布地奈德吸入对支气管哮喘大鼠支气管EOS和STAT6表达的调控作用.doc

布地奈德吸入对支气管哮喘大鼠支气管Eos和STAT6表达的调控作用文章来源 毕业论文网   目的  研究布地奈德(BUD)对支气管哮喘大鼠支气管Eos和STAT6表达的调控作用。方法 30只清洁级幼年健康雄性Wistar大鼠经造模后，随机分为对照组、哮喘组和BUD组。实验结束后对支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织匀浆进行细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)计数和分类计数；应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法测定血清中IL-4的含量；采用免疫组化法检测STAT6蛋白表达的变化。结果 (1) 哮喘组BALF中细胞总数、EOS绝对值和EOS占细胞总数的百分比(EOS)均显著高于对照组(P<001)，BUD组BALF中上述各项指标较哮喘组均显著降低P<0.01)；(2)BALF中IL-4的浓度哮喘组显著高于对照组(P<001)，BUD组较哮喘组显著降低(P<0.01)，而IL-4的浓度哮喘组显著低于对照组(P<0.01)，BUD组较哮喘组显著升高(P<0.01)；(3) 哮喘组支气管上皮细胞STAT6蛋白阳性表达较对照组明显增强(均为P<0.01)，BUD组较哮喘组明显减弱(均为P<0.01)。结论 哮喘大鼠支气管STAT6较强表达，上皮细胞是其主要表达细胞；BUD有抑制气道炎症的作用，下调STAT6及其基因表达，使IL-4合成减少可能为其重要作用机制。   布地奈德  哮喘  信号转导子和转录激活子6(STAT6)  IL-4         支气管哮喘是世界范围内严重威胁公众健康的主要慢性疾病之一，其发病率和死亡率呈上升趋势，已引起世界各国学者的高度重视和广泛关注，哮喘已成为患者家庭及社会一个沉重负担。哮喘时由于变应原，细胞因子等的诱导，导致STAT6的持续活化，过度表达，促进Th2的募集，增殖和优势表达IL-4，IL-3等Th2型细胞，使Th1/Th2比例失衡，通过STAT6诱和趋化EOS等细胞向气道的炎症部位聚集，引起气道炎症反应和AHR，因此STAT6有望成为哮喘的有效靶分子，研究针对STAT6的拮抗剂或抑制剂，通过调控STAT6所介导的信号转导系统来调控免疫系统，将为临床治疗哮喘开辟新的途径。         1  材料与方法         1.1材料         实验动物         一级（普通级）健康雄性Wistar大鼠，56周龄，30只，体重200220g，由佳木斯大学医学院实验动物中心提供。         1.2方法         1.2.1实验设计和分组         将30只Wistar大鼠根据随机数字表法随机分为3组：OVA致敏及激发哮喘模型组、BUD干预组、正常对照组，每组10只。         1.2.2实验试剂及材料         卵白蛋白（OVA）美国sigma公司（进口分装）；液态铝（Alum)美国PIERCE公司（批号20090222）；布地奈德雾化液(BUD)澳大利亚阿斯利康公司（批号20090516）；大鼠用STAT6免疫组化检测试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。         1.2.3动物模型制作         （1）致敏及激发哮喘阶段：苗会、薛全福等1人的研究报道制作哮喘模型，模型组大鼠在实验第1天于腹腔注射致敏原（含0.01OVA0.1ml及液态铝0.1ml，充分混匀30min），之后于实验第8天及第15天腹腔注射加强致敏，注射量相等，共2次。实验第22天起将大鼠置于自制45cm×30cm×25cm有机玻璃箱中雾化吸入1OVA溶液4ml激发哮喘，每天一次，每次30min，持续7天。正常对照组用等量NS替代OVA。         （2）BUD干预阶段：布地奈德组大鼠同模型组致敏及激发，激发前30min给予0.2mgBUD雾化吸入，每天一次，每次30min，持续7天。模型组、正常对照组用等量NS代替，持续时间相等。         1.2.4动物处理         各组大鼠于最后一次雾化激发12小时以1000u/ml肝素0.2ml腹腔注射抗凝，1戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，眼球放血、颈椎脱臼法处死大鼠，采集标本。         1.2.5试验指标采集与测定         （1）取血清：大鼠麻醉后用1000u/ml肝素0.2ml腹腔注射抗凝，用弯镊摘取双侧眼球取血约1ml，血液用低速离心机以2000r/min速度离心20min，取血清，-20保留，用ELISA法测定血清中IL-4水平。         （2）收集支气管肺泡灌洗液（BALF）：取血完毕后，即刻行气管插管左肺支气管肺泡灌洗生理盐水5ml×6,回收肺泡灌洗液(BALF),回收率>90%。取BALF回收液3ml经双层无菌纱布过滤,在4、1200 r/min离心10min分离细胞。离心沉淀细胞用生理盐水冲洗并调整细胞数为1.0×109/L,在细胞计数板上计数细胞总数。取已调整细胞数的BALF 30L,用特制的细胞涂片离心支架在4、1200 r/min离心10 min,通过离心作用使一定量细胞均匀平铺于载玻片上,冷风吹干,经HE染色后在高倍镜下计数100个细胞,同时进行细胞分类计数,每例动物计数3张涂片。         （3）肺组织收集及处理         支气管肺泡灌洗后迅速打开胸腔，取出左肺，蒸馏水冲洗，无菌处理，于4多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，进行HE染色和STAT6免疫组化检测。         1.3 STAT6表达的测量方法         采用图像分析仪对图像进行分析。每张切片在光学显微镜下放大400倍，随机选择至少5个高倍视野后，测定着色细胞平均吸光度(OD)，其平均值作为该切片的代表值。         1.4 统计学处理         数据均以均值±标准差（x-±s)表示，统计学处理采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD检验,单个样本前后比较采用配对T检验，取P0.05为有统计学意义，P0.01为有显著差异。         2  结果         2.1症状观察         模型组所有大鼠致敏激发后都出现烦躁不安、易惊、抓耳挠腮、毛发倒伏、大小便增多、呼吸增快、口唇发绀、腹部痉挛、弓背、最后伏俯不动等急性过敏反应，而治疗组及正常组相对较安静。所有大鼠无死亡。         2.2各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分比较         哮喘组及BUD组大鼠BALF中细胞总数，嗜酸性粒细胞（EOS）和中性粒细胞（N）占总白细胞的百分比均高于正常对照组（P<0.05）；而BUG组BALF中白细胞总数、EOS%和N%均低于哮喘组组（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05）。见表1。         表1  各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分组成（x-±s）                  注：与正常组比较,*P<0.05；与模型组比较，P<0.05         2.3各组大鼠BALF中WBC总数及Eos比例比较         大鼠BALF中，模型组WBC总数及Eos百分比较正常组明显增高，差异有显著性意义（P0.01）；治疗组WBC总数及Eos百分比较A组明显降低，差异有显著性意义（P0.01）；治疗组WBC总数虽稍高于正常组，但无明显差异（P0.05），治疗组Eos百分比仍较正常组高，差异有统计学意义（P0.05），见表2。         表2  各组大鼠BALF中WBC总数及Eos比例比较(x-±s)                  注：与正常组相比较P0.05 P0.01，与模型组相比较P0.01