新型防腐剂富马酸乳糖甲酯的抑菌活性研究范文免费预览.doc

摘 要富马酸乳糖甲酯对混合菌群的生长具有良好的抑制作用，为考察富马酸乳糖甲酯的抑菌能力，进行了富马酸乳糖甲酯的抑菌谱试验及其在不同pH介质、不同浓度条件下的抑菌活性试验，结果表明：富马酸乳糖甲酯可延长微生物的生长适应期、降低微生物生长量、延长抗菌衰期。对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、面包酵母、黑曲霉、米曲霉的最低抑菌浓度（MIC%）分别为0.60、0.30、0.50、0.25、0.30、0.40、0.50；适当浓度的富马酸乳糖甲酯可使上述菌种的生长适应期由4h延长到72h以上，杆菌和酵母的抗菌衰期分别为58h和72h。不同防腐剂浓度实验结果表明富马酸乳糖甲酯对牛奶酸败混合菌有较好的抑制作用。关键词：抗菌剂；富马酸乳糖甲酯；抑菌活性AbstractLactose Methyl Fumarate exhibited good antimicrobial activity for the grows of mixed culture, in order to study the inhibition of methyl fumarate capacity of Lactose Methyl Fumarate, a antibacterial spectrum test about Lactose Methyl Fumarate in different pH media, different concentrations of the antimicrobial activity was taken.under the conditions of testing, The results showed that: Lactose Methyl Fumarate can be extended to adapt to the growth of micro-organisms, reducing microbial growth and prolong the half-life of antibacterial. The minimum inhibitory concentration (MIC%) of E. coli、Bacillus subtilis 、Staphyloccocus aureus Rosenbach、Sac-charomyces cerevisiae、Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae are 0.60、0.30、0.50、0.25、0.30、0.40 and 0.50; Appropriate concentrations of Lactose Methyl Fumarate can extend the adaptation period of the growth of these bacteria from 4h to 65h or more, bacteria and yeast, respectively, for the half-life of antimicrobial is 48h and 72h. The experimental results of different concentration of preservatives show that Lactose Methyl Fumarate had satisfied antimicrobial activity on mixture bacteria of milk. Keywords: Preservative; Lactose Methyl Fumarate; Antibacterial activity英文摘要的行间距要调整好 整篇论文的格式要重新审理较对目 录摘 要2ABSTRACT3第一章前 言11.1食品防腐剂的概念和分类11.2食品防腐剂的发展21.3食品防腐剂的作用机理41.4使用防腐剂的必要性41.4.1 食品质量安全问题41.4.2 使用防腐剂的必要性41.5 防腐剂的安全性51.6 防腐剂使用注意事项61.6.1 正确和合理使用防腐剂61.6.2 防腐剂与其他防腐方法相结合61.7本题选题依据及目的、意义7第二章 实验部分82.1实验仪器和药品82.2 抗菌特性研究实验92.2.1 供试菌种及其活化92.2.2 培养基的配制及其灭菌92.2.