毕业设计（论文）不同啤酒酵母在不同发酵条件下发酵性能的比较.doc

前言啤酒是世界上产量最大的酒种，是世界性饮料酒。啤酒起源于大约在九千年前的中东古巴比伦与古埃及地区。中国在四五千年前就有古代啤酒，据尚书记载，中国周朝时期就有了啤酒。啤酒是以大麦麦芽、大米、啤酒花等为主要原料，经啤酒酵母和酿造水酿制而成的一种含CO2的低浓度酒精饮料，是酒类中酒精含量最低的饮料酒。啤酒性平和、味甘，具有清爽的苦味，有帮助消化、促进循环，滋补身体的功效。啤酒中不含防腐剂，且是在严格的卫生监控下，生产设备全部采用不锈钢材料，经过数周精心酿造而成。啤酒产品富含营养，是上等的液体食品，适量饮用有益于健康。啤酒产量居世界各种酒类之冠。目前全世界约有130个国家生产啤酒。世界人均年消费啤酒约为22 L左右，其中以德国和捷克等国家消耗水平最高，人均年消费啤酒在160 L以上，约为世界平均消费水平的8倍。英、美等发达国家也己经达到了每人每年80 L。而作为世界第一人口大国的中国，人均年占有量仅为世界平均水平。因此，我国的啤酒尚有较大的市场空间。现在，啤酒在世界许多地区正以他独特的方式影响着人们的生活。1.1啤酒的种类 啤酒种类繁多，一般可根据生产方式，啤酒的浓度、色泽、消费对象、包装容器和发酵所用的酵母菌的种类等进行分类。 根据色泽分类是啤酒最常见的分类方法，可分为三类：淡色啤酒，色度在514EBC (European Brewery Convention，欧洲酿造协会)单位；浓色啤酒，色度在1540EBC单位；黑啤酒，色度大于40EBC单位。 根据啤酒是否杀菌或杀菌方式的不同，可将啤酒分为鲜啤酒、熟啤酒和生啤酒。鲜啤酒是指啤酒仅经过一次粗过滤就进行包装，不经过巴氏灭菌而销售的啤酒，这类啤酒一般就地销售，在低温下保存时间一般为一周；熟啤酒是指啤酒灌装后，经过巴氏灭菌的啤酒，保存时间较长，可达三个月左右，有的可达到六个月；生啤酒是在生产工艺中不经热处理灭菌，主要采用微孔滤膜过滤的方法除去发酵液中的微生物，达到一定生物稳定性的啤酒，这种啤酒能保持纯正的啤酒自然发酵形成的风味。按啤酒的包装形式可分为瓶装啤酒、桶装啤酒和罐装(听装)啤酒。瓶装啤酒有玻璃瓶和PET瓶两种，在容量上有350, 500, 640毫升左右等几种;罐装啤酒有330,500毫升等规格。 按消费对象可将啤酒分为普通型啤酒、无醇（或低醇)啤酒、无糖或低糖啤酒、酸啤酒等。无醇或低醇啤酒适于司机或不会饮酒的人饮用。无糖或低糖啤酒适宜于糖尿病患者饮用。按啤酒发酵所用的酵母菌在发酵过程中的沉降性质和发酵的工艺类型，又可将啤酒分为上面啤酒和下面啤酒。1.2啤酒酿造技术1.2.1啤酒酿造工艺流程 啤酒酿造的基本原料是发芽的大麦、水、酒花和啤酒酵母。其生产过程包括麦芽的制备，麦芽汁的制备，包括糖化、过滤、煮沸、澄清、冷却，接种啤酒酵母进行的啤酒发酵，发酵后进行的过滤和澄清、灭菌、啤酒包装等工序。啤酒的生产过程涉及到两个主要的生物学变化过程麦芽制造和啤酒发酵。啤酒酿造工艺流程如图1所示。图1 啤酒酿造工艺流程1.2.2麦芽制备麦芽制备过程称制麦，啤酒大麦经清选、浸麦、发芽、烘干、焙燥、除根、包装等，制成具有特定性质的啤酒麦芽，其主要目的是将大麦、小麦等谷物原料通过种子的发芽过程，适度降解种子中的贮藏物质，积累足够量的酶类，并形成麦芽特定的风味。大麦浸渍吸水后，在适宜的温度和湿度下发芽，发芽时产生各种水解酶，如蛋白酶、糖化酶、一葡聚糖酶等，这些酶可将麦芽本身的蛋白质分解成肽和氨基酸，将淀粉分解成糊精和麦芽糖等低分子物质。发芽到一定程度，中止发芽得到绿麦芽，经过排潮、烘干、焙燥得到成品麦芽。麦芽质量的好坏是啤酒质量好坏的基础。麦汁制备是以麦芽为基料，将糊化后的大米等淀粉质辅料，与麦芽一同糖化，由麦芽中积累的酶类降解原料中的贮藏物质，调节糖化麦芽汁的组成和状态，加入酒花，经过滤、沉淀、蒸发，再冷却、充氧，形成具有一定浓度、特定的香气和口味的定型麦芽汁，这既是啤酒酵母发酵的基础培养基，也是啤酒成品的原料。