苹果转基因研究课件.ppt

苹果转基因研究 田爽,转基因苹果,苹果为世界四大水果之一，是我国的第一大水果，在国民经济中占有重要地位。但是，由于果树育种周期长、遗传背景复杂，传 统的杂交育种方式很难选育出集各种优良品质于一身的品种 近年来随着社会的发展和进步，培育优质的苹果新品种成为民众的迫切要求。,基因工程的发展为苹果品种的遗传改良提供了新的技术方法，缩短育种周期，提高育种效率，为苹果遗传育种研究、利用各种遗传种质资源开辟了一条新的技术途径,转基因苹果,究竟怎样定义转基因苹果？转基因苹果研究进展如何？它存在哪些问题？,转基因苹果,主要内容,定义发展历史 研究现状 研究进展 存在问题,转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）,1 定义,“转基因技术”（Genetically Modified Technology）,是指使用基因工程或分子生物学技术(不包括传统育种、细胞及原生质体融合、杂交、诱变、体外受精、体细胞变迁及多倍体诱导等技术)，将遗传物质导入活细胞或生物体中，产生基因重组现象，并使之表达并遗传的相关技术,2 发展历史,自1988年首例使用农杆菌转化成的转基因果树核桃诞生以来，随后，1989年James等采用农杆菌介导的叶盘共培养法获得了转基因绿袖(Greensleeves)苹果，报告基因新霉素磷酸转移酶基因和胭脂碱合成酶基因 1992年程家胜等在国内报道了获得转基因的苹果试管苗，与James等一样，用绿袖作为受体植株，农杆菌介导法，不同的是抗卡那霉素的标记基因为氨基葡糖磷酸转移酶APH(3)I基因，报道基因为葡萄糖苷酸酶基因,2 发展历史,植物转基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、激光法、花粉管通道法等。在植物上转化成功的例子中，80%是由农杆菌介导转化的。,2 发展历史,2 发展历史,2 发展历史,3.1 苹果转基因的受体基因型 近年来，在全世界果树研究者的努力下，转基因苹果已取得不小的成就，用于苹果遗传转化研究的受体基因型越来越多，除了绿袖，主要还有 红元帅、新乔纳金、嘎拉、金冠、M26、皇家嘎拉、Elstar、Braeburn、Merlijin、乔纳金、富士、王林、金矮生、辽伏、元帅、粉红佳人以及M7和八楞海棠等,3 研究现状,3 研究现状,3.2 导入的外源基因目前为止，导入的外源基因有GUS基因、GFP基因、Bt基因、LFY基因、npt基因、CpTI基因、杀菌肽基因、抗菌肽MB39基因、FT基因、硫堇蛋白Rs-afpl基因、ALS基因(抗除草剂)、rol基因(生长素合成酶基因)、光敏色素B基因、LeIRT、Ferrition等其中抗性基因分别提高了苹果的抗虫性、抗病性和抗除草剂的能力；rol基因的导入使苹果苗在田间表现矮化；光敏色素B基因使苹果的生长量和干重不同程度减少,同时，对转化材料的选择不再停留在最初的抗性材料筛选上，GUS组织化学检测及分子水平的检测(PCR或Southern杂交)技术被普遍采用。由于GUS基因可以在农杆菌中表达，而农杆菌在转化后的离体培养中至少能存活12个月而不表现生长，所以GUS阳性结果不能准确反映初步转化频率 于是，另外一种报道基因绿色荧光蛋白(GFP)被用于苹果的遗传转化,3 研究现状,作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。GFP检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代。目前，GFP被改造作为转基因植物的遗传标记，成为监测生物体内基因表达的的十分重要的报告因子另外，许多实验研究表明甘露糖/PMI筛选体系以pmi为安全标记基因，可以实现对转化细胞安全、高效的正向选择。