细菌通用引物在张家口地区奶牛乳房炎病原菌检测中的效用动植物检疫专业论文.doc

学号：20071040115河北北方学院毕业论文细菌通用引物在张家口地区奶牛乳房炎病原菌检测中的作用Research in the Role of Universal Primer in DetectingPathogenic Bacteria of Cow Mastitis in Zhangjiakou姓 名：谢佳指导教师：张丽云院 系：动物科技学院专 业：动植物检疫专业年 级：2007级论文提交时间：2011年06月9日目录引言31 材料与仪器41.1 材料41.1.1 标准菌以及培养基41.1.2 PCR扩增41.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA41.2 仪器42 实验设计及检验方法52.1 标准菌株的培养、鉴定和DNA提取52.2样品DNA制备52.3 PCR检测方法与步骤52.3.1引物的设计和合成52.3.2 PCR扩增52.3.3检测PCR扩增产物62.4通用引物扩增的广谱性试验62.5细菌菌液灵敏度试验62.6染色体稀释灵敏度试验62.7特异性试验63 结果和分析73.1通用引物扩增的广谱性试验73.2细菌菌液的灵敏度试验83.3染色体稀释灵敏度试验93.4特异性试验10讨论11结论12参考文献13致 谢14细菌通用引物在张家口地区奶牛乳房炎病原菌检测中的效用谢佳（河北北方学院动物科技学院动物医学系）指导教师：张丽云摘要：为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,探索通用引物在奶牛乳房炎致病菌检测中的应用价值。利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增标准菌株及患有奶牛乳房炎的奶样。结果表明,通用引物扩增7种标准菌株,370 bp处均可得到清晰的电泳条带;通用引物PCR可检出250 ng/L的金黄色葡萄球菌标准菌株DNA;对患有奶牛乳房炎的奶样进行扩增,370 bp处也得到了清晰的电泳条带。建立在16S rRNA基础上的通用引物在奶牛乳房炎的检测中,初步显示具有特异、快速等优点,为进一步判断细菌的种类奠定了基础。关键词:通用引物;聚合酶链反应;乳房炎Research in the Role of Universal Primer in DetectingPathogenic Bacteria of Cow Mastitis in ZhangjiakouXie Jia(Veterinary Medicine, Colloge of Animal Science and Technology, Hebei Northern University)Guide Teacher: Zhang LiyunAbstract: To establish a PCR method which could be used to directly detect pathogenic bacterial compo-nents in the milk of cow with mastitis and to explore the value of this method diagnosis,apair of universal primers for eubacteria targeting conserved region in 16S rRNA gene were designed. The primers were used to detect the milk of dairy cow with mastitis and seven sorts of bacteria.The sensitivity and specifity of this method were tested. Seven sorts of bacteria gave a visible band after amplication at 370 bp.The sensitivity test showed that the PCR amplication technique could detect 250ng/L of genomicStaphylococcus aureus. Amplifying the milk of dairy cow with mastitis,we also got a visible band. Universal primers based on 16SrRNA play an important role in detecting pathogenic bacterial components in the milk of diary cow with mastitis. The preliminary study showed its speed and sensitivity. This research is the base of further jud-ging the sorts of bacteria.Key words: universal primer;PCR;mastitis引言乳房炎的危害：乳房炎(mastitis)是危害奶牛业的主要疾病之一1。严重的制约着奶牛业的发展。