴胡是伞形科柴胡属的重要药用植物，也是我国、韩国及日本等国所使用的大宗药材。北柴胡和狭叶柴胡的有效成分含量最高，其中北柴胡又高于狭叶柴胡，因此中国药典将北柴胡 （又称硬苗柴胡）和狭叶柴胡，？ （又称软苗柴胡、红柴胡）作为药用柴胡的原植物并列为药用柴胡的正品。北柴胡广泛分布于我国的北方地区，其质量优良，用药需求量越来越大。然而，由于多年的盲目、过度挖掘，致使野生资源日益减少，只能满足需求量的，其余需要通过人工栽培来补充，因此近年来柴胡供应的重点逐步转移到人工种植上来。很多地区正积极推进柴胡的家种生产，在山西、河北、陕西、甘肃等省已形成定栽培规模。但由于柴胡外形相似，常常多种混生于同一产地，形态学鉴定比较困难，分类处理存在争议。经调查，北柴胡各产地均存在不同程度的品种混杂生长现象，既有北柴胡种下的不同变型，也有形态易混的近缘种，更有弓种栽培后出现的各种形态变异，造成了北柴胡药材的种质不纯、品种混杂，质量下降和参差不齐，影响到临床用药的准确性和中成药疗效的稳定性，以致影响到中国出口柴胡的声誉。 本实验根据柴胡种子的特性，通过对保存时间不同的红柴胡种子的生活力及发芽率进行测定和分析，确定了红柴胡种子发芽的适宜条件；以从田间直接采集的北柴胡和三岛柴胡为实验材料，进行了北柴胡茎段、叶片、叶柄、花芽等外植体的组织培养和三岛柴胡叶愈伤组织的诱导；研究了快速繁殖技术的建立和器官发生过程；探讨了不同的基本培养基和外源激素在柴胡愈伤组织形成、快速繁殖过程中的作用；应用石蜡切片法对不同产地的北柴胡的根和叶进行了显微结构观察和比较。 应用种子生活力快速测定法对柴胡种子生活力的测定结果表明：红柴胡当年种子发芽最适温度为，发芽率为；的水溶液浸种天可以显著提高红柴胡种子的发芽率，其发芽率上升为。隔年红柴胡种子基本丧失发芽力。 通过对北柴胡叶、茎、花芽和三岛柴胡叶愈伤组织的诱导发现，一是影响柴胡愈伤组织诱导率主要外源激素。柴胡幼茎和花芽是诱导愈伤 药用植物柴胡种子萌发特性与组织培养研究组织的合适材料，诱导出的愈伤组织致密且大部分具有分化能力；叶诱导出的愈伤组织疏松且褐化严重，基本不具分化能力。柴胡芽的快速繁殖中，是主要的影响因素，且培养基优于培养基。在；培养基中加入适量的水解酪蛋白可以促进苗的生长。 对种不同产地的北柴胡根和叶所进行的显微观察表明，产自甘肃的柴胡木质化程度比产自山西的要低；同是产自甘肃的栽培柴胡，陇西柴胡要比礼县柴胡的木质化程度低很多。说明柴胡的品质与产地和种植环境有一定的关系。种柴胡的叶在解剖结构上没有显著差别。关键词：柴胡；组织培养；快速繁殖；种子萌发；营养器官 颍酰? ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ； ， ， ， ， ， 仟色 ：； ； ； ； 综 述综述药用植物组织培养研究进展 药用植物是中药的重要来源，我国利用药用植物的历史源远流长。近年来，随着人们生活水平的提高，药用植物以其独特的优势越来越受到重视。尽管已经利用化学方法合成了种类繁多的药品，但由于天然药物所具有的诸多优越性使得药用植物的研究、开发和利用正在成为一个新的热点。药用植物种类繁多，植物体内所含的有效成分丰富、多样，具有开发新药的巨大潜力。随着现代药理学研究的深入，一些传统的药用植物会不断地被发现新的药理价值。与化学合成药相比，植物药以其毒性低、天然性更易为人们所接受。 我国野生药用植物资源相当丰富，据统计在种以上，其中常用的约有多种，主要依靠人工栽培的有多种。然而，由于需求量的上升和自然条件的日趋恶化，加之传统的中草药的获取方法又以采集和消耗大量的野生植物资源为代价，使得自然资源的再生能力大大下降，致使许多药用植物资源严重匮乏，尤其是那些生长缓慢、产量较低的贵重药用植物更是供不应求。在己出版的中国植物红皮书第卷中，共记载了种国产珍稀濒危野生植物，其中有药用价值的就有余种，包括人参、天麻、黄连、黄芪、杜仲、厚朴、巴戟天、平贝母、肉苁蓉等许多名贵药用植物【。 