溶菌酶对凡纳滨对虾非特异性免疫因子的影响海洋科学毕业论文.doc

本 科 毕 业 设 计 (论 文)溶菌酶对凡纳滨对虾非特异性免疫因子的影响The effect of lysozyme on non-specific immune factors of Litopenaeus vannamei学 院： 海洋学院 专业班级： 海洋科学 海科081 学生姓名： 学 号： 指导教师： 年 月毕业设计（论文）中文摘要溶菌酶对凡纳滨对虾非特异性免疫因子的影响摘 要：本试验以凡纳滨对虾为研究对象，研究溶菌酶对其非特异性免疫因子的作用。实验中所用的凡纳滨对虾系连云港本地养殖户提供，幼虾买回后，进行为期一周的驯养，以求尽快适应实验室环境。为了详细的探讨溶菌酶在虾类非特异性免疫中的作用，选取大小均匀、健康活泼对虾，随机分为3个试验组和1个对照组，每组40尾，每组设3个平行，饲养于玻璃纤维水槽（48.5×27.5×35cm）内，盐度为16，pH为7.7-8.2，日投饵两次（06:00和18:00 h），过量投饵，投饵2.5 h后从每个桶收集残饵、粪便；每天换水约2/3，溶解氧维持在 6.0 mg×L-1以上，pH为8.5±0.3，温度为22±0.5，连续充气。结果表明：由图1可以看出O2-的产量随着时间的延长呈上升趋势，2添加量组的O2-的产量最高，其次是1和3添加量组，对照组最低。由图2可以看出，PO活性随着时间的延长呈上升趋势，第7d后，2添加量组的PO活性最高，其次是1和3添加量组，对照组最低。由图3可以看出，SOD活性随着时间的延长呈上升趋势，第7d后，SOD活性依次为2添加组>2添加组>3添加组>对照组。由图4可知，随着时间的延长，对照组和实验组血清蛋白含量均呈先上升，到达最大值后逐渐下降趋势。关键词：溶菌酶；凡纳滨对虾；非特异免疫因子；浓度梯度毕业设计（论文）外文摘要The effect of lysozyme on non-specific immune factors of Litopenaeus vannameiAbstract: The effect of lysozyme on non-specific immune factors of Litopenaeus vannamei was conducted. In the experiment, Litopenaeus vannamei was provided by Lianyungang local farmers, shrimp was domesticated for a week in order to adapt to the laboratory environment. For a detailed investigation of lysozyme on nonspecific immunity function of shrimp, uniform size, healthy and lively prawn were selected and randomly divided into 3 experimental groups and 1 control groups, each group of 40 tails, each with 3 parallel. They were housed in a glass fiber tank (48.5×27.5×35 cm), the salinity was 16, pH 7.7-8.2. They were fed two times (06:00 and 18:00 h), excessive feeding. After feeding 2.5 h, the bait was collected from each barrel. The water was changed about 2/3 every day, dissolved oxygen was maintained at 6 mg L-1, pH 8.5±0.3, temperature 22± 0.5 , continuous inflating. The results showed that the activity of SOD with time prolong