根据国际奶牛联合会的统计2-3，20 世纪 70 年代奶牛乳房炎的发病率为 20%，隐性乳房炎患病率为 50%，本病在我国各省区均有不同程度的发生4-6，20 世纪 70 年代中期几个大城市隐性乳房炎的检出率为 20%70%。一般认为，在乳房炎引起的经济损失中，由于产奶量降低引起的损失占到70%7，而由于患病使奶牛提前淘汰的占 14%,废弃乳汁占 7%，治疗及兽医费用占 80%，在一个牛群中，大多数乳房炎（大约 90%）是隐性型的。因此，造成经济损失的主要是隐性乳房炎，其损失占每头泌乳母牛每年总生产能力的 10%11%,在美国 30%70%的母牛至少有一个乳区被感染，我国奶牛乳房炎的发生率更高。乳房炎是一种复杂的疾病，其病原菌很多，它的发生是病原、机体防卫功能和外界环境因素共同作用的结果。金色葡萄球菌和链球菌是引起奶牛隐性乳房炎的主要致病菌，病原菌数中所占的比例大小依次为停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌。还有支原体、病毒等也可引起奶牛隐性乳房炎。传统乳房炎诊断：选择合适的培养基，进行平板计数检测；进行PCR扩增检测体细胞检测方法在临床应用最广，精确度和准确性比一般的快速检测方法要高些，但是乳汁中体细胞数在不同的生理阶段标准也不同，在临床上很难找到这些不同的标准可参考。细菌通用引物的优点：传统细菌培养和血清学实验不适合病原苗的早期诊断，因此快速、灵敏、特异地鉴定细菌的方法在诊断细菌感染中尤为重要。用PCR法可以快速检测病原菌，但是常规PCR仅对特定病原菌进行检测，检测多种病原菌需用多种不同引物分别进行PCR扩增，且难以实现快速诊断。16SrRNA基因序列越来越多地用于细菌的鉴定和分类。I6SrRNA基因高度保守，可设讨一通用引物对奶牛乳房炎致病菌进行系列检测。可在早期判断是否存在病菌感染，进一步分析扩增产物鉴定病原菌的种属，弥补了细菌培养和血清学检测的不足。 本研究采用细菌共有的16SrRNA基因的保守区引物-通用引物，并且以标准菌株为对照，连同患有奶牛乳房炎的的奶样一起进行PCR扩增，随后对PCR产物进行分析，即可建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法。旨在探索通用引物在奶牛乳房炎致病菌检测中的应用价值，减少乳房炎对奶牛业造成的损失。1 材料与仪器1.1 材料1.1.1 标准菌以及培养基无乳链球菌 金黄色葡萄球菌 化脓棒状杆菌 大肠埃希菌 停乳链球菌 乳房链球菌 铜绿假单胞菌胰蛋白胨、大豆胨培养基（用于培养无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）LB固体或肉汤（用于培养金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠埃希菌、化脓棒状杆菌）1.1.2 PCR扩增：DNTPs(deoxynucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸)，TaqDNA聚合酶、10×PCRbuffer、Mgcl2(25 mmol/L)1.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA：Loading dye (0.25%溴酚兰+40%蔗糖水溶液) 10ml 0.025g溴酚兰和4g蔗糖 1g溴化乙锭TBE： ×TBE贮液2L：108g Tris-base 55g硼酸40ml 0.5M的EDTA(pH8.0) 7.4g disodium·2H2O琼脂糖： 30g1.2 仪器PCR仪恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、台式离心机、高压灭菌锅、紫外线透射仪、凝胶成像系统（琼脂糖凝胶电泳检测DNA）2 实验设计及检验方法2.1 标准菌株的培养、鉴定和DNA提取。将真空冷冻干燥保存的细菌接种于相应的肉汤中，37培养24h后转钟至相应的选择平板培养基，又经过37培养24h，对生长在选择性平板培养基的菌落进行形态学鉴定。挑取鉴定的单个菌落接种到斜面上，再经过37培养24h后，挑取一环菌，研磨、振荡、混匀于100L纯水上，煮沸10min,10000r/min离心1min，吸取上清液2L用于PCR扩增。2.2样品DNA制备取无菌采取的1.5 mL奶样在5 000 r/min离心10 min,去上清液,TE悬浮沉淀,加SDS和蛋白酶K,混匀,37保温1 h,加CTAB/NaCl溶液,混匀,65保温20 min,用等体积的酚氯仿异戊醇(25241)抽提,5 000 r/min离心10 min,将上清移至离心管中,用异戊醇沉淀,700 mL/L乙醇漂洗后吹干,水溶备用。2.3 PCR检测方法与步骤2.3.1引物的设计和合成根据Tom Barry等的方法，首先在GenBank中查找7种细菌16SrDNA的全部基因序列，并通过Blast软件进行同源性比较，在16SrDNA的保守序列区间（1 1701 189，1 5221540）设计通用引物：5-AACTG-GAGGAAGGTGGGGAT-3; 5-AGGAGGT-GATCCAACCGCA-38-9。2.3.2 PCR扩增10 扩增反应体系总体积30L。内含dNTP(各2.5mmol/L)2.5L,TaqDNA聚合酶(5U/L) 0.5L、10×PCR Buffer 3L、MgCl2(25mmol/L)4L,上下游引物(50pmol/L)各0.5L。