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定92.2.4 生长抑制实验102.2.5 抗菌性能评价指标112.3不同浓度对富马酸乳糖甲酯抗菌活性的影响的研究122.3.1 供试菌种及其活化122.3.2 培养基的配制及其灭菌122.3.3 对牛奶酸败混合菌的生长抑制实验122.3.4 不同浓度对防腐剂抗菌活性的影响实验12第三章 结果与讨论143.1 富马酸乳糖甲酯的抗菌特性143.1.1 最低抑菌浓度（MIC）143.1.2 对细菌和酵母的生长抑制作用143.1.3 与其他防腐剂的抗菌活性比较193.2 不同浓度对富马酸乳糖甲酯抗菌活性的影响193.2.1 不同浓度对防腐剂抗菌性能的影响19结 论22收获和体会23致 谢24参考文献25附 录.251.毕业论文选题表 2.毕业论文任务书 3.毕业论文开题报告4. 文献综述 5. 英文文献翻译（译文/原文）第一章 前 言食品是人类赖以生存的基本物质，新鲜的食品则是保障人类健康的基本条件。食品中含有许多丰富的蛋白质、碳水化合物和脂肪类营养物质，在物理、生物化学和有害微生物等的作用下，可以失去原有的色、香、味、形而发生腐烂变质。其中有害微生物的作用是导致食品腐烂变质的主要原因1。当今，地方食品要在全国流通，一国的食品要在世界销售，这必然要求食品密封包装、耐贮、耐运，因而使用食品防止腐剂、抗氧剂来防止食品腐烂变质是必要的2。食品的保鲜与防腐是食品加工生产的首要问题，而食品防腐剂的选择和安全性的检测与鉴定则是社会关注的热点问题。微生物引起食品变质可分为：细菌繁殖造成的食品腐败，霉菌代谢导致的食品霉变和酵母菌分泌的氧化还原酶促使的食品发酵。微生物繁殖需要有适合的客观条件，即适当的水分、温度、氧、渗透压、pH 值和光等3。通常可以用物理方法或化学方法来防止有害微生物的破坏，物理方法是通过低温冷藏、隔绝空气、干燥、高渗、高酸度、辐射等来杀菌或抑菌；化学方法就是利用防腐剂来杀菌或抑菌。防腐是针对有害微生物的，一是防止微生物造成食品的腐烂，二是防止产毒微生物（如黄曲霉等）的危害。防止微生物对食品的危害主要有以下几种方法：首先，防止微生物污染食物；第二，灭活有害微生物；第三，降低或者抑制受污染食品中微生物的生长，或使之失活。食品防腐剂主要是通过第三种方法，即抑制食品中微生物的生长起到防腐作用，它可以保证食品有较长的货架期3。食品添加剂多功能化将有助于生产工艺的优化、产品质量的控制以及新产品的开发4，5。食品化学防腐剂由于使用方便、效果好且不耗能，是重要的食品添加剂之一，在食品工业中被广泛应用。1.1 食品防腐剂的概念和分类食品防腐剂是防止因微生物作用引起食品腐败变质，延长食品保存期的一类食品添加剂。其防腐机制主要是降低食品的水分活度和 pH 值，破坏微生物的生长或代谢系统的正常运行，起到抑制微生物生长、延长产品货架期的作用。目前使用的防腐剂品种很多，美国有50多种，日本有 43 种，我国允许使用的超过 18 种，我国香港特区有 27 种。食品防腐剂分为化学防腐剂和天然防腐剂两大类。化学防腐剂又分为无机防腐剂和有机防腐剂。我国目前生产和使用的主要是有机酸及其盐类，如丙酸及其盐类、山梨酸及其盐类、苯甲酸类、对羟基苯甲酸酯类、乳酸和乳酸钠、双乙酸钠、单辛酸甘油酯、脱氢醋酸钠、焦亚硫酸钾等6。近年随着人们生活和消费水平的提高，对食品加工的要求向“绿色”、“天然”、“安全”的方向转变，因此，研制开发天然、安全的食品防腐剂已成为食品添加剂领域研究的热点。天然食品防腐剂是一类高效、安全、无毒副作用的防腐剂，不但对人体健康无害，而且还具有一定的营养价值。目前市场上销售及报道的天然防腐剂大致有以下几类： 植物类防腐剂，如果胶分解物、茶多酚、芥子提取物、大蒜素、甘草等；动物类防腐剂，如壳聚糖、海藻糖、鱼精蛋白、蜂胶、溶菌酶、抗菌肽类等；微生物类防腐剂，如乳酸链球菌素、纳他霉素等。