麦芽经适当粉碎，加入温水，在一定的温度下，利用麦芽本身的酶或外加酶制剂进行糖化，主要将麦芽及辅料中的淀粉及蛋白质等水解成麦芽糖和氨基酸，便于酵母利用。为了降低生产成本，还可以加入一定比例的大米作辅料，大米需要先粉碎加水煮沸糊化。糖化醪用过滤槽进行过滤，得到麦芽汁，将麦芽汁输送到麦汁煮沸锅中，加入酒花煮沸，蒸发多余的水分。酒花是一种称为蛇麻或忽布的植物的雌花，加入到啤酒中，可使啤酒带有特有的柔和优美的酒花芳香和爽口的微苦味，能加速麦汁中高分子蛋白质的絮凝，提高啤酒的起泡性和泡持性，同时，酒花中的一些成份还能抑制某些微生物的生长，增加麦汁和啤酒的生物稳定性，延长啤酒的保质期。1.2.3啤酒酵母种子的制备 将啤酒酵母经三角瓶、卡氏罐、汉生罐、酒母罐到种子罐的逐级扩大培养，得到足够量的啤酒酵母种子液，接种到定型麦芽汁中就启动了啤酒发酵的过程，或者直接使用啤酒发酵沉淀的酵母泥经一定的处理后接种发酵。1.2.4啤酒发酵 啤酒发酵过程分为主发酵和后酵贮酒两个阶段。发酵结束后再进行发酵后期的澄清、过滤、包装、灭(除)菌，得到啤酒的成品。啤酒发酵生产中酵母是啤酒质量控制的关键。传统的啤酒根据菌种的沉降性质和发酵工艺不同，分为下面发酵和上面发酵啤酒两种类型，国内啤酒的主流工艺类型为下面发酵啤酒类型，我们平时所说的啤酒发酵也特指下面发酵。其工艺特点是:采用下面酵母，主发酵温度比较低，发酵进程比较缓慢，发酵的代谢副产物相对较少。主发酵完毕后，大部分酵母沉降发酵容器底部，其后发酵和贮酒期比较长，酒液澄清良好，CO2饱和稳定，酒的泡沫细微，风味柔和，保存期较长。（1）主发酵 在主发酵期间啤酒酵母将麦芽汁中的糖分转化为啤酒发酵的主要产物乙醇和二氧化碳，并产生一定的风味物质副产物，如挥发性醛类、醇类、羰基化合物、酸类、酚基化合物及含硫化合物等，作为啤酒风味的基础物质，这一过程通常需要发酵温度控制在610，持续710天。主发酵前期为酵母繁殖阶段，啤酒酵母利用麦芽汁中糖类和氨基酸等营养原料，以及麦汁中的溶解氧，合成酵母细胞物质进行繁殖。此阶段发酵液降糖较慢，-氨基氮迅速被同化，酵母细胞数逐步上升。当溶解氧消耗完以后，就进入发酵阶段。这一阶段糖浓度下降较快，麦汁中的糖类(主要是麦芽糖)被转化为酒精，同时发酵液温度上升，需进行冷却。（2）后发酵及贮酒 后发酵贮酒通常是在约0的低温条件下贮存310周，完成残糖发酵、去除凝固物、饱和CO2、提高啤酒胶体稳定性以及促进啤酒风味成熟。由于啤酒生产的后发酵期在啤酒的整个酿造过程中生产期最长，因而是提高啤酒生产效率的关键环节。缩短啤酒生产的后发酵期，可以缩短啤酒发酵生产周期，从而节约巨大的贮存容积，提高设备利用率；同时还可以节省冷冻容量，降低产品的能源消耗，最终降低啤酒成本。在传统啤酒生产的后酵中，随着时间的延长，啤酒中残留的糖份逐渐被啤酒酵母发酵完全，啤酒逐步被二氧化碳饱和，酵母、冷凝固形物及酒花树脂等在低温和适当pH值下缓慢沉淀，酒液逐渐澄清，同时发酵液中的风味成分液逐步改变，形成特定的风味体系，啤酒逐渐成熟。在后酵成熟中可以采用人工充二氧化碳，离心分离酵母，添加非生物稳定剂(硅胶、单宁酸、蛋白酶等)吸附沉淀及分解高分子蛋白质和多酚物质等多种成熟工艺方法，缩短发酵作用时间，达到后酵贮酒的目的。1.2.5发酵工艺控制发酵过程的工艺控制也是啤酒发酵的主要技术因素。主要有发酵温度、发酵罐压力、酵母分离时间和方法、酵母悬浮细胞密度、后发酵贮酒的条件和时间等。其中发酵温度最为重要，一般啤酒发酵温度宜采用较低温度发酵，下面啤酒为712，可以防止或减少细菌的污染，减少代谢副产物的生成，有利于啤酒风味的形成，主发酵温度的不同也显著地影响啤酒的风格。发酵罐压力及C02浓度对发酵影响也较大。发酵罐压力通常是由于发酵中产生的CO2保压形成的，因此CO2的浓度随压力的增加而增加，造成酵母增殖减少，发酵迟缓，代谢副产物也减少。另外发酵其它工艺条件对啤酒发酵也有较大的影响。1.2.6菌株的选择和使用发酵菌株的特性将深刻地影响到微生物发酵过程的多个方面。对啤酒发酵也是一样，菌株特性影响着酵母对糖的利用、氨基酸的同化、主产物酒精的发酵、副产物的形成、啤酒风味的成熟以及啤酒的稳定性等。