assumes the trend of escalation. Figure 1shows the output of O2- with time prolonged upward trend, adding 2% to the O2- group the highest yield, followed by 1% and adding 3% groups, control group were the lowest. From the graph 2 can see, PO activity with time prolonged upward trend, after adding 2%7d, group PO activity was the highest, followed by 1% and adding 3% groups, control group were the lowest. From the graph 3 can see, SOD activity over extended time of upward trend, the7d, SOD activities were 2% >2% add >3% add add group group group > control group. Figure 4shows, with the extension of time, the experimental group and the control group the serum protein content showed the first rise, reaching maximum values after declining trend.Keywords: lysozyme；shrimp；non-specific immune factors；concentration gradient目 录1 引言12 材料和方法52.1 材料来源52.2 实验设计和管理52.3 数据统计53 结果64 讨论8结论 10致谢 11参考文献12图1 7图2 71 引言南美白对虾（Penaeus vannamei Boone，1931）的学名为凡纳滨对虾，属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亚目（Natantia）、对虾科（Penaeidae）、对虾属（Penaeus）、Lito-penaeus亚属，为广温广盐性热带虾类。俗称：白肢虾（whiteleg shrimp）、白对虾（white shrimp），以前的翻译是万氏对虾，与中国对虾、墨吉对虾外形酷似，平均的寿命一般至少能超过32个月。成体的长度最长可达24厘米，甲壳比较薄，浅青灰色为正常体色，全身不具有斑纹。它的步足常呈白垩状，所以有白肢虾之称。当今世界养殖产量最高的三大虾类之一是南美白对虾。南美白对虾最初产于南美洲太平洋沿岸海域，中国科学院海洋研究所的张伟权教授率先从美国引进此虾，并于一九九二年突破了育苗关，从小试到中试直至在全国各地推广养殖。目前我广西、广东、海南、福建、浙江、河北、山东等省或自治区已逐步推广养殖，天津市汉沽区杨家泊镇养殖的南美白对虾世界闻名，有“中国鱼虾之乡”的美称，其中属南美白对虾的技术最为娴熟。南美白对虾的特点之一是肉质鲜美，加工出肉率可高达67%，适温的范围广，可在1832生长，适盐的范围也广，可在盐度140条件下生长，是一种优良的淡化养殖品种。南美白对虾抗病能力强，生长快，现在已经逐渐成为我国南方的主要养殖虾种。我国南宁、北海、广州和厦门等地均有虾苗、虾无节幼体或亲虾供货。11.1 外形特征及生活习性额角尖端的长度不超出第1触角柄的第2节，其齿式为7-9/1-2；头胸甲较短，与腹部的比例约为1：3；额角侧沟短，到胃上刺下方即消失；头胸甲具肝刺及鳃角刺；肝刺明显；第1触角有双鞭，内鞭比外鞭纤细，长度大致相等，但都短小（约为第1触角柄长度的1/3）；第l-3对步足的上肢十分发达，第4-5对步足无上肢，第5对步足具雏形外肢；腹部第4-6节具背脊；尾节具中央沟，但不具缘侧刺。南美白对虾最初产于美洲太平洋沿岸水域，主要分布于秘鲁北部至墨西哥湾沿岸，分布最为集中的是厄瓜多尔沿岸。