1028.不同浓度的硫酸长新碱对Hela细胞的增殖抑制和调亡作用的研究.doc

不同浓度的硫酸长春新碱对Hela细胞的增殖抑制和调亡作用的研究摘要：利用MTT法测定不同浓度的硫酸长春新碱对Hela细胞增殖的影响和观察硫酸长春新碱对Hela细胞凋亡的作用。结果发现：在一定范围内，随着硫酸长春新碱浓度的增大，其对Hela细胞增殖的抑制率也增大,表明了在一定的浓度范围硫酸长春新碱的药物作用表现出剂量依赖性；但当硫酸长春新碱的浓度大于4.5ug/mL时，随着的其浓度继续增大，对Hela细胞的增殖的抑制率逐渐降低，由此可知，在一定范围内，继续增加硫酸长春新碱的浓度，其对Hela细胞增殖的抑制率没有明显变化。通过用Gimesa染色表明,用硫酸长春新碱处理24 h 后, 部分细胞的细胞核形态发生变化, 细胞核凝聚。说明细胞已经发生凋亡。关键字：硫酸长春新碱 Hela细胞 增殖 细胞调亡宫颈癌是危害妇女生命及降低妇女生活质量的主要疾病之一,其发病率发展中国家高于发达国家,农村高于城市。在我国,其发病率占妇女恶性肿瘤之首,约为女性生殖器恶性肿瘤的72. 4 %93. 1 %1 。传统的宫颈癌治疗主要手术和放疗,这对早期宫颈癌可取得较好的疗效,但对于中晚期宫颈癌的治疗效果并不理想。这些患者往往死于肿瘤的复发和转移。自70 年代化学治疗途径的出现,宫颈癌的化疗被重视起来。临床上的常用化疗药物:顺铂,长春新碱,五氟尿嘧啶等均取得良好的效果。2 硫酸长春新碱( vincristine, VCR)为长春花生物碱类抗肿瘤药物, 曾用于包括神经细胞瘤、脑瘤、肺癌、恶性黑色素瘤和艾滋病相关Kaposi肉瘤等在内的实体瘤和血液肿瘤的治疗。3 MTT法是一种简便而快速的测定肿瘤体外药物敏感性的试验方法。本次实验通过利用MTT法测定不同浓度的硫酸长春新碱对Hela细胞增殖的影响和观察硫酸长春新碱对Hela细胞凋亡的作用。旨在为硫酸长春新碱在宫颈癌临床化学预防中的应用提供理论依据。1 实验材料与方法1.1 实验材料肿瘤细胞Hela细胞株由华南师范大学生命科学学院动物细胞工程实验室提供。1.2 实验方法1.2.1 接种：收集对数期Hela细胞，调整Hela细胞悬液浓度，使细胞浓度为23´104/ml，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。1.2.2 培养与药物处理：培养箱内培养2436h，吸出培养液加入不同浓度梯度的硫酸长春新碱各200 l，每个浓度至少接种4孔作为重复实验。1.2.3 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 l，继续孵育4 h，终止培养；弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150l，振荡30min，使结晶物充分融解。1.2.4 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。1.2.5 计算与分析：按照公式计算各种药物处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率（未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。若该值为正说明药物对细胞增殖具有抑制作用，若值为零表明药物对细胞增殖无影响；若值为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。1.2.6 通过细胞爬片的制备方法观察硫酸长春新碱对Hela细胞凋亡的作用。2 实验结果2.1 不同浓度的硫酸长春新碱对HeLa细胞增殖的影响不同浓度的硫酸长春新碱对HeLa细胞增殖的抑制作用结果如表1所示：硫酸长春新碱显示出较强的抑制HeLa细胞增殖活性的作用。由组1和组2的结果可得：在一定范围内，随着硫酸长春新碱浓度的增大，其对Hela细胞增殖的抑制率也增大,表明其抑制细胞增殖作用渐增强,同时也表明了在所选浓度范围硫酸长春新碱的药物作用表现出剂量依赖性；在试验的浓度中，硫酸长春新碱的浓度为1.5ug/mL对Hela细胞抑制率最大为-71.06%。但当硫酸长春新碱的浓度大于4.5ug/mL时，随着的其浓度继续增大，对Hela细胞的增殖的抑制率逐渐降低，由统计学卡平方测验得，逐渐降低的抑制率之间没有明显差异（P>0.05）,由此可知，在一定范围内，继续增加硫酸长春新碱的浓度，其对Hela细胞增殖的抑制率没有明显变化。表1 不同浓度硫的酸长春新碱对Hela细胞增殖的抑制率浓度(ug/ml)组1抑制率（%）浓度(ug/ml)组2抑制率（%）0.156-18.761.5-71.060.312-54.084.5-69.960.625-57.177.5-66.301.25-66.0010.5-65.202.2 硫酸长春新碱对HeLa细胞凋亡的作用的观察细胞体内凋亡程序一旦启动, 细胞就会按照既定的方式凋亡下去直至死亡.