同时还要考虑菌株特性对发酵过程控制操作最有利。啤酒酵母特性需要注意酵母的发酵速度、发酵限度、凝聚性、回收性以及稳定性等。在菌种的使用上要根据菌种的特性制定扩大培养工艺，以保证发挥最大作用：啤酒酵母的接种量也要适当提高，接种量高发酵速度快，发酵终了时新增酵母细胞少，副产物双乙酞峰值低，高级醇生成也少，对啤酒发酵整体有利，但接种量过高也会导致发酵后期酵母活力下降，后发酵不彻底，造成啤酒品质下降。1.3啤酒发酵技术发展世界啤酒工业总的发展趋势是扩大生产规模，采用大容量发酵罐;从工艺入手，缩短生产周期。从啤酒发酵机理出发，在接近主酵完成之时，提高发酵温度，加速了双乙酞的还原和啤酒的成熟，因为双乙酰还原是啤酒成熟和缩短酒龄的关键，从而大大缩短了生产时间;设计并采用了多种型式的大容量发酵罐;采用一罐发酵，简化生产工序，主酵和后酵不再严格区分，缩短生产时间;研究固定化酵母发酵技术，采用连续发酵，是目前啤酒发酵技术的最大特点。麦汁缓冲性是指麦汁在其pH值范围内具有一定的缓冲能力。麦汁缓冲容量是衡量麦汁缓冲能力大小的尺度。许多研究证实，从麦汁到啤酒这个过程中，虽然缓冲体系的主要缓冲物质发生了变化，但是整个缓冲体系的缓冲容量保持相对不变，因此，麦汁的缓冲性与啤酒的缓冲性息息相关;从另一种角度讲，麦汁这种缓冲性在一定程度上，决定了成品啤酒pH值并控制着成品啤酒pH值的变化幅度。啤酒品质及其控制技术 啤酒是一种饮料酒，同时也是一种营养食品。各国对啤酒的需要量很大，而且出现不断增长的趋势。中国是世界啤酒生产消费第一大国，随着啤酒行业的发展以及人们生活水平的提高，人们对啤酒提出了更高的要求，包括啤酒的卫生要求、风味品质、质量指标、外观包装等多个方面。1.4啤酒的风味及成熟啤酒麦汁没有令人愉快的风味，只有通过啤酒酵母的发酵产生一系列的代谢产物，才能构成啤酒特有的香味和口味。主要代谢产物是乙醇、CO2和水，高级醇则是酵母发酵主要副产物，它和双乙酰对啤酒风味影响较大。啤酒中的高级醇也称为杂醇油是构成啤酒酒体的重要物质，是啤酒的风味成分之一。啤酒中高级醇类主要有异戊醇、异丁醇、活性戊醇、一苯乙醇、正丙醇等。适宜的含量，会给人以醇厚、丰满之感，饮后有愉快的感觉。但如果含量偏高，就会造成相反的结果，不但会给啤酒带来不愉快的后苦味，还会令饮者有“上头”的感觉。据有关规定资料介绍，如果以对人体交感神经、视觉神经等大脑细胞伤害程度的大小将乙醇对人体的毒性定为1，那么异丁醇为8，异戊醇为19，而异戊醇在啤酒高级醇中的含量最高，约占50%，可见高级醇比乙醇对人的伤害更大。己经证实饮啤酒上头是由于高级醇含量过高引起的。因此，控制啤酒中高级醇的含量对提高啤酒质量，改善啤酒风味有着十分重要的意义。啤酒成熟的标准是纯正、爽口，无异杂味。它的风味成分主要来源于啤酒的原料大麦芽及其它谷物辅料、酒花和酵母的发酵作用，其中，起重要风味作用的主要是双乙酰（diacetyl)。双乙酰及戊二酮的阈值因啤酒的种类而不同，下面发酵啤酒中的阈值低于上面发酵啤酒。某种风味物质“阈值”是指该风味成分能够被人感觉到的最低浓度。一般说，在发酵啤酒中双乙酰的阈值是0.1 mg/L。当双乙酰在啤酒中的浓度超过阈值时，会产生一种令人不愉快的馊酸味(双乙酰味)，从而破坏了啤酒的风味，影响啤酒的质量。由于双乙酰的产生与还原贯穿整个啤酒发酵过程，其含量已成为啤酒发酵成熟与否的标志。1.5啤酒酵母概述啤酒酵母（S.cerevisiae Hansen）它在麦汁中25培养三天，细胞为圆形、卵形、椭圆形到腊肠形.按细胞长与宽之比又可分为三组。第一组细胞长宽比为12（<2）细胞为圆形或卵形。此组根据细胞大小又可分成大、中、小三型。此组酵母主要用于酒精（淀粉质原料）和白酒等蒸馏酒的生产，其中如德国2号、德国12号（Rasse .Rasse ）,应用极为广泛。这组还包括了葡萄酒酵母和魏氏酵母。第二组长宽比为1：2，以长卵形为主。此组酵母细胞出芽长大后不脱落，再出芽，易形成芽簇-假菌丝。主要用于啤酒、果酒酿造和面包发酵。