南美白对虾具有生长快、个体大、抗病力强、营养需求低等优点，对饲料蛋白含量要求低，对水环境因子变化的适应能力较强，出肉率高达65%以上、离水存活时间长等优点，是高产养殖集约化的优良品种，目前也是世界上三大养殖对虾中单产量最高的虾种。南美白对虾体肥壳薄，肉质鲜美，营养丰富，含肉率高。21.2 凡纳滨对虾的生物学特性1.2.1 生态习性（1）种群分布：最初的凡纳滨对虾产于中南美洲，北到墨西哥，南至智利的太平洋沿岸海域，就是介于北纬32度南纬23度之间，泥质的海底。河口附近常聚有很多仔虾，变成幼虾后逐步移栖于近岸浅海区，长到8-9厘米，便转移深海，栖息与常年水温在20以上的海域。（2）水温：为热带型种类，人工养殖时可在16-35（渐变幅度）水温，但最适的水温为28-32，当水温长时间处于18以下或34以上时，则虾体处于紧迫状态，免疫力下降，食欲减退甚至停止摄食。（3）盐度：凡纳滨对虾对海水盐度的适应范围很广，可容忍的盐度范围为0.5-40，但最适盐度为10-25，在逐渐淡化的情况下可在淡水中生存。在适宜范围内，盐度越低，则对虾生长越快，但盐度越高则其肌肉组织内的自由氨基酸（Free amino acid）含量越高，而自由氨基酸正是造成对虾口感鲜美的主因。所以收虾前的1-2周内，渐渐调高盐度，有利于提高对虾的品质。（4）酸碱度（pH）：凡纳滨对虾对pH值的适应范围为7.3-9.0，最适pH为7.8-8.6，当pH低于7.3时，其活动就受到限制。pH日波动不得大于0.5。（5）溶解氧：维系水生生物的最重要因子是水体中的溶解氧，此种对虾抗低氧的能力很强，它的最低溶解氧值忍耐度为1.2mg/l。一般在养殖过程中要求D0值大于4mg/l。不同体长的个体对低氧的耐受程度稍有差异，个体愈小，耐低氧能力愈好。当对虾蜕壳时，对溶解氧的要求非常高，否则便不能顺利蜕皮，直至死亡。1.2.2 食性在营养需求的方面，对饲料中蛋白质的需求量凡纳滨对虾在28-32%左右，相对于斑节对虾的蛋白质需求量为35-39%，而日本囊对虾的为43-52%，低很多。凡纳滨对虾在国内养殖中，因要求单产高，放苗密度较大，对虾需要的营养基本依赖配合饵料，因此配方中蛋白质含量一般都高于28-32%，多数在40%左右。在环境为自然状态下，凡纳滨对虾是夜行性动物，白天相对安静，而夜间则活动频繁，在人工养殖状况下，白天凡纳滨对虾仍会摄食投喂的饲料。研究还表明，投喂方式为一日多餐在生长速度方面远比一日一到两餐的投喂方式要快得多。夜间投喂量要远远大于白天的投喂量。栖息方式和底质的对虾，多种肉食性动物的食饵是对虾。对虾在活动中遇到敌害时会用连续的弹跳，避开敌害；休息的时候，在白天它多会潜入泥沙中，只有触须和眼留于泥沙外，敌害会不易发现它们。潜居的另外一个生物学意义是减少能量的消耗和休息。除自身的生理因素外，对虾的潜居还受环境条件的制约，水温过高、池底污染、溶氧过低对虾多不潜居。强光、水温低和白天易潜居，但潜居不似日本对虾非要昼伏夜出，在养成期白天也多出穴觅食物。31.2.3 对虾的非特异免疫甲壳动物缺乏免疫球蛋白，其体液免疫是依靠血淋巴中的一些非特异性的酶或因子来进行的(2001，徐海圣等)。这些体液免疫因子包括诱导和天生的产生的各种生物大分子，主要是血淋巴中的各类抗病毒因子、血凝因子、抗菌因子、识别因子、凝集素、细胞激活因子、溶血素及溶菌酶、酚氧化酶等具有免疫活性的酶类。免疫因子的作用在于识别异物然后通过包囊、沉淀、凝集、溶解等抑制病原体的扩散和繁殖；或者干脆将其杀灭并排出体外；发挥调理作用，促进血细胞吞噬异物；还可能参与凝固、物质吸收、止血与运输及创伤修复等生理功能。对虾的免疫酶主要存在于血淋巴和血细胞中，目前研究较多的有酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)、过氧化氢酶(CAT)、酚氧化酶及碱性磷酸酶(AKP)等(1999，；刘树青等1998，刘恒等)。普遍认为，虾类体液中含有的溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、凝集素、过氧化氢酶、碱性磷酸酶以及血细胞释放的Propo激活系统等体液免疫因子，消灭异物能以不同的途径，而且能抵御病原体的侵袭。 