但由于天然防腐剂生产、分离、提纯等各项技术成本较高，使其应用受到了极大限制7，8。1.2 食品防腐剂的发展防腐剂是用以保持食品原有品质和营养价值为目的的食品添加剂，它能抑制微生物活动、防止食品腐败变质从而延长保质期。不论人们持何种观点，都得面对这样一个事实：我们的生活已经与食品防腐剂密不可分了。其实，人类和食品防腐剂的关系可以追溯到远古，真正是“从手中到嘴里”，无需保藏食品。因为大自然总能提供充分的新鲜食品。人类开始定居生活后，便开始储藏食品。开始，保藏方法是干燥和腌制两种，因此饮食受到限制。根据文献记载，海员食品或乡下人冬季食物，部分或全部地依赖腌制保藏。随后使用的防腐剂品种增加了酒精、烟，CO2和许多有机酸（醋酸，乳酸）等。食品保藏随着工业化开始发生了变化，食品防腐剂也开始活跃起来，化学上的成就也逐渐应用于食品工业。K. Reichenbach1对烟熏的研究中发现：山毛样树的焦木酸和焦油中一种杂酚油物质，具有防止肉腐败的能力。从1884年以来的食品化学书上可以看到，除了食盐、干燥、热处理、乳酸、发酵、糖、酒精、醋和烟外，杂酚油是另一种有一定用处的防腐剂。表1-1列出了食品化学防腐剂的发展概况。从下表可见人们对防腐剂认识的不断探索。在远古时代，人们使用高浓度的盐、糖、醋等来保藏食品，随着科技的进步，生活水平的提高，人们防止食品腐败已不仅是采用简单的方法，只要求不破坏组织结构，而是要求保留其营养价值和风味，因此所用的防腐剂也在不断更新换代。例如，19世纪后叶，以甲酸作为防腐剂；20世纪开始，首先使用苯甲酸及其衍生物，直至今天还被用于食品防腐；20世纪30年代以后使用了丙酸盐，以及近代的山梨酸、脂肪酸，是至今所知道的在所有防腐剂中最无害的，并且目前仍被广泛使用着9。表1-1食品化学防腐剂的发展1年代防腐剂的发展史前时期食盐，烟古代醋，食油，蜂蜜二氧化硫用于保存葡萄酒1400年前Beukels发现酸渍保藏法1775年HoFer推荐使用硼砂1810年推荐用二氧化硫保藏肉1833年Reichenbach推荐杂酚油用于肉的保藏1858年Jaques发现了硼酸的抗菌作用1859年Hofman从花揪果浆果油中分离出山梨酸1865年Jodin发现了甲酸的抗菌作用1874年Kolbe和Thersch发现了水杨酸的抗菌作用1875年Flock发现苯甲酸的抗菌作用1903年美国允许苯甲酸作为食品防腐剂1907年Von Behring推荐用甲醛和过氧化氢作为牛奶防腐剂1913年Margolius发现了对氯苯甲酸的抗菌作用1923年Sabalitschka发现了对羟基苯甲酸酷的抗菌作用1938年Hofman, Dalby和Schweitae:推荐用丙酸作面包防腐剂1940年Millerh和Gooding各自发现了山梨酸的抗菌作用1947年Caleman和Wolf发现了脱氢醋酸的抗菌作用1950年开始全世界修订了新防腐剂的批准法1954年工业中大规模开始生产山梨酸1956年Bernhard,Thoma和Genth发现了焦碳酸二乙酯的抗菌作用在食品中添加高浓度的食盐、糖、醋及乙醇之类有防腐作用的物质是人们保存食品的古老方法，可降低水分活度，使菌体蛋白变性而达到防腐目的10。一般地讲，这类物质是在正常使用的情况下对人体无害或毒性较小，目前在我国食品卫生法规中不列为化学防腐剂来加以控制。此类物质更主要的是作为调味料使用。由于防腐剂只能延长细菌生长滞后期，因而只有未遭细菌严重污染的食品，利用化学防腐剂才有效。防腐剂并不能改善低质食品的品质，即如果食品腐败变质和氧化反应已经开始，则决不能利用防腐剂和抗氧化剂将已经腐败变质的食品变成优质食品。1.3 食品防腐剂的作用机理防腐剂抑制与杀死微生物的机理是十分复杂的，目前使用的防腐剂一般认为对微生物具有以下几方面的作用11，12：一、破坏微生物细胞膜的结构或者改变细胞膜的渗透性，使微生物体内的酶类和代谢产物逸出细胞外，导致结构受损或削弱或影响与膜有关的呼吸链电子传递系统，导致微生物正常的生理平衡被破坏而失活。二、防腐剂与微生物的酶作用，如与酶的巯基作用，破坏多种含硫蛋白酶的活性，干扰微生物体的正常代谢，从而影响其生存和繁殖。通常防腐剂作用于微生物的呼吸酶系，如乙酰辅酶A缩合酶、脱氢酶、电子转递酶系等。