I型胶原蛋白的结构与功能.doc

I型胶原蛋白的结构与功能摘要：胶原蛋白是一种多糖蛋白，含有少量的半乳糖和葡萄糖，是细胞外基质的主要成分。本文就I型胶原蛋白的结构、功能，以及利用生物反应器研究开发I型胶原蛋白的现状、前景进行了探讨。并介绍了它在医学、美容保健、食品、饲料等其他工业的应用进展。关键词：I型胶原蛋白；结构；功能；生物反应器Structure and Function of Type I CollagenAbstract ：Collagen protein is a kind of PST，containing a little galactose and glucose，and it is the basis of extracellular matrixIn this paper the structure and function of type I collagen and the situation and prospect of exploratory development of research were discussedand its applieation developments on medicine，aesthetic health care，food，feed and other industries were also introducedKey words：collagen protein；structure；function；bioreactor0 引言胶原蛋白(也称胶原)是蛋白质中的一种，英文名“collagen”，由希腊文演化而来，是一种多糖蛋白，呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，是细胞外基质(ECM)的主要成分，分子量为300ku。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，其由2条1链和1条2多肽链组成，3条肽链交互缠绕形成了绳索状的超螺旋结构，每一条胶原链都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链相互缠绕成右手螺旋结构，形成胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定。胶原蛋白中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸的27 ，也有报道说占13，胶原-链N-端氨基酸是焦谷氨酸，它是谷氨酰胺脱去一分子氨而闭环产生的毗咯烷酮羧酸，它在一般蛋白质中较少见。胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸的含量也特别高，是胶原蛋白质的特有氨基酸，二者均占14左右，而色氨酸、酪氨酸以及蛋氨酸等必需氨基酸含量低，因此，胶原蛋白属于不完全蛋白质。 胶原蛋白主要由成纤细胞或与其来源相类似的细胞如成骨细胞、成软骨细胞合成，生物体内胶原的合成一般包括一系列的过程，首先在胞内合成胶原蛋白分子形成前胶原，进而在胞外进一步聚合成胶原纤维和胶原束。1 I型胶原蛋白的结构胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，结构高度复杂，从分子结构、超分子结构，再到组织分布和功能等，具有显著的多样性。尽管如此，胶原蛋白的基本组成却是大同小异，在氨基酸序列上都含有(GlyXY)n重复序列，这些重复序列是构成三聚体结构基础，其中X通常为Pro，Y通常为Hy-Pm或Hy-Lys。几种常见类型胶原在体内的分布如表1所示。在胶原蛋白家族的众多成员中，I型胶原蛋白是被人们了解得最为清楚的、也是组织分布最为广泛的胶原蛋白。胶原类型 组织分布 I型 皮肤、骨、角膜、肌腱、肿瘤 型 软骨、玻璃体 型 皮肤、子宫壁、血管壁 型 基底膜、胎盘 V型 皮肤、胎盘、羊膜 型 子宫壁、皮肤、角膜 型 羊膜、皮肤 型 内皮细胞 型 软骨 x 型 软骨 型 软骨、脊椎盘 型 皮肤、腱 x型 内皮细胞表1 各类型胶原在动物体内组织的分布1.1 I型胶原的序列结构I型胶原分子含有3条 多肽链，每条链含有1000多个氨基酸，不同的脊椎动物I型胶原 链的氨基酸序列结构只有微小的差别。 多肽链中每3个氨基酸序列组成中就有一个重复的甘氨酸，因为甘氨酸有最小的侧链基团，这样的序列结构使 链间的距离缩短、空间最小，链与链间紧靠在一起形成的螺旋结构更稳定。大约有35%的重复结构单元Gly-X-Y中的X和Y残基分别为脯氨酸和羟脯氨酸。羟脯氨酸是由脯氨酸被脯氨酰羟化酶羟基化作用后演变而来的，其羟基对于氢键的形成以及三股螺旋结构的稳定都是必需的。羟脯氨酸在胶原的氨基酸组成中含有大约10%的量，其含量可用于定量测定胶原。此外，I型胶原的螺旋和非螺旋结构区还含有赖氨酸和羟赖氨酸，与羟脯氨酸的形成类似，羟赖氨酸是在内质网内通过赖氨酰羟化酶的作用，由赖氨酸的羟基化作用而形成的。