1.3 溶菌酶简介 溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中芳香族氨基酸、酰胺残基和碱性氨基酸的比例较高，酶的活动中心是谷氨酸与天冬氨酸。 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称为包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专门地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-14键，以致破坏细菌的细胞壁，使其松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，从而达到杀菌的作用，这主要是由于革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由磷酸质和胞壁质构成，其中胞壁质是由多肽和杂多糖组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸之间的-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如伤寒沙门氏菌，埃希氏大肠杆菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以有利于蛋白质的消化吸收（王境岩，2002）。41.3.1 溶菌酶的应用简介溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶。于本世纪初人们开始对溶菌酶研究，英国细菌学家弗莱明在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的眼泪、唾液中含有溶解细菌细胞壁的酶，因为它具有溶菌作用，所以命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的分泌液、多种组织及某些微生物、植物中也发现了溶菌酶的存在。随着不断深入的研究，发现溶菌酶不仅有溶解细菌细胞壁的种类，并有作用于真菌细胞壁的种类，同时对其作用机制也有了更深层次的了解。近几年，人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值（荣晓花等，1999）。51.3.2 水产动物溶菌酶的分型 水产动物溶菌酶按照其来源可分为三类：i型溶菌酶、g型溶菌酶和c型溶菌酶。大部分溶菌酶属于c型溶菌酶(如罗氏沼虾、日本囊对虾斑节对虾 、凡纳滨对虾和 日本沼虾的溶菌酶)，c型溶菌酶约由一百三十个氨基酸残基组成；目前发现的g型溶菌酶(如鲤鱼的溶菌酶)由一百八十五和一百九十五个氨基酸残基组成；i型溶菌酶(如海湾扇贝和东方牡蛎的溶菌酶)在进化上是一个独立的分支，存在于海洋无脊椎动物尤其是双壳类中（吴晓英等，2002）。61.3.3 水产动物溶菌酶的特性 即使在 pH值为中性的水溶液中，该酶也可维持数天而不损失活性。研究发现，溶菌酶有两种晶体形式存在，四边形晶体在温度高于25时变得不稳定，在3740时转变成稳定的斜方体状晶体；对于水产动物溶菌酶的活性来说，最理想的条件是 pH 6.07.0，温度 25，碱和氧化剂对它起阻遏作用，食盐起活化作用；它的热稳定性强，粉状溶菌酶若采用低温干燥贮存，则几乎永不变质。1.3.4 溶菌酶在饲料中的应用 因为饲料生产中长期使用抗生素而导致水产动物免疫力下降，并在水产品体内残留而危及人类健康，所以饲料行业急需无害、无毒的添加剂，饲用酶制剂由此应运而生。这种酶制剂一般情况是直接用作饲料添加剂的水解酶，可使肠道微生物群落改变，促进饲料的吸收、消化，提高饲料的利用率，但是这类酶易失活，热稳定性差，因而效果不明显。但溶菌酶具有可补其不足的以下优点： （1）与各种诱发炎症的酸性物质结合，致其失活，能增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的； （2）与甘氨酸和聚合磷酸盐等配合使用，具有良好的防腐作用。在饲料中添加溶菌酶可防止发生霉变，减少不必要的损耗； （3）热稳定性强，耐酸性，能经受饲料制粒的高温；（4）能改变肠道微生物群，增加肠道有益菌使肠道内的胺 、甲酚等有害物减少，增强机体抗病力，提高动物的生产性能； （5）可促进饲料中营养物质的消化、吸收，提高饲料的消化率，最大限度地提高饲料原料的利用率 。