第三组长宽比>2,细胞为长圆形至腊肠形,此类酵母耐高渗透压,用于糖蜜酒精和朗姆酒生产,台湾396号酵母即属此组。典型的啤酒酵母短轴与长轴之比为1：（101.5）.而且大多数优良菌株在1：（1.11.3）之间.细胞拉长是变异的结果或发酵后期营养不足造成的。在液体培养时，细胞是单个的或有一个子细胞，子细胞为母细胞2/3体积即脱落。细胞大小 ：细胞可以分成两类，大型细胞尺寸为（6.88.0）×（8.09.0）µm,体积大于176µm³中小型(3.66.5)×(6.88.0) µm,体积100160µm³。中、小型酵母虽有的凝聚性很好，但大多数不如大型的。不过在相同的接种量下，中小型细胞比表面积大，发酵速度较快。近几年人们倾向于挑选中小型细胞的菌株。1.6响应面分析本研究介绍一种较为先进的实验设计方法响应面分析法RSA (Response Surface Analysis) 。RSA 方法以回归方法作为函数估算的工具,将多因子试验中因素与试验结果的关系用多项式近似,把因子与试验结果(响应值) 的关系函数化,依次可对函数进行面分析,定量地分析各因素及彼此之间交互作用对响应值的影响。由于采用了合理的实验设计,能以最经济的方式,用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究,科学地提供局部与整体的关系,从而取得明确的、有目的的结论,故近年来越来越为食品界科技人员所重视。1.7研究意义啤酒酿造就是酵母将麦汁中的糖分发酵成乙醇和二氧化碳的过程。在这个转变过程中，酵母发挥了极其重要的作用，同时形成了对啤酒的口味、香味及其它特性有重要影响的发酵副产物，不同的酵母和发酵工艺对啤酒的口味特点起决定性的作用。同时，我们还发现同一酵母菌在不同的啤酒生产厂表现出不同的特性，这说明环境因素的不同会引起酵母基因表达的变化，因此采用响应面实验设计了四因素三水平的发酵参数实验，用以确定合适的发酵条件，发挥每一株酵母的最佳性能，确保发酵过程的稳定性和一致性，从而进一步保证啤酒质量的一致性。1.8 研究方案去生产厂取麦汁，然后根据要求调配，经过酵母发酵后测定发酵液关键性指标，最后用Design-Expert软件分析，方案如下：麦芽汁调配发酵检测Design-Expert软件分析1.9响应面分析本研究介绍一种较为先进的实验设计方法响应面分析法RSA(Response Surface Analysis) 。RSA 方法以回归方法作为函数估算的工具,将多因子试验中因素与试验结果的关系用多项式近似,把因子与试验结果(响应值) 的关系函数化,依次可对函数进行面分析,定量地分析各因素及彼此之间交互作用对响应值的影响。由于采用了合理的实验设计,能以最经济的方式,用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究,科学地提供局部与整体的关系,从而取得明确的、有目的的结论,故近年来越来越为食品界科技人员所重视。1.10研究意义啤酒酿造就是酵母将麦汁中的糖分发酵成乙醇和二氧化碳的过程。在这个转变过程中，酵母发挥了极其重要的作用，同时形成了对啤酒的口味、香味及其它特性有重要影响的发酵副产物，不同的酵母和发酵工艺对啤酒的口味特点起决定性的作用。同时，我们还发现同一酵母菌在不同的啤酒生产厂表现出不同的特性，这说明环境因素的不同会引起酵母基因表达的变化，因此采用响应面实验设计了四因素三水平的发酵参数实验，用以确定合适的发酵条件，发挥每一株酵母的最佳性能，确保发酵过程的稳定性和一致性，从而进一步保证啤酒质量的一致性。材料与方法2.1材料麦汁、崂啤酵母（图2）、青啤酵母（图3）、糖浆、氧气、硫酸锌等。