三、作用于遗传物质或遗传微粒结构，进而影响到遗传物质的复制转录，蛋白质的翻译等导致蛋白质部分变性、蛋白质交联而导致其他的生理作用不能进行等。由于食品科学的发展，相对来说时间较短，因而对防腐剂作用机理的解释还很不充分，还有待于进一步研究。1.4 使用防腐剂的必要性1.4.1 食品质量安全问题卫生部的专家多次指出，当今食品安全最严重的问题不是添加剂，也不是农药残留，而是由致病性因素引起的食源性疾病。世界卫生组织确定食源性疾病为：“凡通过摄入而进入人体的病原体使人体患感染性或中毒性疾病”。食源性疾病的病因分3类：1)微生物性；2)化学性，如农药；3)有毒动、植物。据卫生部对13个省市10年的监测显示：我国食物中毒事件中，微生物引起的食物中毒比例最大，达39.9%，而且大多发生在第2、3季度。这是因为第2、3季度气温高、湿度大，适合微生物生长繁殖。所以防止食品细菌腐败，应列入食品安全的重中之重13。1.4.2 使用防腐剂的必要性防腐剂有利于食品加工与保存，在食品工业中有不可替代的重要作用，已成为现代工业食品的重要辅助材料。食品防腐剂应食品生产的需要而生，伴随现代食品工业的发展而长。几乎所有食品都需要这些添加剂。当今，地方食品要在全国流通，一国的食品要在世界销售，就要求食品密封包装、耐贮、耐运，因而使用食品防腐剂来防止食品腐烂变质、保持食品品质是必要的。在食品中会因微生物的活动，引起食品腐败变质。食品的腐败变质就是以微生物的作用为主而导致食品质量下降或失去食用价值的一切变化。据FDA的估算，世界上每年约有20%以上的粮油及食品因腐败变质而造成巨大浪费和经济损失，由此引起的经济损失高达170亿美元。从2004年10月16日17日商务部召开的“农产品流通安全国际研讨会”上获悉，中国有近90%的食品、土畜产品出口企业受技术性贸易壁垒的限制，其中，中国农产品仓储运输设施和防腐保鲜技术落后引起的腐败变质是中国的食品安全得不到认可的重要原因。因此，使用食品防腐剂是很必要的，它不仅可以防止食品因微生物引起的变质，提高食品保存性能，延长食品保质期，同时还可以减少食品在储藏保鲜中的损失14。1.5 防腐剂的安全性到目前为止，我国只批准了32种允许使用的食品防腐剂，且都为低毒、安全性较高的品种。它们在被批准使用前都经过了大量的科学实验，有动物饲养和毒性毒理试验和鉴定，只要食品生产厂商所使用的食品防腐剂品种、数量和范围，严格控制在国家标准食品添加剂使用卫生标准规定的范围之内，是绝对不会对人体健康造成损害，可放心食用。表1.1几种常用防腐剂的评价指标指标ADI值mg·kg-1LD50(大鼠,经口)g·kg-1中国规定最大使用量g·kg-1苯甲酸0-52.7-4.440.2-1苯甲酸钠0-52.70.2-1山梨酸0-2510.50.2-2山梨酸钾0-254.2-6.170.2-2丙酸不限制5.63（FAO）丙酸钙0-105.162.5丙酸钠0-105.1（小鼠）2.5脱氢乙酸-1.000.3脱氢乙酸钠-0.570.61（日本）尼泊金甲酯0-10-1（FAO）尼泊金乙酯0-108（小鼠）0.1-0.25尼泊金丙酯0-103.7（小鼠）0.012-0.2尼泊金异丙酯0-107.17（小鼠）-尼泊金丁酯0-1016（小鼠，皮下）0.25（日本）尼泊金异丁酯0-108.390.25（日本）表1.1中列出了一些常用防腐剂的各项指标情况。ADI(每日允许摄入量)值是JECFA(联合国粮农组织和世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会)规定的，用于评价食品添加剂安全性的首要和最终依据，ADI值越大,说明该种防腐添加剂的毒性就越低。因此，食品添加剂的使用应在严格控制下进行1。1.6 防腐剂使用注意事项1.6.1 正确和合理使用防腐剂目前使用的防腐剂大多是人工合成的，超过标准使用会对人体造成一定损害。因此，我国对防腐剂的使用有着严格的规定，明确防腐剂应该符合以下标准：1）合理使用对人体健康无害；2）不影响消化道菌群；3）在消化道内可降解为食物的正常成分；4）不影响药物抗菌素的使用；5）对食品热处理时不产生有害成分15。