（6）广谱抗菌，能破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，对革兰氏阴性菌等也有一定的溶解作用，而水产动物细胞无细胞壁亦无肽聚糖，故溶菌酶对水产动物细胞无毒性作用； （7）与葡萄糖氧化酶有增效作用，且抗酸作用还可通过花生四烯酸的加入得到进一步增强； （8）作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的作用。1.3.5 溶菌酶与青霉素作用机理的比较溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种碱性酶，能水解致病菌中黏多糖。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，造成细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶也可直接结合带负电荷的病毒蛋白，与脱辅基蛋白、RNA、DNA形成复盐，导致病毒失活。所以，该酶具有抗病毒、消炎、抗菌等作用。该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的乳汁、泪、血浆、尿、唾液等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由十八种一百二十九个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有四对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其C端为亮氨酸，N端为赖氨酸。可分解黄色八叠球菌、巨大芽孢杆菌、溶壁微球菌等革兰阳性菌。青霉素抑制繁殖期细菌细胞壁的合成而发挥杀菌作用，起效快速。对革兰氏阳性菌，如肺炎球菌、链球菌，敏感的葡萄球菌及革兰氏阴性球菌，如淋球菌、脑膜炎球菌有较强的抗菌功能。对梭状芽胞杆菌、螺旋体、白喉杆菌、放线菌以及部分拟杆菌亦有抗菌功能。青霉素钾、钠盐口服不吸收，且易被胃酸破坏，所以不宜口服。tl20.5小时，经肾脏排泄。适用于敏感菌所致的急性感染，如：猩红热、败血症、中耳炎、丹毒、肺炎、脓胸、扁桃体炎、菌血症、蜂窝织炎、疖、痈、急性乳腺炎、流行性脑膜炎、骨髓炎、回归热、钩端螺旋体病、创伤感染、奋森氏咽峡炎、心内膜炎、气性坏疽、炭疽、淋病、放线菌病等。治疗破伤风、白喉宜与相应的抗毒素联用。（郑清梅等，2004）71.4 饲料添加剂简介饲料添加剂是指为了某种特殊需要而添加于饲料内的某种或某些微量物质。其主要作用是补充配合饲料中营养成分的不足，提高饲料利用率，改善饲料口味，提高适口性，促进水产动物正常发育和加速生长，改进产品品质，防治鱼、虾疾病，改善饲料的加工性能，减少饲料贮藏和加工运输过程中营养成分的损失。饲料添加剂必须满足以下条件：（1）不影响水产动物对饲料的适口性和对饲料的消化吸收； （2）必须具有确实的作用，产生良好的经济效益和生产效果；（3）维生素、激素、酶等生物活性物质不得失效或超过有效期限。（4）长期使用或在使用期间对动物不会产生任何毒害作用和不良影响；（5）在动物体内的残留量不得超过规定标准，不得影响动物产品的质量和危害人体健康；（6）选用的化工原料，其中所含的有毒金属含量不得超过充许的安全浓度；其他原料不得发霉变质，不得含有毒物质；（7）在饲料和动物体内具有较好看稳定性。饲料添加剂的选用要经济、使用方便、安全，还要注意添加剂的效价、有效期，以及用法、禁用、配伍禁忌、用量、限用等有关事项的规定。1.4.1 溶菌酶作为饲料添加剂的可行性所选用的溶菌酶，系微生物发酵制得的微生物源溶菌酶，具有修复机体损伤组织，抗病毒，增强免疫力，广谱抗菌消炎，促进有益菌增殖等作用；具有生物相容性好，对组织无毒性，无刺激的特点；稳定的抗菌活性，特别是对一些耐药性菌株有良好的抑菌作用。溶菌酶作为饲料添加剂的优点：（1）抗菌谱广，防治效果显著，疗效明显，对抗生素的耐药菌株照样灭杀，细菌性疾病防治率达8595%，复发率低于5%。