再加入模板2L,后用石蜡油覆盖,置于DNA扩增仪。首先94变性5min,再按9430s,7230s,55延伸30s的顺序,共35个循环,最后72延伸5min。2.3.3检测PCR扩增产物 5L扩增产物加入10g/L琼脂糖凝胶11进行电泳,溴化乙锭染色后,在紫外灯下观察结果。琼脂糖凝胶电泳检测DNA操作步骤如下: 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 调整好梳子的高度；称取0.24g琼脂糖于30ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50ºC时倒入制胶板中；凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；pUC185µl + ddH2O3µl+ 溴酚蓝2µl 共10µl于0.5ml tube中混合后点样；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色1015min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。在370 bp处出现荧光条带为阳性,无此条带则为阴性。2.4通用引物扩增的广谱性试验利用设计的引物对7种病原菌及奶牛乳房炎奶样进行扩增,观察这对通用引物的广谱性。2.5细菌菌液灵敏度试验 面转接金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌,37培养12 h,用接种环刮取一环到5 mL PBS中,然后做10倍系列稀释直至10-9,利用平板涂抹法对2种细菌进行菌落计数,取各个稀释度进行通用引物PCR扩增,观察细菌系列稀释后其灵敏度。2.6染色体稀释灵敏度试验取金黄色葡萄球菌染色体DNA2.5 mg/L,做10倍系列稀释直至10-7后分别做PCR扩增,观察染色体稀释后扩增的灵敏度。2.7特异性试验对以上7种细菌和酵母菌进行扩增,观察这对引物扩增的特异性。3 结果和分析3.1通用引物扩增的广谱性试验采用设计的通用引物对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓棒状杆菌、大肠埃希菌、乳房链球菌、铜绿假单胞菌、停乳链球菌，7种奶牛乳房炎主要致病菌及酵母菌进行扩增，7种致病菌同在370bp处见一清晰条带，同时扩增奶牛乳房炎的奶样，在370bp处也得到了条带（图1）。1.无乳链球菌；2.金黄色葡萄球菌；3.化脓棒状杆菌4.大肠埃希菌；5.乳房练球菌；6.铜绿假单胞菌；7.停乳链球菌；8.奶样1.Strep tococcus agalactiae ; 2.Stap hy lococcus aureus ;3.Cory nebacterium pyogenes ; 4.Escherichia coli ;5.Strep tococcus uberis ; 6.Pseudomonas aeruginosa ;7.Strep tococcus dysgalactiae;8.Milk of dairy cow with mastitis图1 通用引物扩增的广谱性Fig.1 Extensibility of amplification of the universal primers3.2细菌菌液的灵敏度试验用LB斜面转接金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，37培养12h，用接种环刮取一环到5mL PBS（phosphate buffered saline,磷酸盐缓冲液）中，然后做10倍系列稀释直至10-9 ，利用平板涂抹法对2种细菌进行菌落计数，取各个稀释度进行芯片杂交实验，观察细菌系列稀释后芯片杂交灵敏度。经过平板计数，计算出菌液原始浓度。金黄色葡萄球菌为2.55×107 cfu/mL（clone forminy unit,菌落形成单位），绿脓杆菌为2.0×107 cfu/mL，对于2种菌液来说，这一对通用引物PCR检测的灵敏度分别可达2.55 cfu/mL 和2.0 cfu/mL。 3.3染色体稀释灵敏度试验经试验发现,系列倍比稀释后金黄色葡萄球菌染色体DNA在250 ng/L时经过扩增仍可以观察到阳性信号,但25 ng/L时已经观察不到扩增条带(图2)。1. 2.5mg/L;2. 0.25mg/L;3. 25g/L;4. 2.5g/L;5. 250ng/L;6. 25ng/L;7. 2.5ng/L;8. 0.25ng/L图2 染色体稀释灵敏度Fig.2 The sensitivity test of chromatosome3.4特异性试验试验表明,这对通用引物扩增7种细菌在370 bp处均可见清晰条带,但扩增酵母菌时无条带出现(图3)。1.无乳链球菌；2.金黄色葡萄球菌；3.化脓棒状杆菌4.大肠埃希菌；5.乳房练球菌；6.铜绿假单胞菌；7.停乳链球菌；8. 痢疾杆菌1.Strep tococcus agalactiae ; 2.Stap hy lococcus aureus ;3.Cory nebacterium pyogenes ; 4.Escherichia coli ;5.Strep tococcus uberis ; 6.Pseudomonas aeruginosa ;7.Strep tococcus dysgalactiae;8.Dysentery bacillus图3 通用引物的特异性Fig.3 Specifity of the universal primers讨论近年来，建立在16S rRNA基础上的通用引物PCR的方法在对多种病原菌感染的研究中得到了广泛的应用，有报道它已用于水、环境、食品、化妆品中病原菌的检测及医学领域，我们将它用于奶牛乳房炎致病菌的检测，是对该种方法应用范围的拓展。PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，特点,可对奶牛乳房炎作出初步诊断，对于有多种病原菌感染的疾病检测是一种探索，具有实践和理论意义12。由于16S rRNA只存在于原核生物,不存在于病毒、真菌等非原核生物体内13,我们设计的这对通用引物只适用于真细菌的检测,本试验选用了奶牛乳房炎的7种主要致病菌作研究。利用16S rRNA为细菌所共有的特性,设计并合成了通用引物。这一对引物能扩增各种细菌的DNA,我们用它来检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓棒状杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌、铜绿假单胞菌的标准菌株,同在370处见一清晰条带,而酵母菌呈扩增阴性,证明该引物为细菌所共有 14。在研究通用引物扩增的灵敏度问题时,由于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌是很难破壁的,而且细菌裂解物对PCR影响很大15,不同细菌和不同的裂解、扩增条件对引物的扩增灵敏度都将产生很大影响。本方法虽具有快速、灵敏的特点，但仍不能对细菌的种类作出鉴别，不能代替常规的检测方法，仍必须与具体的临床表现相结合。由于16S rRNA只存在于原核生物，不存在于病毒、真菌等非原核生物体内，我们设计的这对通用引物只适用于真细菌的检测。结论采用针对16sRNA的通用引物技术，不需要探针，本实验整个过程只需10小时左右，以标准菌株为对照可简便、快速、特异、敏感地检测致病菌。以细菌共有的16SrRNA基因的保守区引物-通用引物，并且以标准菌株为4 结论对照，连同患有奶牛乳房炎的的奶样一起进行PCR扩增，随后对PCR产物进行分析，经验证可建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法16-17。在实验过程中要注意每一环节都严格无菌操作，尽量使川一次性耗材，所用试剂需经高压处理或过滤除菌，避免出现假阳性结果。参考文献1严作廷,李宏胜,郁杰.中草药防治奶牛乳房炎的研究进展.动物医学进展,2003:13142甘志华,蒋武成,陈衍基,等. 湖南省奶牛隐性乳房炎调查. 湖南农业大学学报,1995 （06）:5845883韩英武. 关于奶牛隐性乳房炎的综述. 上海畜牧兽医通讯,1986:31344刘绪川. 奶牛隐性乳房炎诊断方法比较试验. 兽医科技杂志,1981 （12）:4125陈宏仁.奶牛隐性乳房炎发病规律的调查. 广西畜牧兽医,1989 (3):18216张洪存.综合防治奶牛隐性乳房炎. 中国奶牛,1991:44457储明星.奶牛乳房炎的危害及其发生规律与防治. 中国奶牛,1999:55568陈火胜.通用引物PCR技术的应用概况J.中国病毒学,1994 (04):279282.9韦莉萍.朱冰.胡琼 金黄色葡萄球菌随机引物扩增DNA(PRPD-DNA)多态性分型研究 J.中华医学检验杂志2000 (02):145152 10李明,王崇,汪建国,喻达辉,王文博,戈贤平,徐跑,谢骏,龚小宁,鲩肠袋虫18S rDNA的扩增、测序与分析J. 水生生物学报, 2011 (02) :203111刘吉荣.吴婉芳.秦雨春 原核生物16SrDNA的PCR-ELISA检测方法的研究 J .农业生物技术学报,1998 （10）:15616311刘水平, 罗志勇. 琼脂糖凝胶电泳实验技巧. 实用预防医学, 2006:152312赫然,张颖,王强,李刚,王智学,崔亮,刘秋云,李宝健. 利用微波炉和煮沸法快速制备大肠杆菌基因组DNA PCR模板. 中山大学学报(自然科学版), 2004 (1) :253213杨红.李颖.关国华.李秀玉 Sequencing of ITS region in Rrna gene of a heterokaryon and its segregants of Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum J .农业生物技术学报2002 (4):13414514陈火胜.通用引物PCR技术的应用概况J.中国病毒学,1994 (5):279282.15刘吉荣.吴婉芳.秦雨春 原核生物16SrDNA的PCR-ELISA检测方法的研究 J .农业生物技术学报,1998 （3）:15616316米耀荣.郭生泉奶牛乳房炎的危害及其防治措施J.畜牧与饲料科学,2009 (03):17518117陈申秒, 马景霞, 王金生, 朱后顺. 山东省某奶牛场奶牛乳房炎的调查与分析.中国奶牛, 2011:5053致 谢本论文在完成过程中，受到了指导老师的悉心指导，在此向张丽云老师表示深深的感谢和崇高的敬意。此外,感谢所有评委老师对本论文的指导！感谢图书馆各位老师的大力支持。感谢做试验过程中提供帮助的同学。请允许我向给我支持和帮助的老师们和同学们再次致以诚挚的谢意！