使用防腐剂时，首先应对不同类型的食品的性质、不同保藏条件的要求等有全方位的了解，才能正确的去选择和使用有效的防腐剂。1) 首先要全面了解所用防腐剂的抑菌谱，使用的最低抑菌浓度和该食品可能带的腐败菌种类及其性质等，以便做到有针对性地使用。2) 要全面了解所用防腐剂本身的性状，其中包括溶解性、pH、对光和热的稳定性等，以便做到正确和合理地使用。3) 要了解食品本身的性质、食品加工条件、储藏的环境、期限等对防腐剂效果的影响，以便使所用的食品防腐剂能起到最有效的作用。1.6.2 防腐剂与其他防腐方法相结合为了提高食品防腐的效果，在添加防腐剂的同时，可以采用适当的其他措施来提高食品防腐的效果，这对工业生产是非常重要的。目前主要可以采取以下几项措施：1) 防腐剂的使用与加热方式相结合在食品中添加防腐剂之后，灭菌的温度在某些情况下比没有添加防腐剂的低得多，且灭菌时间也短，如将山梨酸或苯甲酸等防腐剂与加热方式相结合，可使酵母菌失活的时间缩短30%80%。2) 防腐剂的使用与冷冻方式相结合通常采用冷冻的方式可以直接限制微生物的增殖。在适当添加防腐剂和结合冷冻的条件下，能起到温室下添加大剂量的防腐剂才能起防腐作用的效果。3) 防腐剂的使用与辐照方式相结合在食品的辐照保藏中，防腐剂的使用与辐照之间存在着增效作用。如在水果、蔬菜、乳制品等产品中，在使用山梨酸防腐剂的同时可以减少辐照的剂量，从而减少和防止食品因辐照而产生的副作用，提高食品的品质，降低加工的能耗等16。1.7本题选题依据及目的、意义在通过好几十种防腐剂的量子化学参数与抗菌活性间的关系进行了比较系统的研究后，发现,-不饱和羰基结构是食品防腐剂抗菌活性的高效功能性结构，具有相距约0.25nm的电子容纳中心和电子供给中心组成的电子中继系统是食品防腐剂具有较强抗菌活性的反应中心的必备条件。抗菌活性中心键链基团的空间位阻效应是抗菌活性发挥的第一限制因子。而防腐剂分子中疏水基团的结构特征和疏水能力则对防腐剂抗微生物代谢性起决定作用。由于富马酸含有2个不饱和羰基结构，因此在富马酸衍生物中开发新的防霉防腐剂具有一定的可能性。因此，如何利用富马酸分子中的高效抗菌母体结构而又不产生毒副作用，具有重要意义17，18。根据此理论,研究开发天然活性成分的改性产物仍是寻求防腐剂等食品防腐剂的一个重要途径。,-不饱和羰基结构是食品防腐剂抗菌活性的高效结构，富马酸二甲酯是具有,-不饱和羰基结构的食品防腐剂代表物，能够抑制多种霉菌、酵母菌和细菌，且抗菌性不受pH值的影响，具有高效、广谱、价格低廉、稳定性高、耐热性好、毒性小等优点，同时它还具有接触和薰蒸双重杀菌作用。然而，富马酸二甲酯的升华特性使其易沉积于接触部位的细胞间隙中，抑制细胞呼吸而产生瘙痒过敏反应，频繁大剂量接触时，对皮肤及粘膜有强烈的刺激作用，会引起过敏，因而限制了其进一步应用。富马酸单甲酯具有富马酸二甲酯的优点，且抑菌能力更强，刺激性和毒性远比富马酸二甲酯小得多。其抑菌效果是目前已知的防腐剂中比较好的，是一种较理想的粮食、食品和饲料的防霉杀菌防腐剂，但富马酸单甲酯同样存在易升华的不足。，以富马酸分子为母体，将分子的一端甲酯化来保证合成产物的亲脂性，另一端引入糖基，合成的富马酸糖酯化合物具有良好的抗菌活性，试验以马来酸酐和甲醇为原料，经酯化及异构化得到富马酸单甲酯，再经酰氯化得到富马酸单甲酯单酰氯，富马酸单甲酯单酰氯与乳糖反应，采用相转移催化法合成具有、-不饱和羰基结构的富马酸乳糖甲酯。近年来，已经有人合成了反丁烯二酸葡萄糖甲酯19，20、反丁烯二酸蔗糖甲酯21 、 丁烯二酸桂醇甲酯22等。以马来酸酐和甲醇为原料，经酯化及异构化得到富马酸单甲酯，再经酰氯化得到富马酸单甲酯单酰氯。富马酸单甲酯单酰氯与乳糖反应，在相转移催化剂四丁基溴化铵的作用下，得到具有、-不饱和羰基结构的富马酸乳糖甲酯。其抑菌效果是目前已知的防腐剂中比较好的，是一种较理想的粮食、食品和饲料的防霉杀菌防腐剂，因此富马酸乳糖甲酯的合成研究具有重大意义第二章 实验部分2.1实验仪器和药品实验所需主要仪器及试剂分别见表2-1和表2-2所示。