赖氨酸和羟赖氨酸残基的共价交联，有利于胶原分子三股螺旋结构的稳定，同时羟赖氨酸的形成有利于糖组分的吸附，可以发生半乳糖化或葡萄糖半乳糖化，通过羟赖氨酸残基位点发生O-糖基化。1.2 高级结构胶原与大多数合成聚合物相比具有独特的生理和生物特性，这主要来源于胶原分子结构的复杂性。I型胶原每一条 链形成左手螺旋，每个螺旋结构区大小约0.87nm，3条 链又相互缠绕形成右手螺旋结构，每个螺旋结构区大小约8.6nm，三股螺旋形成的胶原分子平均分子量约300kD，长度300nm，直径1.5nm。三股螺旋分子间以一定间距、呈纵向对称交错排列形成原纤维。分子间交错距离为67nm，纵向相邻分子间距为40nm。化学结构示意图见图1。胶原原纤维再聚集形成纤维，然后再形成更大的纤维束。三股螺旋分子的有序聚集使胶原纤维具有一定的强度和韧性。()氨基酸序列结构(b)1条链的左手螺旋结构和3条链形成的右手三股螺旋结构(c)原纤维的聚集结构图1 I型胶原的化学结构示意图2 胶原蛋白的应用2.1 生物医学材料与临床应用由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度，又有可吸收性，在使用时既有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，又有较好的平滑性和弹性缝合结头不易松散，操作过程中不易损伤机体组织。胶原于不同的细胞之间存在很强的亲和力，与在伤口的愈合过程中起到关键作用的生长因子间也有着特殊的亲和力，在血液凝固后，还可以通过刺激组织的再生与修复来防止再次发生出血，所以胶原可以作为凝血材料。同时用合成材料或胶原蛋白在血浆代用品、人造皮肤、人工血管、骨的修复和人工骨和固定化酶的载体等方面的研究和应用方面都十分的广泛。2.2 美容与保健胶原蛋白由动物皮提取，皮中除胶原蛋白外还含有透明质酸、硫酸软骨素等蛋白多糖，它们含有大量极性基团，是保湿因子，且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用，可广泛应用于美容、美肤、美发用品中。胶原蛋白的美容功能主要是：保湿作用、修复皮肤、美白作用、润泽头发，它的保健功能主要体现在减肥、降压、降血脂、补钙和排出体内的铝。2.3 在食品中应用胶原蛋白在食品中有两方面的应用：一是功能，二是营养。人们食用含胶原蛋白丰富的食品，能有效地增加皮肤组织细胞的储水能力，增强和维持肌肤良好的弹性，延缓肌体的衰老，同时还可强筋健骨，增强体质。利用胶原蛋白的成膜性，可将其用作固化酶的膜材料和肉食品标签，现已经在欧洲实际应用，胶原蛋白可作为食品粘合剂合成纤维膜，用作肉类、鱼类等的包装纸。此外，胶原蛋白还可作为食品保护层，具有抗氧化性，可保持肉食品的颜色鲜亮。2.4 在其他工业的应用制革工艺过程中剩下的废弃物中含有丰富的胶原蛋白，可以提取出来用作饲料的动物蛋白资源，实现资源利用，同时近年来胶原蛋白在造纸工业、制革工业、Et用化工业等轻工业中也有越来越多的应用。随着研究技术的不断发展和进步，对于胶原蛋白的研究也将继续的深入，胶原蛋白也将应用的更加广泛。3 利用转基因生物反应器生产胶原蛋白3.1 转基因生物反应器转基因生物反应器通常利用以下生物体为材料：细菌(主要是大肠杆菌)、酵母(毕赤酵母、酿酒酵母)、单细胞藻类、昆虫细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物的转基因乳腺反应器(奶牛、奶山羊、兔、豚鼠、大鼠或小鼠)，以及动物膀胱上皮细胞反应器。由于细菌繁殖快，且培养条件要求低，因此是转基因生物反应器的首选材料。目前有不少药用蛋白在大肠杆菌中成功地进行了转基因表达，并且实现了工业化生产，如人胰岛素、干扰素及蛋白酶抑制剂等。然而大肠杆菌有个致命的缺陷，即大肠杆菌表达系统无法进行蛋白翻译后修饰，对于一些具有高级构象的人的药用蛋白，利用大肠杆菌表达后无法糖基化。同时，由于大肠杆菌是原核生物，没有ER，因此也没有能帮助蛋白质折叠成高级构象的分子伴侣蛋白及一些修饰合成蛋白如羟基化、形成二硫键的酶。另外，大肠杆菌表达的产物在分离时如稍有疏忽，就会含有一些热原，甚至还可能混有大肠杆菌自身的内毒素，这些都是潜在的隐患。胶原蛋白这种复杂的蛋白，在大肠杆菌表达系统中表达显然是无法形成高级结构的。酵母作为一种真核生物，自然具备分子伴侣蛋白，以及一些糖基化、羟基化、乙酰基化的酶，对于一些具有高级结构的蛋白及需要在合成后修饰的蛋白是比较理想的，而且酵母细胞的培养条件也较哺乳动物细胞低得多，非常适宜于大规模的工业化发酵生产。目前国内生产的乙肝疫苗都是利用酵母生产的。然而酵母系统对于翻译后加工的蛋白并非完全等同于哺乳动物，因而由酵母系统所生产的重组蛋白可能会有一些不符合要求的特性，如免疫原性、活性低等。活性低可能是由于重组蛋白侧链残基上的糖基化程度太高所致。至于以昆虫细胞作为表达系统来生产转基因重组蛋白，目前还处于实验室水平，虽然有些表达系统的产量很可观。这一系统的糖基化形式很特别，相比较而言，杆状病毒系统更加适合实验室水平的生产。