为了解决药用植物的供需矛盾，人们采用了人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中，有许多名贵药材如人参、黄连的生产周期长，如以常规方法育种、育苗，需要花费很长的时间才能获得产品；另一些药用植物如贝母、番红花因繁殖系数小、耗种量大，导致生产成本增加而影响其发展。还有一些药用植物，如地黄、太子参等等，由于病毒危害而退化，严重影响产量和品质。特别是一些价格昂贵的药用植物资源极少，生长缓慢，如黑节草等等；一些进口南药因种苗奇缺而影响扩大生产，如乳香等。而利用植物组织培养的手段再生药用植物资源，具有不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势。因此利用组织培养手段快速繁殖药用植物种苗，或者利用组织培养或细胞培养手段直接生产药物便迅速地发展起来。 药用植物组织培养技术的应用主要包括以下几个方面：是利用快速繁殖技术和脱病毒技术生产大量优质种苗以满足人工栽培的需要；二是通过愈伤组织和悬浮细胞的大量培养，从药用植物细胞或组织中直接提取药物或通过生物转化、酶促反应等生产药物；三是药用植物种质资源的保存和交换，利用组织和细胞低温保存种 药用植物柴胡种子萌发特性与纽织培养研究质，可大大节约人力、物力和财力，同时也便于种质交换和转移，防止有害病虫的人为传播。药用植物陕速繁殖 植物快速繁殖技术是国内外科学家关注的热点。年斯图尔德（）用胡萝根体细胞培养再生植株成功，为组织培养技术奠定了重要的基础，也使得年哈伯兰特（）提出的细胞全能性假说首次得到了科学的验证，国内外更多的学者也自此投入了植物组织培养的研究当中。随着研究的逐步深入，植物组织培养技术带来了植物形态、细胞、生理、生化、遗传、育种、农业、林业、园艺、医药等一系列学科的重要进展。 在利用快速繁殖技术大量生产种苗方面，一般着重于研究芽的诱导、试管苗的繁殖和生根以及进入常规管理前的炼苗，其目的在于解决种源不足、后代分离、传统营养体繁殖难、繁殖速度慢、以及传统种植成本高等问题；此外，快繁可以使苗木生产规格化、规模化及商品化，增加科技含量，如广藿香的组织培养和肉苁蓉的组织培养即以此为目的。 胚状体的形成是高等植物组织培养中存在的一种普遍现象。目前己在多种裸子植物和被子植物中发现有胚状体产生。胚状体类似于植物中的合子胚，是完整植株的雏形，很容易形成完整植株，由此可克服一些种类组培苗难以生根的问题。对于胚状体的研究不仅可以为扩大繁殖系数、拓宽变异谱打下基础，而且也为将来制造人工种子和进行外源基因的导入奠定了基础。因此药用植物胚状体的研究引起了广泛的重视，如郝建平等对蛇床胚状体的诱导和形成的研究，慈钟玲等对防风胚状体形成的研究，白雨等【】对半夏不同部位诱导胚状体和愈伤组织的试验等。 药用植物细胞培养利用植物细胞和组织培养进行植物药生产的优势（占地少，周期短，不受地区和季节的限制，便于开展大规模的生产；）无污染，无重金属积累，产物疏松，对于进行有用成分的生产和积累尤其便利；（）通过对细胞生长的自动控制和代谢过程的合理调节，有助于提高有用物质的含量， 并且避免了利用天然药用植物产生的无用部分的浪费；（）利用高产细胞株的筛选和复壮技术，可以获得有用物质几倍甚至几十倍于原植株 的培养物：（）对培养物的诱导或因其自发突变，可以产生原植株所没有的生理活性物质；）寿用植物细胞培养方法，可将一些较初级的化合物转化成医药上更为有效、高值 综 述 的药物；（）组织培养中的细胞生产速度要比植物的常速度快，接近于分生细胞的生长速度， 使得在较短的时间内获取大量的组织或细胞并从中直接提取或生产药物成为可 能【”。药用植物组织培养的进展 我国药用植物组织培养研究可以追溯至世纪年代。年，和首先开创了以生产橡胶为目的的橡胶茎愈伤组织培养并获得成功。多年来，利用植物组织和细胞培养技术生产药物引起了全国各学者的极大重视，年，罗士韦教授等首先报道了人参组织培养获得成功的研究成果。年，全国第一届药用植物组织培养讨论会召开，届时全国已有多个单位，余人从事药用植物组织培养研究。