表2-1 主要仪器仪器名称型号生产厂家可见分光光度计722N型上海精密科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-30S11上海博迅实业有限公司医疗设备厂气浴恒温振荡器THZ-92B上海博迅实业有限公司医疗设备厂显数鼓风干燥箱GZX-9240MBE上海博迅实业有限公司医疗设备厂洁净工作台SW-CJ01BU上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热恒温鼓风干燥箱DHG-9246A上海精宏实验设备有限公司电子天平JY2502上海精密科学仪器有限公司电子万用炉200V AC 1000W天津市泰斯特仪器有限公司冰箱BCD-231E伊莱克斯表2-2 实验主要试剂及生产厂家试剂名称纯度生产厂家无水葡萄糖分析纯湖南湘中化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯天津市大茂化学试剂厂氯化钠分析纯洛阳市化学试剂厂盐酸分析纯广州东红化工厂无水乙醇分析纯广州东红化工厂富马酸乳糖单甲酯自制牛肉膏生化试剂广东环凯微生物科技有限公司蛋白胨生化试剂广东环凯微生物科技有限公司琼脂生化试剂广东环凯微生物科技有限公司牛奶市售马铃薯市售2.2 抗菌特性研究实验供试糖酯（富马酸乳糖甲酯）抗菌特性研究实验方案一 供试糖酯抑菌谱研究2.2.1 供试菌种及其活化a) 供试菌种细菌: 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；酵母：啤酒酵母、面包酵母霉菌：黑曲霉、米曲霉抑菌实验开始前，需将菌种活化。b) 菌种活化1) 细菌的活化方法 无菌操作从细菌菌种管中挑取一环菌苔，接种于营养肉汤培养基，并在37摇床培养至A560nm值约为0.4，菌体数约为105个/mL106个/mL。2）酵母接种麦芽汁培养基并在28培养至菌体细胞约为105个/mL106个/mL。3）霉菌菌种接种到马铃薯培养基中，在28C恒温箱中培养72h，可见培养基中有菌苔漂浮，摇动使霉菌的抱子进入到清液中，取培养基清液1mL，用约50ml的马铃薯培养基稀释，用细胞计数器测定其中的霉菌抱子数，最后调整悬浮液中抱子数约为1000个/mL。2.2.2 培养基的配制及其灭菌a) 培养基配制1) 营养肉汤培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，氯化钠5g，加水煮沸使各成分充分溶解，并定容至1000mL。冷却至常温后，用一定浓度的氢氧化钠调pH为7.67.8。营养肉汤培养基用于细菌的培养。2）马铃薯培养基：取去皮马铃薯200g切成小块加1000mL水煮沸20min，双层纱布过滤取汁，加葡萄糖15g，补足水至1000mL，自然pH值。若需要制成琼脂培养基，加入琼脂18 g，煮沸使琼脂充分溶解。用于霉菌培养。b) 培养基灭菌所用培养基均放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa，121保持30min进行灭菌。2.2.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定a) 实验原理最低抑菌浓度（Minimum Inhibition Concentration, MIC）是指在体外试验中能抑制培养基内微生物生长的最低浓度。MIC越小，抗菌活性越大，也就是说防腐剂具有较强的抗菌效能。MIC常用来表示防腐剂抑菌效果的指标，帮助确定防腐剂的大约有效抑菌浓度。b) 实验方法1) 细菌的MIC测定试管稀释法用无菌移液管将已活化的菌种1mL接种至1000mL营养肉汤培养基中，然后分装到大小一致的带有棉塞的无菌试管中，每试管10mL。分别加入0.1g/L、0.2g/L、0.3 g/L、0.4g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7g/L、0.8 g/L、0.9g/L、1.0g/L 10个浓度梯度（做预实验确定浓度梯度，上述浓度梯度值仅供参考）的供试糖酯，充分摇匀，置30（实验条件限制）摇床培养。72h后观察培养液的浑浊度，从无菌生长的培养管中找出最低防腐剂浓度的培养管，此培养管中防腐剂的浓度即为供试糖酯的MIC值。