哺乳动物细胞是生产一些哺乳动物药用蛋白的最理想的系统，但它的培养条件将其局限在实验室的水平上。在生产成本、所需设备与时间、生产管理、产物的纯化提取等方面，转基因哺乳动物的乳腺反应器都具有无比的优越性。有数据表明，建立一个10000L规模的哺乳动物细胞反应器，要用时35年，花费2.5亿5.0亿美元；而以一个大型哺乳动物的乳腺作为反应器的转基因“生物农场”，最多花费不超过8000万美元，甚至更少。鉴于上述优点，转基因乳腺生物反应器已经是当前开发的热点，目前由乳腺表达转基因重组蛋白的量有的可以达到每升几克的水平。表2列举了目前利用乳腺生物反应器生产的一些药用蛋白，其中有些已经通过美国FDA的审批进入市场(如入血清白蛋白)，有的还处于临床试验阶段。但是，乳腺作为重组蛋白的生产系统并非完美无缺。首先是转基因的牛或者羊从出生到性成熟能泌乳，需要较长的时间；其次，还有泌乳周期的间断问题，对于较小的动物如兔、大鼠，虽然生殖周期短，但是泌乳量又受到限制；而像胰岛素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等药物蛋白，对动物体自身也有毒副作用，当其在乳腺中高水平表达时，可能通过乳腺组织周围的微血管被重新吸收，对动物体本身严重不利，严重的还会造成动物死亡，这就限制了这些蛋白只能以前体或者非活性的形式在乳腺中表达。虽然转基因乳腺生物反应器还存在一些问题，且目前的技术手段还无法克服，但是综合乳腺生物反应器的优点，用其生产功能蛋白的前景还是美好的，毕竟还没有一种生物反应器更具有优越性与吸引力。3.2 利用转基因生物反应器生产胶原蛋白胶原蛋白是结构蛋白，与其他一些功能蛋白相比，胶原蛋白对于宿主本身是很温和的，至少不会因为被宿主本身吸收而对宿主产生毒副作用。早在1987年，Schnieke等就将人I型原胶原蛋白Pro1(I)基因导入到Pro1(I)缺陷的鼠Mov-13细胞系中此细胞系正常表达Pro2(I)，获得了具有正常功能的人鼠杂合的I型胶原蛋白。Toman等则在酿酒酵母中同时表达了4种基因，即Pro(I)、Pro2 (I)和P4H酶的2种亚基的基因，获得了稳定表达的重组人I型原胶原蛋白异源三聚体。1999年，有报道将完整胶原蛋白的Pro1(I)与Pro2(I)基因转入小鼠，并在小鼠乳腺中表达。Toman等也获得了转Pro1(I)原胶原基因的小鼠，乳腺中表达的原胶原量已达到8 mgmL，且所获得的原胶原蛋白能够形成同源三聚体的高级结构，但不足的是Pro与Lys残基羟基化程度不够。同源三聚体的I型胶原蛋白与成纤维原的I型胶原蛋白异源三聚体有相似的Tm 值，且长度相似，在正常的组织中有I型原胶原蛋白同源三聚体存在的现象。John等在小鼠乳腺中表达了Proa2(I)与P4H的d与B亚基的基因，在乳腺中获得的原胶原的产量达到50-200txgmL，原胶原上的脯氨酸残基羟基化程度与生物体正常的原胶原一致，并能形成同源三聚体结构，还有热稳定的三螺旋结构域。但是Toman和John等在小鼠乳腺中获得的都是成熟胶原的前体形式-原胶原。以这样的形式在乳腺中表达分泌蛋白是优是劣还不能一概而论，就是对于胶原这样的结构蛋白而言也很难加以评判。因为成熟的胶原蛋白的溶解度要比原胶原低几个数量级，所以在乳腺中分泌不会对宿主本身造成麻烦，但问题是以前体的形式分泌，要想成品化，还要通过N端、C端蛋白酶的消化以去掉前肽。迄今，I型胶原蛋白的转基因生产还处在实验室的规模，还没有在大的家畜(奶牛或者奶山羊)乳腺中表达的报道。然而面对日益增长的对胶原蛋白的需求，在牛或者羊的乳腺中生产I型胶原蛋白势在必行，目前，作者所在实验室正着手这方面的研究。虽然乳腺生物反应器生产蛋白还有很多问题亟需解决，但是随着技术水平的进步，新技术平台的不断出现，这些问题也会迎刃而解。由于乳腺生物反应器生产的重组人的药用和食甩蛋白是在最接近人体自然状态下合成的，所以有着很大的潜力和商业价值。在不久的将来，有很大一部分的人源性的药用或食用蛋白会在乳腺生物反应器中得到生产。参考文献1 Mayne R，Burgeson E RStructure and function of collagen types AcademidPressLondon19872 HayDECell biology of extracellular matrix New York：Plenum，19913 Nimni E M，Harkness D RMolecular structures and fun ctions of collagen，collagen vo11，Biochemistry，CRC Press，Boca Raton，19884但卫华，李建民，李志强，等皮胶原与组织工程J皮革科学与工程，2002，12(3)：l2-l65Dan Weihua，Li Zhiqiang，Liao longli，et a1Skin collagen and tissue engineeringCThe 5th 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