与蛋清溶菌酶相比，微生物源溶菌酶的抑菌范围更广，效果更好；（2）能够使动物的肠道微生态环境维持在最佳状态，增强机体消化吸收能力，显著提高采食量，生长速度和饲料利用率；（3）具有靶向功能，能富集到目标器官，渗透生殖系统的屏障，增强对顽固疾病的防治效果； （4）加快消化道内膜的伤口修复，增强对消化道内膜的保护（能消除对ZnO的副作用；对抗球虫药有增效作用），有利于产道和外伤的恢复；（5）不会产生耐药性，长期使用不用考虑轮换用药，如果与抗生素配伍使用能使其增效2-8倍； （6）环保安全，绿色，高效。2 材料和方法2.1 材料来源实验在淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室进行。所用凡纳滨对虾购于连云港市赣榆一对虾养殖场，体长为9-12cm，体色正常，健康活泼。凡纳滨对虾幼虾养在培育池。亲虾培育池，圆形或椭圆形，每池20-40m2，池深1m，水深0.6-0.8m，光照强度100-500lux。暂养驯化10d，海水盐度为30，溶解氧维持在 6.0 mg×L-1以上，pH为8.5±0.3，温度为22±0.5，连续充气，每天换水1/3-1/2，并投喂对虾配合饲料。2.2 实验设计和管理选取大小均匀、健康活泼对虾随机分为3个试验组和1个对照组，每组40尾，每组设3个平行，饲养于100L PVC桶中。实验前停食24h，实验期间，分别投喂四种实验饲料（表1），日投饵两次（06:00和18:00h），过量投饵；投饵2.5h后从每个PVC桶收集残饵、粪便；每天换水约2/3，溶解氧维持在 6.0 mg×L-1以上，pH为8.5±0.3，温度为22±0.5，连续充气。2.2.1 对虾血清的获取在试验开始的第1、3、7、12、18、25d每PVC桶取3-5尾对虾，取血时用1ml无菌注射器，按照血淋巴与抗凝剂（0.01M Tris-HCl，0.25M 蔗糖，0.1M柠檬酸三钠；pH 7.6；780mOsKg-1）1:2的比例，自对虾头胸甲后插入心脏抽取血液，合并置于无菌Eppendorf管。所取抗凝血，一部分用于超氧阴离子的测定；另一部分离心10min（700×g. 4）（MIKR022R，德国HEYYICH公司），所得的上清液一部分用于血清酚氧化酶（PO）活力的测定，另一部分于-20冰箱中保存，用于其它指标测定。2.2.2 非特异性免疫因子的测定（1）超氧阴离子（Superoxida Anion, O2-）参考（Lee，2003）的方法，并作相应修改。在96孔酶标板中先加入50l 0.2%多聚赖氨酸（poly-L-lysine，Sigma），然后加入100l抗凝血，离心10min（300×g. 4），去除上清，加入100ul 1g/L PMA（phorbol myistate acetate, Sigma），温育30min（37），然后加入100l 0.3%NBT（nitroblue tetrazolium, Sigma），温育30min（37），经离心10min（560×g. 4），去除上清，加入200l 100%甲醇终止反应（10min），10min（700×g. 4），去除上清，然后用70甲醇洗涤3次，经离心去除上清后，于室温下晾干。待干燥后，加入120l 2mol/LKOH和140l DMSO（二甲基亚砜），充分溶解，在酶标仪（BIO-TEKSYNERGE，美国Bio公司）中测定溶液在波长630nm的吸光值（OD630）。（2）血清酚氧化酶（phenoloxidase, PO）活力的测定以L-DOPA为底物，采用改进的Ashida等方法25-26在96孔酶标板中进行。把10l血清加入96孔酶标板中，然后向各孔中加入200l 0.1 mol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液，最后向各孔中加入10l的L-DOPA（Sigma公司）（0.01mol/L）在酶标仪（BIO-TEKSYNERGE，美国Bio公司）中振荡4次，每隔4min读取490nm处的吸光值，酶活力以试验条件下，OD490每分钟增加0.001为一个酶活力单位。（3）超氧化物歧化酶（SOD）的测定应用酸性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所生产），反应于96孔酶标板中，用酶标仪测量各反应体在550nm波长下OD值。