2) 酵母和霉菌的MIC测定平板涂布法将不同浓度的防腐剂溶液的n（此次实验n=10）个浓度梯度（n在1015间较佳，预实验决定n值）的培养基用无菌吸管定量地加入已经灭菌的培养皿中，然后加入一定体积的融化的麦芽汁琼脂培养基(霉菌用马铃薯培养基)，充分混合均匀。待培养基冷却后，用无菌吸管接种菌液0.2mL至培养基上，用三角耙涂布均匀。在28恒温下培养72h，观察菌体的生长情况，从无菌生长的培养皿中找出最低防腐剂浓度的培养皿，此培养皿的防腐剂浓度即为供试糖酯的MIC值 。4 抑菌圈直径的测定滤纸圆片法：用打孔器将定性滤纸制成6mm的小圆片，置于小培养皿中，160干热灭菌0.5h备用；将供试糖酯用95%乙醇溶解，配制成一定浓度的溶液；无菌操作下将灭菌后滤纸片浸在供试糖酯配成的溶液里，取出后贴在含菌平板上。每皿均匀分贴同种药液的纸片3片，相应溶剂空白对应的滤纸片2片；贴好滤纸片的培养皿置于恒温培养箱中培养，细菌于30恒温培养2436h，酵母菌和霉菌于28恒温培养4872h。取出后测定抑菌圈直径。2.2.4 生长抑制实验 实验方法1) 标记在无菌培养管上，分别标明接种菌液、供试防腐剂及其浓度和培养时间。2) 接种在无菌培养管中，用无菌移液管吸取一定量的0.2g/L供试糖酯，再用营养肉汤培养基将其稀释成为某一浓度。最后接入浓度为104个/mL的细菌或酵母菌菌液1mL。以不加防腐剂的培养基作为空白对照。3) 培养将已接种的培养管置恒温摇床振荡培养。其中，细菌培养温度为30，分别培养时间为0h、2h、4h、8h、16h、20h、24h、30h、36h、42h、48h、58h和74h；酵母培养温度为28，分别培养时间为0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h、36h、42h、48h、52h、58h、64h和74h，将标有相应时间的培养管取出，立即放冰箱中贮存。4) 测定最后一同测定其吸光度值，用560nm处吸光值的变化反映浊度的变化，即细菌或酵母生长量的变化。2.2.5 抗菌性能评价指标a) 生长适应期当微生物接种到新的培养基中后，最初并不立即开始繁殖，表现出培养基吸光值没有明显的增加。此阶段主要是调节体内代谢酶系以适应新的环境，变化主要发生在微生物个体内，是微生物生理生化状态的变化，而不是量的变化，不能从宏观上表现出来。所以，在微生物生长曲线上有一段时间吸光度一直维持在最初的水平，这段时间常被称为生长适应期14。生长适应期（t）为细菌和酵母从接种到A560nm值增加 5%所需要的培养时间。b) 半衰期和抑菌率由于微生物适应性强，易于产生抗药性，所以一般情况下防腐剂的抑菌效果均为时间的衰减函数：I=Ae-t。式中：I ¾¾时刻t（h）的抑菌率(%)；A ¾¾防腐剂在供试浓度下对目标菌种的最高理论抑菌率，反应了防腐剂的抑菌强度； ¾¾衰减系数。从衰减函数方程可求得防腐剂抗菌作用的最高理论抑菌率 A， 衰减系数，半衰期t 0.5值。抑菌率计算式 : 式中：空白在t时刻的A560nm值和接种时（t=0）A560nm值相比的增量；处理样品在t时刻的A560nm值和接种时（t=0）A560nm值相比的增量。其中，防腐剂的抗菌半衰期(t0.5)为防腐剂的抑菌率衰减到初始抑菌率一半时的时间。可由实验数据通过衰减函数求得，也可由抑菌率曲线直接粗略读出。其反映了防腐剂抗菌作用的持久性和稳定性，可作为判断抗菌剂是否具有实际开发应用价值的一项重要参数。2.3不同浓度对富马酸乳糖单甲酯抗菌活性的影响的研究2.3.1 供试菌种及其活化a) 供试菌种牛奶酸败混合菌群，从酸败的纯牛奶中分离得到。d) 牛奶酸败混合菌的自然发酵培养方法将新鲜的牛奶倒入烧杯中静置，使其在室温的条件下自然酸败。用滤纸将酸败产生的固体除去，所得澄清滤液即为牛奶酸败混合微生物菌群。使用时培养基中菌液添加量控制在560nm吸光值净增加0.05左右。2.3.2 培养基的配制及其灭菌a) 营养肉汤培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，氯化钠5g，加水煮沸使各成分充分溶解，并定容至1000mL。冷却至常温后，用一定浓度的盐酸或氢氧化钠将其pH值调至7.27.4。营养肉汤培养基用于牛奶酸败混合菌的培养。