这个过程大体可分为三个大的阶段, 即凋亡初期、中期和晚期。细胞凋亡的过程可以通过核染色将细胞核的形态变化体现出来,从而对凋亡细胞作出判断。正常的细胞核染色均匀,成弥散状；而凋亡的细胞核发生凝聚, 在晚期出现凋亡小体。在本实验中, 通过用Gimesa染色表明,用硫酸长春新碱处理24 h 后, 部分细胞的细胞核形态发生变化, 细胞核凝聚。说明细胞已经发生凋亡。3 分析与讨论MTT法简单易行，便于掌握，但通过试验发现MTT法也存在若干问题。尽管MTT法在指导肿瘤临床化疗有着一定的意义，但毕竟是体外试验，脱离原发肿瘤的生长环境，肿瘤细胞培养的成功率相对较低。另外不能显示药物对正常组织的作用及毒性，没有宿主的药物代谢功能。4尽管能反映出化疗药物对肿瘤细胞的敏感性，但不一定与体内的效果完全相符。化疗药物在体内通过肝、肾器官对药物的修饰、排泄作用，可使药物疗效增强或减弱，而体外药物敏感性试验中，药物直接作用于细胞，这些修饰、排泄作用均无法体现 5。因此可以对本次试验做一些改善，例如可以将癌细胞与正常细胞共同培养，然后测定抗癌药物对其的影响。总之，尽量使体外试验环境更加接近体内环境，为药物在宫颈癌临床化学预防中的应用提供更有力的理论依据。长期以来的研究表明,细胞凋亡受到抑制,使得细胞生存期延长,是导致肿瘤发生发展的重要机制之一。“凋亡”是1972 年Kerr 等首先提出,是细胞的一种自主自杀过程,又称为程序性死亡( Programmed cell death ,PCD) 6 。指在一定的生理或病理条件下,细胞遵循自身的程序,主要通过内源性DNA 内切酶的激活而发动自动化死亡的过程,是一种基因控制的细胞主动死亡过程7 。凋亡负调控肿瘤的发生发展,细胞的凋亡受阻从而导致细胞群体凋亡和增殖的平衡受到破坏,异常细胞增殖速度超过凋亡速度,从而形成肿瘤。多数学者认为:治疗肿瘤最有效的途径是直接诱导肿瘤细胞凋亡。因此,诱导肿瘤细胞凋亡己成为治疗肿瘤的新靶点和新思路。本试验中,经过统计分析可知：当浓度在0.1561.5ug/ mL 浓度时,这种抑制增殖作用就会呈现出明显的剂量依赖。而当硫酸长春新碱的浓度大于4.5ug/mL时，随着的其浓度继续增大，对Hela细胞的增殖的抑制率逐渐降低。由此可知，在试验的浓度中，硫酸长春新碱的浓度为1.5ug/mL对Hela 细胞有着明显的抑制增殖作用。但，根据此数据可得：在1.5ug/mL4.5ug/mL之间，可能存在某一浓度的硫酸长春新碱对Hela细胞的增殖的抑制率大于1.5 ug/mL的抑制率，所以应该在多设计在1.5ug/mL4.5ug/mL之间的试验浓度，这样才可以得到更加准确的关于不同浓度硫的酸长春新碱对Hela细胞增殖的抑制率的曲线。总之，硫酸长春新碱对人宫颈癌Hela 细胞增殖具有抑制作用，但其具体作用机制还不完全明了,有待于进一步研究。本试验中,经硫酸长春新碱作用24 小时, Gimesa染色表明,发现部分细胞的细胞核形态发生变化, 细胞核凝聚。说明细胞已经发生凋亡。可以认为硫酸长春新碱对人宫颈癌Hela 细胞具有促使其凋亡的作用,但其具体作用机制还不完全明了,有待于进一步研究。参考文献：1 林巧稚.妇科肿瘤M.北京:人民卫生出版社,1982:16 182 周学武等.白藜芦醇对人宫颈癌 Hela细胞凋亡、增殖影响的J. 齐齐哈尔医学院学报.2008:29 卷,第20 期,75.3 陈红丽. 硫酸长春新碱 PLGA微球的制备及其性质J.中国医学科学院报.2007:341-3464 MAZZARIOL A，ZULIANI J，FONTANA R，et a1Isolation from blood culture of a Leclercia adecarboxylata strain producing all SHV·-12 ex·tended-spectrum beta-laetamaseJJ Clin Microbiol，2003，41(4)：1738-l7395 VICTOR LORIANAntibiotics in laboratory medicineMBaltimore：Williams& Wilkins1996：483 4846 Kerr J FR , Wyllie AH , Currie AR. Apoptosis : a basic biological phenomenon wit h wide - ranging imolications in tissue kineticsJ . Br J Cancer ,1972 (26) :2397 Vaux DL. Toward an understanding of t he molecular mecha2 nisms of physiologyical cell deathJ . Pro Natl Acad Sci USA ,1993 (90) :786