2.3 攻毒试验为测定溶菌酶的保护效果，在试验即将结束时每组取20尾虾，用副溶血弧菌对试验用虾进行攻毒，经过预试验确定副溶血弧菌的攻毒浓度为108cells/ml，注射剂量50ul/尾，预试验证明，攻毒后7d左右对虾的死亡趋于稳定，故本试验记录攻毒后7d内各组的累计死亡率，并计算相对免疫保护率(Relative Percent Survival, RPS):RPS=（1免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%2.4 实验结果2.4.1 溶菌酶对凡纳滨对虾非特异性免疫因子的影响由图1可以看出O2-的产量随着时间的延长呈上升趋势，2添加量组的O2-的产量最高，其次是1和3添加量组，对照组最低。由图2可以看出，PO活性随着时间的延长呈上升趋势，第7d后，2添加量组的PO活性最高，其次是1和3添加量组，对照组最低。由图3可以看出，SOD活性随着时间的延长呈上升趋势，第7d后，SOD活性依次为2添加组>2添加组>3添加组>对照组。由图4可知，随着时间的延长，对照组和实验组血清蛋白含量均呈先上升，到达最大值后逐渐下降趋势。图1 溶菌酶对凡纳滨对虾超氧阴离子（O2-）产量的影响Fig. 1 Effects of dietary lysozyme on the O2- of Litopenaeus vannamei图2 溶菌酶对凡纳滨对虾酚氧化酶（PO）活性的影响Fig. 2 Effects of dietary lysozyme on the PO of Litopenaeus vannamei图3 溶菌酶对凡纳滨对虾SOD活性的影响Fig. 3 Effects of dietary lysozyme on the SOD of Litopenaeus vannamei图4 溶菌酶对凡纳滨对虾血清蛋白含量的影响Fig. 4 Effects of dietary lysozyme on the protein concentration in the serum of Litopenaeus vannamei 2.4.2 攻毒实验结果攻毒试验结果显示，注射副溶血弧菌后8d, 对照组全部死亡，而试验组死亡率较低。溶菌酶对凡纳滨对虾对副溶血弧菌攻毒的免疫保护率分别达到了50、70、45。 图5 副溶血弧菌攻毒后试验凡纳滨对虾的累计死亡率Fig. 5 Accumulative mortalities(%) of Litopenaeus vannamei after challenge with Vibrio parahaemolyticus3 结果本文研究不同溶菌酶浓度水平对凡纳滨对虾非特异免疫因子的影响，包括存活率、死亡率，生长率等几方面因素。需要说明的是：每组实验的最终数值均有波动，导致规律不是很明显，但此实验之所以做了三个实验组和一组对照组，目的就是为了减少数值波动情况带来的影响。通过这几组数据的统计总结，以得出溶菌酶对凡纳滨对虾非特异免疫因子影响的范围和程度。下面就对这几方面因素分别进行分析。实验过程中，根据图表得出的结论可以明显看出在虾的饲喂过程中，由于添加溶菌酶的影响，所以，在3个实验组里，相对1个对照组来说，虾的存活率有极大的提高。4 讨论随着渔业生产的日益发展，我国渔业结构逐渐转向以水产养殖为主，水产养殖将从数量型转为质量型，然而制约养殖生产的问题也日益突出，如水环境污染、高密度养殖不可避免地将影响养殖对象的健康，使感染疾病的机率大大提高，导致养殖病害频繁发生，造成大量死亡。目前，防治水产动物疾病主要依靠药物。但经常用药物防治疾病，病原体很可能对某些药物产生抗药性，致使防治失败，且药物在水中积累过多，极易污染水体，造成水体生态平衡的破坏。所以，通过提高水产动物免疫力来抵抗疾病成为研究的热点。在20世纪80年代，对虾养殖业的发展曾给我国的水产养殖业写下辉煌的一笔，极大地带动了沿海地区的经济发展，并带动了沿海地区育苗、饵料生产、冷藏加工等相关产业链的同步发展，它所起到的作用是不可磨灭的。可是，进入90年代，特别从92年起，由于对虾病毒病在全国各地的蔓延，水产工作者一时又找不出合适的对策，导致对虾养殖业大伤元气，经济效益一落千丈。因此，水产工作者们一方面刻苦钻研对虾病毒病，另一方面探索对虾养殖业新的替代品种、新的经济增长点，于是南美白对虾的养殖浮出水面。