,3 研究现状,3.3 外源基因导入的方法 直接导入法 化学物质导入法、电穿孔发、脂质体法、微注射法、基因枪法（微弹轰击法）和花粉管通道法等 间接导入法 土壤农杆菌转化系统和植物病毒载体系统,3 研究现状,3.3 外源基因导入的方法 在苹果基因转化中主要应用电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法。农杆菌介导法以其简便、高效成为应用最广泛的转化方法。,3 研究现状,3.4 转基因苹果的鉴定 遗传转化的最终目的是获得能稳定表达且遗传外源目的基因的转化植株，这就需要不断观察和检测转基因植株在田间的表现目前使用的转基因植物的鉴定方法有:分子检测、免疫技术、利用生理生化指标、标记基因和生物鉴定法,3 研究现状,3 研究现状,3.4 转基因苹果的鉴定全面检测需要：1 检测插入外源基因：先做个普通PCR检测，传统的要 southern杂交检测插入几个拷贝，现在可以用Real-Time 检测拷贝数；2 表达量检测：RT-PCR，northern杂交，Real-Time RT-PCR；3 蛋白水平检测：western杂交4 报告基因检测：Gus，GFP/YFP/RFP等,4 研究进展,苹果转基因的方法主要有:农杆菌介导法、基因枪法、激光法、花粉管通道法、脂质体法、微注射法、电穿孔法等。现在，在经常使用的苹果转基因技术中，电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法使用的最多。,4 研究进展,4.1 农杆菌介导法现在，农杆菌介导法的发展潮流是提高转化效率和扩大转化范围。常见的影响农杆菌转化频率的因素有三大类：侵染力,抗生素,基因型。,4 研究进展,侵染力农杆菌的侵染力取决于本身的特性及其受体植株的敏感性。细菌的菌株对转化频率的影响很大。最常用的致瘤农杆菌菌株是LBA4404，EHAl05和EHA101，也常用A208SE，A136，C58/Z707最常用的发根农杆菌菌株则是1855NCPPB和ATCCl5834。,4 研究进展,抗生素 抗生素的浓度，种类对转化都会产生影响。常用的卡那霉素，用量50100g/ml，因物种不同而异，卡那霉素的浓度和加入时间须根据外植体和物种的不同进行预先实验基因型 基因型是影响苹果遗传转化率的重要因素，其特异性一般认为与材料的生理状态有关，不同株系间进行转化有差别，且同一属间差异也往往较大。转化细胞能否高效再生是基因转化的主要障碍，受到所用组织的很大影响。,4 研究进展,4.2 电穿孔法 这种方法也被称为电激法。在使用电穿孔法的研究报告中，大多数的研究报告是转化原生物质的报告。4.3 微弹轰击法 此法也称基因枪法，最近发展很快。可用于基因枪法的植物组织、器官相当广泛，常用的材料是悬浮培养的细胞、营养胚或合子胚、愈伤组织、花粉粒、花轴、叶柄、幼叶、子叶。,4 研究进展,4.4花粉管通道法 花粉管通道法是一种较老的植物转化方法,是我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in En-zymology”报道的研究成果4.5 吸胀法 花粉管途径法和吸胀法的最大优点就是简单易行，不需要贵重、复杂的设备，无须离体培养就可获得再生植株。,5 存在问题,首先，因为离体材料再生体系的不完善，苹果转基因技术尽管发展的很迅速，但是有些品种由于基因型不同，再生率不高，因此不能进行遗传转化其次，是关于基因沉默和丢失的问题，外源基因整合到受体以后经常表现出不表达或者丢失等现象，这是一个很普遍的问题另外，移栽成活率不高，即使获得转化植株，但由于移栽不能成活，致使不能大面积应用生产，理论与实际难以结合,5 存在问题,目前，苹果转基因研究进入瓶颈阶段。第一，转化方法单一，主要使用农杆菌介导法第二，转基因技术的转化效率很低 Puite等用农杆菌介导的嘎拉、金帅、E1star的转化效率分别为0.7%8.0%，0.2%6.0%,0.4%0.8%；,5 存在问题,所以，苹果想要成功的进行转基因，必须根据自身品种的遗传性状，借鉴其他类似植物成功的经验和方法，探索适用于苹果遗传转化的新方法和提高转化效率的办法。,Thank you for your attentionO(_)O,谢谢！,