其中以广西药物所的罗汉果快速繁殖，山东大学生物系与荷泽地区中药材实验站的怀地黄去病毒研究和中国药科大学人参工业化生产的中间实验为代表性的研究成果。自此，我国药用植物的组培研究迅速发展。年，由我国科学工作者编写的有关专著药用植物组织培养问世。到目前为止，药用植物的组织培已经在以下几个方面取得了很大的进展。（）培养材料的日益丰富 据不完全统计，世纪年代初以来，我国己经对种以上的药用植物进行了组织培养研究，包括人参、三七、三分三、紫草、长春花、甘草、黄连、金线莲、白芨、番红花、铁皮石斛、绞股蓝、苦丁茶、南洋金花等。培养材料来源也从最初的药用植物的根、茎、叶、花、胚、果实、种子等组织或器官进行直接培养发展到从这些器官得到的愈伤组织、冠瘿组织和经诱导产生的发根，一直到目前的单细胞培养。（）培养规模逐渐扩大 随着培养技术从固体愈伤组织培养、液体静止培养悬浮培养发展到深层大罐发酵培养和液体连续培养，培养规模逐渐扩大，有些药用成分已实现了工业化生产。如利用紫草生产紫草宁、利用黄连生产小檗碱、利用人参细胞培养生产人参皂苷以及利用毛地黄细胞培养技术通过生物转化生产地高辛等均己实现了工业化生产。（）从培养物中分离的有效成分日益丰富 目前，从研究过的多种药用植物的组织培养物中亦己分离到超过种以上的有效成分，包括临床上广为应用的重要药物地高辛、长春碱、小檗碱等，其中药用成分含量超过原植物体的就有余种。尽管利用药用植物组织和细胞培养技术进 药用植物柴胡种子萌发特性与组织培养研究行有用物质的生产具有其独特的优势并获得了长足的发展，但仍存在着一些限制因素影响着这一技术的广泛应用。药用植物种质不纯，就是影响药用植物总体质量下降的一个很重要的因素。柴胡属植物研究药用柴胡使用情况及物种调查 复旦大学的潘胜利等”】重点对柴胡的药用品种进行了较详细的整理，记载柴胡属有种、变种和变型可药用，药材主要有北柴胡类、红柴胡类和竹叶柴胡类，但中国药典收载了个植物北柴胡和狭叶柴胡，其余在各地区作为地方习用药材，并指出柴胡在同一地区有数种混杂生长现象，且形态鉴别较困难，因而商品药材也多混杂。作为产量最大、分布最广的北柴胡，发现原植物种下有个变型：烟台柴胡 （ ）、北京柴胡（ ）、百花山柴胡（ ）和多伞柴胡（ ），这些变型的根目前均作为北柴胡混用。除此之外，还有四个近缘种常与北柴胡混生，即银州柴胡 （口），小黑叶柴胡（ ），黄花鸭跖（）和兴安柴胡（）。对混入的近缘种药材是否可作北柴胡药用，有作者对其主要活性成分柴胡皂苷进行含量测定比较，发现种主要成分柴胡皂苷、的含量明显低于北柴胡”。 王志有等对来自个省市的商品柴胡样品进行了鉴定与实地调查。结果表明，全国曾流通的商品柴胡主要有种，主流品种为北柴胡和狭叶柴胡，其次为膜缘柴胡（口）、锥叶柴胡（）、小黑叶柴胡旧 ）及黑柴胡（）。大叶柴胡阻）曼其变种有毒，近年来已停止使用。雾灵柴胡（口 ）、兴安柴胡（）、长白柴胡（）作为单物种商品已少见，只是少量混入主流品种中。药典中北柴胡和狭叶柴胡分布广、资源丰富、商品量大，为主流品种；膜缘柴胡、锥叶柴胡、银州柴胡（）、秦岭柴胡 、兴安柴胡、雾灵柴胡和长白柴胡为各地区使用的品种，药用效果显著，有学者建议将其载八颁布标准。此外，近年来以烟台柴胡的茎、叶为原材料研制的柴酮片疗效显著，但烟台柴胡分布的局限性使其不能满足用药的需要。为了找到代用品，对山东产北柴胡、烟台柴胡及浙江产北柴胡的茎叶部分的黄酮成分和黄酮总量进行比较分析，结果表明山东产北柴胡与烟台柴胡所含黄酮成分相同，总黄酮含量均为左右，故前两者可代替烟台柴胡使用：而浙江产北柴胡虽然黄酮含量为，但黄酮成分与上两者明显不同，在没有进步的药理 综 述试验和临床验证之前，不宣作为烟台柴胡的代用品。丁永辉等调查了甘肃柴胡属植物及柴胡药用品种，结果统计甘肃省柴胡共种，其中作柴胡药用的种，主流商品为北柴胡、狭叶柴胡、银州柴胡、黑柴胡、小黑叶柴胡和黄花鸭跖柴胡。地理分布 柴胡植物在我国分布于除海南省以外的所有省区，且常常在产地有数种柴胡混杂生长的情形。