细胞培养基本知识课件.ppt

细胞培养,2019/11/11,申艳娜,shenyannasina,?,教材,细胞培养,（,Cell culture,）,司徒镇强,?,任教老师,申艳娜,shenyannasina,岳丹,yuedan1980yahoo,李晓蕾,leileili1225yahoo,?,授课,6,次理论课,+2,次实验课,细胞培养,?,细胞培养,(cell culture):,动植物细胞在体外培养,的条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。,?,细胞培养分为动物细胞培养和植物细胞培养，,其中动物细胞培养是指在体外无菌条件下，模拟,体内正常生理状态下的基本条件和环境，分离培,养机体组织细胞或建立细胞系，并使得细胞在体,外培养容器中长期生长或繁殖的方法。,应用领域广泛,?,病毒学,?,免疫学,?,遗传学,?,肿瘤学,?,分化及发育,?,细胞毒试验,?,临床医学及生物技术,第一章,细胞培养的基本知识,1.,掌握培养细胞的生长特点和生长条件。,2.,熟悉培养细胞的特性。,第二章,细胞培养室的设置、设备和准备工作,1.,掌握细胞培养实验室的设备使用方法和保养。,2.,掌握实验器材的清洗和消毒灭菌方法。,3.,了解细胞培养实验室的设置。,细胞培养的基本知识,体外培养细胞的分型,贴附型,大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依,赖性细胞，大致分成以下四型：,?,成纤维细胞,?,上皮型细胞,?,游走细胞型,?,多型细胞型,1,、成纤维细胞型,名称：,凡在培养中形态与成纤维细胞类似的,来源：,由中胚层间充质组织起源的组织如：,真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，,血管内皮,形态：,胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出,2,3,个长短不,等,的突起，中有卵圆形核,生长特点：,排列成放射状，漩涡状,细胞,细胞接触易断开而,单独行动，,游离的单独的成纤,维,样细胞，常有几个伸长的,细胞突起,成纤维细胞,HUVECs,人脐静脉内皮细胞,1.,细胞种类：人脐静脉内皮细胞；,2.,培养的天数：,4d,；原代培养；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X20,；,4.,培养基种类：,DMEM+15,胎牛,血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞呈梭,形，扁平形或多角形，贴壁生长。,骨髓间充质干细胞,1.,细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；,2.,培养天数：,7,天；,3.,放大倍数：,200,倍，倒置显微镜；,4.,培养基种类：,DF12+10,FBS,；,5.,细胞状态与特征简述：使用,percoll,密度,梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液,48h,，,这是,7,天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。,2,、上皮型细胞,名称：,仅形态上似体内，实际上不完全相同,来源：,来源于外胚层,、内胚层细胞,如：,皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：,类似体内的,上皮细胞扁平,，,不规则多角形,，中有圆,形核,生长特点：,易相连,成片，,相靠,紧密相连,成薄层,铺石状,生长,时呈,膜状,移动，,很少,脱离细胞群而,单个活动,上皮型细胞,SKOv3,（卵巢癌细胞）,1.,细胞种类：,SKOv3,（卵巢癌细胞）,2.,培养的天数：传代后,3d,；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X10,；,4.,培养基种类：,DMEM+5%,胎牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞贴壁生,长，生长速度较快。,CCL-149,1.,细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；,2.,培养的天数：,1d,（种在,48,孔板中）；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X20,；,4.,培养基种类：,F12K+10%,胎牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透,亮贴壁生长，,3,4,天传代一次，,Giemsa,染色。,3,、游走细胞型：,呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游,走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以,和其他细胞相区别。,CNE1,1.,细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；,2.,培养的天数：,3d,；,3.,放大倍速：相差,100,；,4.,培养基种类：,PMI1640+10%CS,；,5.,细胞状态与特征简述：贴壁细胞，,梭型成团生长。,4,、多型细胞型,?,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和,稳定的形态，可统归于此类。,SD,大鼠神经元,原代,1.,细胞种类：脑皮质细胞；,2.,培养的天数：,4-5,天；,3.,放大倍速：电镜,20000,；,4.,培养基种类：,DMEM+10%,小牛血清,+10%,马,血清；,5.,细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴,突和树突。,悬浮型,概念：,培养时,不贴附于底物而呈悬浮状态生长,来源：,自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞,特点：,在,悬浮中生长良好,细胞,圆形,，单个或小细胞团,优点：,生存空间大，,提供数量大，传代方便,(,不需消化,),，,易于收获，,可获得稳定状态,缺点：,观察不方便，很多细胞不能悬浮生长,(,尤以正常细,胞,),HL-60,分化细胞,Giemsa,染色,1.,细胞种类：,HL-60,；,2.,培养的天数：,ATRA 1,微摩尔作用,5,天；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X10,；,4.,培养基种类：,1640+8,胎牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：,悬浮细胞,，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或,消失，胞核呈杆状或分叶状。