图2 崂啤酵母 图3 青啤酵母2.2主要仪器Z1 Counter® Particle Counter计数仪HZQ-F160恒温振荡培养箱REVCO生化培养箱Lambda 2S分光光度计VX100型混匀器ANTON PAAR啤酒分析仪 APS-2HYPERSIL NH2 柱2695型高效液相色谱分离单元Waters 2414示差折光检测器250mL发酵管（2cm×1.2m）4080 SHINVA®灭菌锅DELTA 320 PH计Milli-QPlus纯水制备仪HZQ-F160 HDL®全温振荡培养箱CB150 WTB BINDER生化培养箱WBG-0-2 二等标准汞温度计Clarus 500气相色谱仪DB-5 色谱柱3K15型低温高速离心机美国BECKMAN COUNTER公司哈尔滨东联公司美国REVCO公司美国PERKIN ELMER公司美国LABNET公司奥地利ANTON PAAR公司美国THERMO公司美国WATERS公司美国WATERS公司青岛海洋大学玻璃仪器厂定制山东新华医疗器械股份有限公司 瑞士METTLER TOLEDO公司美国MILLIPORE公司哈尔滨东联电子技术开发有限公司 德国WTB BINDER公司上海华辰医用仪器有限公司美国PERKIN ELMER公司美国AGILENT公司德国SIGMA公司2.3实验方法2.3.1酵母计数仪的使用由于测量时取样是200l，加入酵母计数仪的烧杯中，烧杯内装有100ml离子水，所以计算测量结果时需要将酵母计数仪上显示的数据乘以500才是真正结果。在测量之前要放入空白离子水校正酵母计数仪，使其测量结果在显示屏上显示在300以下最后，这样测量的结果才比较准确。测量结束后要将酵母计数仪循环12次防止酵母或大的其他粒子堵住计数仪上的计数管上的小孔。2.3.2酵母的添加根据测量结果计算出需要加入的扩培酵母的量，放入50ml离心管中，放入3K15型低温高速离心机中用4000r/min离心5min，然后将离心后的酵母泥加入SCHOOT瓶中。2.3.3不同糖度麦汁制备从青岛啤酒四厂发酵车间取未充氧麦汁30L，带回青岛啤酒科研所待测。用糖度计测量所取麦汁为13度麦汁，实验要求所需培养基为13度，15度和18度。13度麦汁需要 3.5L，15度麦汁需要8.5L，18度麦汁需要3.5L。15度麦汁用13度麦汁加一定量的75度糖浆配制，18度麦汁同样如此。添加糖精的计算方法：15度的计算方法8500×0.15(8500-X)×0.13+X×0.7518度的计算方法3500×0.18(3500-X)×0.13+X×0.75 分别计算得出15度需要13度麦汁8226ml，糖精274ml,18度需要13度麦汁3218ml，糖精282ml.15度麦汁的配置：用1L量筒取8226ml麦汁分别放入两个5L的三角瓶中，然后用250ml量筒取250ml糖精倒入其中一个三角瓶中，用三角瓶中的麦汁冲洗量筒，再用50ml量筒取24ml糖精倒入同一个三角瓶，同样用三角瓶中的麦汁冲洗干净，然后将另一个三角瓶中的麦汁与这个三角瓶中的麦汁混匀。混匀后用20度糖度计校正所配麦汁，适量加减麦汁或糖精。18度麦汁的配置：用1L量筒取3218ml13度麦汁放入5L三角瓶中，再分别用250ml和50ml量筒取282ml糖精加入三角瓶中，用三角瓶中的麦汁反复冲洗量筒将麦汁混匀。混匀后用20度糖度计校正所配麦汁，适量加减麦汁或糖精。2.3.4不同锌离子量麦汁制备根据锌离子量再将三种麦汁分别配置成0.15ppm，0.35ppm，0.5ppm。由于麦汁中锌离子含量为0.15ppm，所以只需配0.35ppm，0.5ppm。首先用电子称取ZnSO4.7H2O 0.442g，放入装有1L蒸馏水的烧杯中，配置成锌离子为100ppm的溶液待用。13度麦汁锌离子含量为0.15ppm需要500ml，0.35ppm需要2000ml，0.5ppm需要500ml。15麦汁锌离子含量为0.15ppm需要2000ml，0.35ppm需要4000ml，0.5ppm需要2000ml。18度麦汁锌离子含量为0.15ppm需要500ml，0.35ppm需要2000ml，0.5ppm需要500ml。13度麦汁锌离子含量为0.35ppm需要100ppm溶液量的计算方法：2000×0.35（2000-X）×0.15+X×100，计算得出需要100ppm溶液4ml。0.5ppm需要100ppm溶液量的计算方法：500×0.5（500-X）×0.15+X×100得出需要100ppm溶液1.75ml。