除膜缘柴胡产于云南外，我国的商品柴胡产于“三北”地区各省市，其中北柴胡（ ）广泛分布于东北、西北、华北、华东及河南、湖南、湖北、陕西、江苏、江西、甘肃等地【 ：狭叶柴胡（ ）分布于东北、西北、华北、华东、河南、陕西及甘肃等地“，黑龙江省的大兴安岭地区、泰康、五里木、内蒙古等地产量甚丰；小黑叶柴胡主要分布于内蒙古、青海、宁夏、甘肃、陕西、山西、黑龙江和辽宁等省；长自山柴胡主要产于吉林、黑龙江和辽宁；银州柴胡主要分布于宁夏、甘肃、内蒙古、陕西；锥叶柴胡分布于内蒙古、宁夏、陕西、辽宁、黑龙江；秦岭柴胡产于陕西秦岭太白山、光头山、佛坪等地【”，宁夏也有生长；太白柴胡产于陕西秦岭主峰太白山，光头山，生于海拔 高的山坡草地，民间作为柴胡习用，在陕西收购中常混入。云南、四川、宁夏、青海、安徽等省的局部地区亦已习用当地产的几种柴胡，但均未形成商品销往外地。秦雪梅等【”对栽培柴胡资源分布进行了调查，发现目前柴胡种植面积和在市场中影响最大的是甘肃、山西和陕西省，其次是黑龙江省，内蒙古、吉林、河南、河北、四川等省、自治区有个别县家种。 柴胡属植物自温带至亚热带均可生长，具有适应性广、抗不良环境的特点。多生长在山坡林下、沟边、路旁，常混生于草本植物及灌木群落中，适应于阳坡及半阳坡，阴坡很少：对土壤的选择不严，多为含腐殖质的沙土和沙质壤土，凡地下水位低、排水良好、富含有机质、土层较厚的火山灰壤土与腐殖质土均可栽培。若在己种植过其他作物的田区栽培，在整地前需以石灰将土壤的调整至。生长发育规律 研究发现人工栽培的柴胡不但在品质、颜色、大小及药用价值方面优于野生种，而且环境适应能力也比野生柴胡强。分析结果表明，人工栽培和野生柴胡的化学成分基本一致，所含柴胡皂苷、等有效成分均高于野生种属。黄文华等【 对北柴胡的光、温、水等生物气象特性进行了生物学研究，发现北柴胡的光能利用率表现出阶段性差异。柴胡属于喜光植物，光合作用与柴胡质量的联系较复杂，总体表现为春季是药材有效成分积累最慢的时期，秋季质量增长大于体积发展，是药材质量形 药用植物柴胡种子鹉发特性与组织培养研究成的关键期。北柴胡第年生长的主方向为地上干物质，到两年半时，平均主根茎最大、药材产量最高；达到或超过年，群体封闭，产量、质量都呈下降趋势。北柴胡优质产地的有效积温为，降雨量的临界值为早春 ，夏秋旦 。魏建和等【研究了北京地区北柴胡的生长发育规律，认为北柴胡叶片的发生顺序和着生部位依次为子叶、基生叶、茎生叶和分枝叶。魏建和等还观察了北柴胡的根长、根径的变化以及地上部分和地下部分干物质积累的动态，发现在苗期或拔节期基生叶生长旺盛，有利于根部的形成。因此，为了提高产量，应在苗期或拔节期延缓生长发育进程。 柴胡生长第年，除个别植物开少量花外一般不能开花结果；第年全部开花结实，花期和果期较长，一般为月月，果期成熟期为月月，温度越高的地区开花期越早。栽培柴胡出苗期月下旬至上旬，开花期月下旬至月下旬：果熟期是月下旬至月中旬。种子的大小形状多不相同，成熟度也不一致，种子寿命在常温下不能超过年。栽培柴胡地上部分和地下部分的生长量，与野生柴胡相比均较高拇。生物学研究组织化学研究 刘鸣远对中药材柴胡的主流品种北柴胡、狭叶柴胡的组织化学定位结果表明：柴胡根的不同组织中柴胡皂苷并不是普遍存在的，而是大部分存在于形成层以外的韧皮部，木质部中含量很少。柴胡皂苷的含量与柴胡根的韧皮部与木质部之比值成正相关，与根半径成负相关，并且由周皮向着韧皮部方向，所含柴胡皂苷与含量之比成下降趋势。中药材从化学成分上，应以柴胡皂苷、总含量高者质量为佳；从组织性状上，应以根半径小，韧皮部与木质部面积之比大者为佳；从药材外观性状上，应以主根细长，支根、须根多者为佳。日本学者名越郎等研究证明三岛柴胡根中的主要有效成分柴胡皂苷大部分存在于中柱鞘中具有网状结构的离生分泌组织“。谭玲玲等用石蜡切片法对北柴胡年生主根的中部和年生主根的尖部和中部进行了横向与纵向解剖学观察，研究根的发育过程，并对年生与年生主根的中部进行了比较解剖学分析.