1988年7月，南美白对虾由中国科学院海洋研究所从美国夏威夷引进我国，1992年8月人工繁殖获得了初步的成功，1994年通过人工育苗获得了小批量的虾苗，1999年深圳天俊实业股份有限公司与美国三高海洋生物技术公司合作，引进美SPF南美白对虾种虾和繁育技术，成功地培育出了SPF南美白对虾苗。2000年的早期苗的价格达到了400600元/万尾，2001年后逐步降低并基本维持在100元左右/万尾。成品虾价格也由引进初期的每斤近百元降至目前的10元左右。南美白对虾人工养殖生长速度快，60天即可达上市规格；适盐范围广（040），可以采取纯淡水、半咸水、海水多种养殖模式，从自然海区到淡水池塘均可生长，从而打破了地域限制，且具耐高温，抗病力强；食性杂，对饲料蛋白要求低，35%即可达生长所需。是“海虾淡养”的优质品种，使其养殖地域范围扩大。养殖南美白对虾，放养虾苗规格要在2厘米以上，经淡化到零度的种苗，池塘以3-5亩为宜，水深1.5米左右，放苗时间在5月底、6月初，水温在20以上，一般养殖条件下，亩放虾苗2万尾，并搭养500-100尾花、白鲢，以投喂颗粒饲料为主，定期使用光合细菌和水质调节剂，调控水质，预防虾病。南美白对虾体内很重要的一种物质就是虾青素，就是表面红颜色的成分，虾青素是目前发现的最强的一种抗氧化剂，颜色越深说明虾青素含量越高1。广泛用在化妆品、食品添加、以及药品。日本大阪大学的科学家最近发现，虾体内的虾青素有助于消除因时差反应而产生的“时差症”。结 论本实验显示，在溶菌酶拌饲投喂的情况下，在15ul/L的情况下，凡纳滨对虾的免疫和生长达到了一个初步的锋面，仅以本实验为例，在饲喂和观察过程中发现，使用溶菌酶作为添加剂拌饲喂养的实验组虾的活力和采食量均好于未进行溶菌酶拌饲投喂的对照组，在养殖过程中，实验组的水质情况也好于对照组，初步判断由于溶菌酶的存在，对水质也有一定的改良作用。所以得出结论，在水产动物的人工养殖和繁育过程中，将溶菌酶作为饲料添加剂进行拌饲投喂，可以在生产的初期显著改善水产动物的非特异免疫力，改善养殖环境，并在养殖过程中减少其他的抗菌杀菌药物的使用，真正作到“一劳永逸”，而且在收获时产量会较未使用溶菌酶作为饲料添加剂提高15%-25%。 参 考 文 献1 叶志桁等 水产养殖 南安市农业服务中心 2 李素莹 中草药对凡纳滨对虾生长和非特异免疫影响的研究 广东海洋大学 2009.3 曹登宫 凡纳滨对虾 中国科学院海洋研究所 2008.4 王镜岩 生物化学(上册)北京：高等教育出版社20025 荣晓花，凌沛学 溶菌酶的研究进展中国生化药物杂志1999.6 吴晓英，林 影，陈慧英 溶菌酶研究进展工业微生物20027 郑清梅，叶星，白俊杰，等. 斑节对虾溶菌酶基因克隆及序列分析J.水生生物学报，2004.8 King F D, Packard T T. Respiration and the activity of the respiratory electron transport system in marine zooplankton J. Limnology and Oceanography, 1975, 20: 849854. 9 Li Q, Liu W, Shirasu K, Chen W, Jiang S. Reproductive cycle and biochemical composition of the Zhe oyster Crassostrea plicatula Gmelin in an eastern coastal bay of China J. Aquaculture, 2006, 261: 752759.10 Morel F, Doussiere J, Vignais P V. The superoxide-generating oxidase of phagocytic cells: physiological, molecular and pathological aspects J. European Journal of Biochemistry, 1991, 201: 523546.8 Plana S, Sinquin G, Maes P, Paillard C, Pennec M L. Va