15度麦汁锌离子含量为0.35ppm需要量的计算方法：4000×0.35（4000-X）×0.15+X×100，计算得出需要100ppm溶液8ml。0.5ppm需要100ppm溶液量的计算方法2000×0.5（2000-X）×0.15+X×100得出需要100ppm溶液7ml。用同样的计算方法得出18度麦汁锌离子含量为0.35ppm需要100ppm溶液溶液4ml，0.5ppm需要100ppm溶液1.75ml。取13度麦汁2000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取4ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.35ppm麦汁。再取13度麦汁500ml放入1L三角瓶中，用200ul移液器取1.75ml100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.5ppm麦汁。分别贴上标签。取15度麦汁4000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取8ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.35ppm麦汁。再取15度麦汁2000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取7ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.5ppm麦汁。分别贴上标签。取18度麦汁2000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取4ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.35ppm麦汁。再取18度麦汁500ml放入1L三角瓶中，用200l移液器取1.75ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.5ppm麦汁。分别贴上标签。2.3.5充氧方式本次实验充氧分为充氧8ppm，11ppm，和14ppm三种充氧量。充氧在SCHOTT DURAN瓶中进行。8ppm的充氧：先用手用力来回摇晃共四十下，过一段时间再摇晃四十下，共摇晃三次。11ppm的充氧：用氧气瓶往SCHOTT DURAN瓶中冲入氧气约20秒后，盖上瓶盖，用力来回摇晃共四十下，如此再进行两次。14ppm的充氧：用氧气瓶往SCHOTT DURAN瓶中冲入氧气约20秒后，盖上瓶盖，用力来回摇晃共四十下，如此再进行两次。然后将输氧管插入培养麦汁中充氧约20秒，盖上瓶盖，用力来回摇晃共四十下。2.3.6酵母的测量用注射器从发酵管中抽取5ml左右培养液，抽取时要先抽取1ml左右，然后将抽取物放掉，再抽取5ml，这样抽取的培养液比较均匀。然后将抽取的培养液放入10ml离心管中，用微型漩涡振荡仪振荡均匀，再用酵母计数仪测量出酵母数。2.3.7发酵度测定将发酵管中的培养液倒出用过双层滤纸过滤，取25ml左右，用啤酒分析仪测量发酵度。2.3.8成熟度检测将培养液用双层滤纸过滤后，用高效气相、液相检测。2.4具体操作流程第一阶段将配好的麦汁按照表1所示分装在SDHOOT瓶中，每瓶装240ml，再按如表2、表3所示添加青啤酵母或崂啤酵母，进行充氧。最后装入发酵管中，按表所示时间测量酵母数。待第七天后将发酵管中的培养液倒出过滤测量发酵度、成熟度。第二阶段除添加酵母为崂啤酵母外，其余操作与第一阶段相同。2.5响应曲面实验设计通过文献及以往实验经验，酵母添加量、充氧量、锌离子含量、麦汁浓度和发酵温度是影响酵母发酵的关键因素，因此，在此基础上，本研究采用Box-Behnken模型，以酵母添加量、充氧量、锌离子含量和麦汁浓度4个外界因子为自变量（independent variable），分别以X1、X2、X3、X4来表示之，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-X0)/X对自变量进行编码，其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，X为自变量的变化步长。