,KU812,1.,细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；,2.,培养的天数：,5d,；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X20,；,4.,培养基种类：,RPMI1640+10%,新生牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,HeLa,细胞,1.,细胞种类：人,HeLa,细胞传代培养；,2.,培养的天数：,7d,；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X200,；,4.,培养基种类：,DMEM+10%,小牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。,K562,细胞,1.,细胞种类：,K562,（人慢性红白血病细胞株）；,2.,培养的天数：传代后,2,天；,3.,放大倍数：倒置显微镜,X10,；,4.,培养基种类：,RPMI1640+10%,胎牛血清，,4mM Glutamine,；,5.,细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,每代贴壁细胞的生长过程,?,游离期,?,贴壁期,?,潜伏期,?,对数生长期,?,停止期（平台期）,?,游离期,悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。,?,吸附期,贴附底物，一般,24,小时内贴壁。,?,潜伏期,此时细胞有生长活动，基本无增殖。,细胞株潜伏期一般为,6,24,小时。,?,对数生长期,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进,行实验研究。,?,停止期（平台期）,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂,机制：接触抑制、密度依赖性,根据细胞生长的恃点，传代方法有,3,种：,1,悬浮生长细胞传代,离心法传代：离心（,1000,转,/,分,）去上清，沉淀物加新,培养液后再混匀传代。,2,半悬浮生长细胞传代（,Hela,细胞）,此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用,直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,3,贴壁生长细胞传代,采用酶消化法传代。,常用的消化液有,0.25,的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,首次传代注意事项,?,细胞生长密度不高时，不能急于传代,?,原代培养的贴壁细胞需控制消化时间,?,吹打已消化的细胞应减少机械损伤,?,首次传代时细胞接种数量要多一些,?,首次传代培养的,pH,应偏低些,?,小牛血清浓度可加大至,15%,20%,左右,细胞计数,?,计数结果以每毫升细胞数表示,?,细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同,?,血细胞计数器：手工计数细胞,?,Coulter,计数仪：人工计数,细胞计数步骤,?,1,、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板,上。,?,2,、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满,盖片和计数板之间。,?,3,、静置,3,分钟。,?,4,、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。,细胞数,/ml,4,大格细胞总数,/4,10,4,注意,：压线细胞只计,左侧,和,上方,的。,镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计,算，若细胞团占,10%,以上，说明分散不好，需重新制备细,胞悬液。,细胞培养室的设置、,设备和准备工作,细胞培养室的设置,无菌操作区：无菌操作室、净化工作台,孵育区：,孵箱,制备区：,培养液及有关培养用液的制备,储藏区：,各类冰箱、干燥箱、液氮罐,清洗和消毒灭菌区：,清洗、高压锅,细胞培养室常用基本设备,仪器：显微镜、培养箱、干燥箱、水纯化,装置、冰箱、细胞冷冻储存器、离,心机及天平、消毒器、滤器,培养用器皿：培养瓶、培养板、培养皿,培养操作有关器皿：贮液瓶、吸管、加样器,器械：,用于解剖、取材、剪切组织,特殊设备：酶标仪、超低温冰箱、荧光显微镜,旋转培养器、流式细胞仪,细胞培养室主要设备讲解,净化工作台,?,安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内,?,使用前,75%,酒精擦洗台面，紫外灯照射,30,分钟，,启动风机运转两分钟后再进行培养操作,?,净化工作区内不存放物品，保持洁净气流流型不,受干扰,?,3-6,个月更换初效无纺布，,3,年更换高效过滤器,?,使用完毕，清理台面上的物品，,75%,酒精擦洗台,面,?,定期进行功能测试，检查净化台各项工作指标是,否达标,细胞培养的实验用品,?,细胞培养瓶,?,25,平方厘米，正方斜颈,?,25,平方厘米，三角斜颈,?,75,平方厘米，正方斜颈,?,75,平方厘米，三角斜颈,?,150,平方厘米，正方斜颈,?,细胞培养板,?,6,孔，,?,12,孔，,?,24,孔，,?,48,孔,?,96,孔,?,细胞培养皿,?,35mm,?,60mm,?,100mm,?,冻存管,?,1.2ml,?,2ml,，,?,5ml,?,离心管,?,15ml,?,50ml,?,细胞刮器,滤,器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、,酶液等均采用滤过法除菌。,液氮罐,常用培养器皿及清洗,?,玻璃器皿的清洗,一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤,?,新的橡胶制品洗涤方法,0.5M NaOH,煮沸,15,分钟，流水冲洗，,0.5MHCl,煮,沸,15,分钟，流水冲洗，自来水煮沸,2,次，蒸馏水煮,沸,20,分钟，,50,烤干备用。,消毒前包装,?,常用的包装材料,牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔,火焰消毒,?,在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。,以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需,在火焰近处并经过烧灼进行。,?,培养瓶,?,滴管、试管、吸管,培养用品的消毒灭菌,干热消毒：玻璃器皿,160,90,-120,分钟,湿热消毒：布类、金属器械、玻璃器皿：,15,磅,20,分钟,常规使用液体：,15,磅,15,分钟,橡胶用品：,10,磅,10,分钟,紫外线消毒：实验室空气、操作台表面、桌椅等,照射半径,2.5,米,过滤除菌消毒：血清、合成培养液、酶等,消毒剂及抗菌素：,75%,酒精、过氧乙酸、乳酸、青链霉素,其它：电子消毒器、钴,60,照射,谢,谢！,