基因芯片在嗜铬细胞瘤患者基因突变中的检测作用课件.ppt
基因芯片在嗜铬细胞瘤患者基因突变中的检测作用,徐州医学院研4班泌尿外科：刘文彬、韩学超 韩学超、许小兵 神经外科：刘长涛,主要内容,背景介绍,1、嗜铬细胞瘤 嗜铬细胞瘤是由肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经节细胞形成的肿瘤，瘤组织持续或间断地释放大量儿茶酚胺 引起持续性或阵发性高血压和多个器官功能及代谢紊乱。嗜铬细胞瘤 分为散发型和家族型，约10%的嗜铬细胞瘤患者为某些孟德尔遗传疾病。家族性嗜铬细胞瘤呈常染色体显性遗 传，目前已知这些疾病的嗜铬细胞瘤发生与 RET原癌基因、HL基因、S DHD基因和SDHB基因 4种基因有关。,背景介绍,2、近年来研究表明家族性嗜铬细胞瘤患者中这四种 基因的突变频率较高，突变频率的总和接近30%，目前国内外普遍采用DNA直接测序技术，在嗜铬细胞瘤患者中发现和诊断某些孟德尔遗传疾病，耗费大量的时间和金钱，临床上难以广泛的开展。3、最新的基因芯片技术可以高效快速的探测疾病机制，诊断疾病病因。,基因芯片技术,基因芯片技术是将大量探针固化于固相支持物上，然后与标记 的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。该技术具有高通量、大规模、快速、高效、高灵敏度等优点，在科研领域、生物制药和医学诊断上都具有良好 的应 用前景。,基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用,1、材料与方法1.1、基因芯片的选择 选择与嗜铬细胞瘤相关的 4个基因(RET、V HL、SDHB和SDHD)共 8 7个突变位点，检测位点全部位于基 因外显子区域，涵盖与嗜铬细胞瘤相关的 85%的已知变异位 点。1.2、患者DNA的提取 取患者外周血5ml，用酚氯仿方法提取DNA。,基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用,1.3、聚合酶链反应（PCR）标本的扩增反应采用2 5uL 混合体系:：将2 5 n g D NA样本，2.5 u L 1 0 扩增缓冲液、2u L 2.5 mm o l L d N T P s、1.0u L 2 5 mmol L Mg、1.5ul DMS O、1 u L 2 0 g/LBSA、1 3 u L d d N2 0、上、下游引物(1 umo l L)各 1 u L分和 2.5 U T a g聚合 物加入200 L 扩增管。1.4、杂交反应 杂交步骤按 照基 因芯 片操作说明书进行。将 P C R扩增液和 阴性、阳性扩增液加 入 同一个薄壁管 中，9 8热变性5 mi n，取出后迅 速放入冰盒，一20放置5 mi n。取 出基 因芯 片，做好样品编号，在杂交舱 中加入预杂交液4 2。C静 置5 mi n，吸除该缓冲液；吸取杂交缓 冲液与 已变 性的 P C R扩增产物混 合物，混匀，将 液体 全部加 入杂交舱中，4 2杂交3 0 mi n。吸除杂交舱 中溶 液后清洗两次。,基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用,1.5、显色反应 检测探针采用 Bioti n标记，碱性 磷酸酶(AP)催化 的 NBT BCIP显色反应。在杂 交舱中加入抗 体溶液，室温放 置20 mi n。吸除杂 交舱中溶液后清洗两次。向杂交舱 中加入显色液 溶液，42避光放置40 mi n。吸除杂交舱 中溶液，小心揭除杂交舱，用蒸馏水冲洗后，置4 2烘干。将显色载玻片面朝下置于 BaiO生物芯片识读仪 片槽上检测。,基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用,1.6、检测分析 图像经 Ar r a y D o c t o r 软件分析可 自动输出检测结果。各个信号值均经过背景信号值 的矫正。芯片中 1个检测位点由相邻的 3个杂交点组成，计算 3个杂交点 的均值为该检测位点的信号值，然后将野生型与突变型位点的信号值进行比较，以判断是否存在位点突变。,基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用,2、结果 基因芯片检测结果显示，9 1.4%(3235)的基因 芯片杂交与基因测序结果一致。基因芯片和基因测序的结果比较 突变基因 基因测序检出例数 芯片杂交检出例数 符合率SDHB 10 8 80SDHD 2 2 100VHL 7 6 86RET 10 10 100无突变对照 6 6 100,讨论,1、嗜 铬 细 胞 瘤 占 高 血 压 病 因 的（0.5-1.0）%。因为本病发作 时有 引起急症意外的危 险，加之尚有 10 为恶性嗜铬细胞瘤，故应及早诊治。新的研究表明，散发 的嗜铬细胞瘤中基因 突变频率较高，某些研究中发现50%的嗜铬细胞瘤患者中存在一个易感的等位基因。而传统的基因测序虽然比较的准确，但往往要花费大量的时间和金钱，临床推广有一定的困难。基因芯片技术相比传统的基因测序具有快速、准确、简便、经济适用等特点，在嗜铬细胞瘤的基因诊断中具有较好的应用前景。,讨论,2、小样本的实验证明基因芯片在嗜铬细胞瘤的诊断中具有较好的准确性，但目前还不能完全检测所有基因的突变位点。因此本基因芯片在投入实际应用之前还需要更多的样本验证。3、基因芯片虽然显示出良好的识别突变位点的效能，但在个别样本中也显示出了不足之处。未来需要解决的问题是如何控制基因芯片检测的误差及提高检测效能？,谢谢！,