衡量发酵性能采用五个指标麦芽三糖利用量、发酵度、成熟度（双乙酰、戊二酮、乙醛）作为响应值Y1-Y5, 因子编码及水平见表1。利用统计软件Design Expert (StaticMadeEasy,Minneapolis,MN,USA)来进行实验设计与数据分析。表1 各因素量及水平自变量水平麦汁浓度/0P充氧量/ppm锌离子含量/ppm酵母添加量/（×106个/ml）-11380.1515015110.3520118140.525实验设计方法：响应面实验设计里的BOX-Benhnken采用的设计及数据分析软件：Design-Expert设计原理：以发酵度、成熟度等指标作为因变量y，麦汁浓度、充氧等因素作为自变量x，通过少量有代表性的实验将y与x之间的关系函数化，从而可以量化它们之间的关系，预测出最佳发酵参数，并找出因素之间的相互影响趋势。实验安排：2株酵母、1种温度共54次实验，实验安排及结果见表2，表3。其中成熟度（乙醛，戊二酮，双乙酰）为第七天测，酵母数为第一天，第三天，第五天，第七天所测。表2为青啤酵母实验安排及结果，表3为崂啤酵母实验安排及结果。3 结果与讨论3.1 结果试验所得结果如表2表3所示表2 青啤酵母实验安排及结果麦汁浓度/0P酵母添加/（×106个/ml）麦汁充氧/ppm麦汁锌/ppm麦芽三糖含量/（g/L）麦芽三糖含量/（g/L）利用量/（g/L）发酵度/（%）双乙酰/ppb戊二酮/ ppb乙醛/ppb第1天酵母数/（×106个/ml）第3天酵母数/（×106个/ml）第5天酵母数/（×106个/ml）第7天酵母数/（×106个/ml）1320140.3511.702.718.99 70.4278.851.36.0520.0 84.845.99.81315110.3511.703.098.61 69.89106.964.5 6.7716.6 86.034.80.81325110.3511.703.278.43 70.3668.142.9 9.6531.0 58.018.610.41320110.511.702.119.59 70.8778.656.7 6.6920.0 79.347.88.31320110.1511.702.978.73 70.8466.440.3 5.6322.0 95.647.02.2132080.3511.703.428.28 70.7767.944.3 6.0523.0 86.023.81.5152580.3513.184.868.3269.16201.0120.08.2145.490.235.831.41525110.513.184.468.7268.95176.679.08.4940.790.128.010.31520140.513.186.336.85 57.66226.8153.9 7.6527.0 95.691.716.11515110.1513.184.238.95 69.78170.3108.4 11.2216.0 84.131.11.81525140.3513.183.859.32 69.84195.1102.0 9.843.8 71.641.59.01525110.1513.184.888.30 68.53240.1121.3 8.6539.1 117.745.721.31520110.3513.184.808.38 69.35235.0132.9 10.0832.3 87.065.411.61520110.3513.183.989.19 69.21219.4106.2 9.643.3 92.751.612.51520110.3513.184.828.36 66.74186.390.4 10.942.0 