b) 培养基灭菌所用培养基均放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa，121保持20min进行灭菌。2.3.3 抑菌率计算时刻t时的抑菌率PI（%）采用下式计算：PI（%）=（1-A处理，t/A空白，t）*100式中A处理，t和A空白，t分别为添加供试糖酯和空白培养基在t时刻和0时刻A560nm值相比的增量。2.3.4 不同浓度对防腐剂抗菌活性的影响实验实验方法先用150mL的锥形瓶装好50mLpH值为7.2的肉汤培养基，再分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%（参考浓度梯度，需要预实验）的供试糖酯，培养时间为111h，应用比浊法测定不同浓度供试糖酯在指定观察时间的A560nm值，并以不加防腐剂的培养基作为空白对照。第三章 结果与讨论3.1 富马酸乳糖甲酯的抗菌特性3.1.1 最低抑菌浓度（MIC）表3.1富马酸乳糖甲酯对供试菌种的最低抑菌浓度（MIC）。菌种富马酸乳糖甲酯大肠杆菌0.60枯草芽孢杆菌0.30金黄色葡萄球菌0.50酿酒酵母0.25面包酵母0.30黑曲霉0.40米曲霉0.50在试验条件下，富马酸乳糖甲酯对革兰氏阴性菌大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.6，对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为0.5，其抗细菌效果不及山梨酸，丁二酸蔗糖甲酯和富马酸二甲酯，说明富马酸乳糖甲酯对不同细胞壁的细菌均有一般抑制作用。富马酸乳糖甲酯对酿酒酵母的最低抑菌浓度为0.25，富马酸乳糖甲酯对面包酵母的最低抑菌浓度为0.30，其抗酵母效果不及山梨酸，反丁二酸蔗糖甲酯和富马酸二甲酯。试验结果表明，富马酸乳糖甲酯对供试的细菌和酵母均有抗菌效果。但效果不显注，可能是由于合成的富马酸乳糖甲酯不纯导致。结果分析：由于供试防腐剂中所含的抗菌活性官能团（也就是，-不饱和羰基结构）。，-不饱和羰基结构是防腐剂发挥抑菌作用的有效功能结构。由于富马酸含有2个不饱和羰基结构，以富马酸分子为母体，将分子的一端甲酯化来保证合成产物的亲脂性，另一端引入糖基，所以富马酸乳糖甲酯有抗菌母体结构而又不产生毒副作用。3.1.2 对细菌和酵母的生长抑制作用3.1.2.1对细菌的生长抑制作用富马酸乳糖单甲酯对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长有较好抑制作用，影响结果见图3.1、图3.2和图3.3 图3.3 从图3.1、图3.2和图3.3上得到富马酸乳糖单甲酯对细菌的抗菌性能评价：1) 生长适应期添加0.4%的富马酸乳糖单甲酯后可有效延长细菌的生长适应期。枯草芽孢杆菌由空白对照的4h延长至42h，是空白的9倍。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌被杀灭了。添加0.5%、0.6%、0.7%的富马酸乳糖甲酯后，对大肠杆菌的生长适应期分别为24h、72h、72h；添加0.3%、0.4%、0.5%的富马酸乳糖甲酯后，对枯草芽孢杆菌的生长适应期分别为6h、24h、44h；添加0.4%、0.5%、0.6%的富马酸乳糖甲酯后，对苏云金芽孢杆菌的生长适应期分别为16h；72h；72h。2) 衰期由试验数据通过衰减函数求得结果，填于表3.4,为富马酸乳糖甲酯对供试细菌的抗菌衰期。表3.4防腐剂浓度对细菌的抗菌衰期的影响 浓度菌种防腐剂浓度号数 123大肠杆菌247272枯草芽孢杆菌62444金黄色葡萄球菌1672723.1.2.2对酵母的生长抑制作用富马酸乳糖甲酯对酿酒酵母和面包酵母的生长有较好抑制作用，影响结果见图3.5和图3.6。从图3.5和图3.6上得到富马酸乳糖甲酯对酵母的抗菌性能评价：1) 生长适应期添加0.25%的富马酸乳糖甲酯后可显著延长酵母的生长适应期。酿酒酵母由空白对照的8h延长至58h，是空白的7.25倍；面包酵母由空白对照的8h延长至64h，是空白的8倍。添加0.2%、0.25%、0.30%的富马酸乳糖甲酯后，对酿酒酵母的生长适应期分别为24h、50h、