98.372.98.71520140.1513.185.487.70 67.47166.373.9 10.2730.9 96.444.05.91515140.3513.184.958.23 67.52374.0185.7 11.0125.4 68.844.47.6152080.513.184.748.43 69.02237.5146.5 7.631.3 94.137.230.3151580.3513.184.928.25 69.3373.0253.5 11.1826.7 87.361.624.81515110.513.185.267.92 66.68497.9319.2 11.6623.6 66.746.514.4152080.1513.185.068.11 67.73197.9102.8 9.5335.1 102.553.915.51825110.3519.387.9311.44 62.03280.0122.0 7.2237.1 118.074.435.31820110.1519.387.1412.24 67.44268.0148.0 8.7123.8 89.233.214.91820110.519.387.0512.32 65.75234.0119.0 8.3725.2 79.756.413.6182080.3519.388.2911.09 64.18332.0232.0 8.4928.3 91.471.325.71820140.3519.389.2210.16 59.3357.0154.0 8.3824.5 91.267.131.41815110.3519.387.1312.24 65.78306.0161.0 920.2 67.968.218.9表3 崂啤酵母实验安排及结果麦汁浓度/0P酵母添加/（×106个/ml）麦汁充氧/ppm麦汁锌/ppm麦芽三糖含量/（g/L）麦芽三糖含量/（g/L）利用量/（g/L）发酵度/（%）双乙酰/ppb戊二酮/ ppb乙醛/ppb第1天酵母数/（×106个/ml）第3天酵母数/（×106个/ml）第5天酵母数/（×106个/ml）第7天酵母数/（×106个/ml）1320140.3511.701.20 10.5072.0726.910.5 3.84 20.0 148.0 62.732.4 1315110.3511.701.54 10.1671.7662.130.5 3.88 21.0 83.0 50.07.1 1325110.3511.701.00 10.7072.3621.37.1 3.28 19.0 116.0 63.511.1 1320110.511.700.99 10.7172.1723.98.8 3.44 25.0 102.0 57.115.6 1320110.1511.701.44 10.2671.9925.59.5 4.14 23.0 105.6 88.128.8 132080.3511.701.12 10.5872.1622.8.0 3.46 23.6 137.0 82.09.6 152580.3513.182.29 10.8970.9463.5 35.7 5.10 28.0 114.0 87.335.7 1525110.513.181.68 11.5071.0360.9 31.0 5.29 44.6 107.8 68.45.5 1520140.513.182.39 10.7971.3790.0 50.0 5.13 22.0 88.8 91.11.1 1515110.1513.182.22 10.9671.6184.6 45.7 5.08 16.0 99.0 48.831.9 1525140.3513.182.25 10.9371.1252.5 27.3 5.77 28.0 106.8 66.812.6 1525110.1513.182.09 11.0868.8899.4 42.2 5.85 36.2 95.2 61.15.0 1520110.3513.181.59 11.5970.7698.6 49.2 6.02