猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较分析.doc

猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较试验方案猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较参考编号试验的日期动物试验开始日期2014- - 动物试验完成日期2014-实验室试验开始日期2014-实验室试验完成日期2014-动物试验地点实验室试验地点江苏省农科院兽医所试验负责人邵国青动物试验负责人冯志新、熊祺琰、华利忠动物试验参与者甘源、王佳、徐飞扬、陈财实验室试验负责人冯志新、熊祺琰、华利忠实验室实验参与者：冯志新、熊祺琰、马庆红、陈财、王佳试验方案起草人冯志新、熊祺琰、华利忠试验方案讨论参加者邵国青、刘茂军、冯志新、熊祺琰试验方案定稿人及时间2014-记录的附件页数目录猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较1猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较1目录2猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较31 目的32 材料与方法32.1 材料32.2方法42.2.1动物分组说明42.2.2动物分组与试验操作概表52.2.3免疫62.2.4 疫苗免疫后临床症状观察记录72.2.5 疫苗免疫后血清抗体及分型检测72.2.6 疫苗免疫后细胞免疫指标检测72.2.7 疫苗免疫后黏膜免疫指标检测72.2.8攻毒7附录1 攻毒保护率计算9附录2 猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准10附录3 动物分组记录表11附录4 动物免疫记录表12附录5免疫后异常临床症状观察记录表13附录6 抗体检测记录表14附录7 淋巴细胞增殖试验结果16附录8 血象分析17附录9 T淋巴细胞分类计数18附录10 黏膜抗体检测记录表19附录11攻毒记录单20附录12特殊情况记录表21附录13 攻毒后临床症状观察记录表22附录14日增重记录24附录15 攻毒后肺部剖检记录26附录16攻毒后剖检记录28附录17 攻毒后肺部病理损伤记录30附录18 攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测32猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较1 目的猪支原体肺炎活疫苗AN306菌株与原168菌株的肺内注射免疫效果比较；猪支原体肺炎疫苗（天邦、吉林正业、辉瑞）免疫效果比较；2 材料与方法2.1 材料2.1.1待试的疫苗产品与试剂2.1.1.1 疫苗A.猪支原体肺炎活疫苗AN306株F321，由江苏省农业科学院兽医所研制，规格为2×107CCU/瓶（2ml冻干），批号为20140325。有效期：_。PCR鉴定:Mhp_，Mhr_。B.猪支原体肺炎活疫苗（168株），由南京天邦生物科技有限公司提供，规格为50头份/瓶，批号为139078-1。有效期：_。PCR鉴定:Mhp_，Mhr_。C.猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株），由吉林正业生物科技有限公司提供，规格为 4头份/瓶，批号为2014002。有效期：_20150110_D.猪支原体肺炎灭活疫苗（P-5722-3株，Suvaxyn RespiFend MH），由上海硕腾（辉瑞）提供，规格为50头份/瓶，批号为1302777A。有效期：15/11/16_2.1.1.2 试剂A猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株）稀释液,批号：2014002；有效期：20170115B猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液C猪支原体肺炎肌注活疫苗佐剂G-1-12.1.2动物选择猪肺炎支原体抗体、抗原均阴性的5-10日龄仔猪，54头.饲养地点：江苏省农科院兽医所饲养员：_徐飞扬，陈才_仔猪免疫状况：未打气喘病疫苗。2.1.3 动物饲料仔猪料:2.1.4 设备气雾免疫设备、滴鼻头、20（10、5、2）ml注射器、耳标、耳号钳、冰盒、相机、解剖器械、离心管。2.1.5攻毒用强毒猪肺炎支原体强毒JS株组织强毒，来自本所，批号20130625，-20保存，有效期至：2014/06/25。2.2方法2.2.1动物分组说明G1:-猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组。每头猪肺内注射免疫1头份（1ml）即1×107 CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。G2: -猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组。每头猪肺内注射免疫1ml，即1×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗AN306株。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。G3: -猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。每头猪气雾免疫5×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。G4:-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。每头猪肌肉注射免疫5×107 CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。首免后两周二免，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。G5: -猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。每头猪肌肉注射免疫1头份(2ml)猪支原体肺炎灭活疫苗。首后2周，加强免疫一次，首免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。G6:- 猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。每头猪胸腔注射免疫1头份（5ml）猪支原体肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。G7: -猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。每头猪滴鼻免疫？头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。G8: -健康对照组（不免疫，不攻毒）。不接种疫苗。不攻毒，其它组攻毒后28天剖杀。G9: 攻毒对照组（不免疫，只攻毒）。不免疫疫苗，只攻毒，攻毒后28天剖杀。2.2.2动物分组与试验操作概表组号组别N疫苗剂量DPI-0DPI-7DPI-14DPI-21DPI-28DPI-35DPI-42DPI-70G1168肺内组6天邦1×107 CCU/头（1头份）肺内免疫/采血/鼻拭子/称重鼻拭子采血/鼻拭子鼻拭子采血/鼻拭子鼻拭子采血/鼻拭子/攻毒/称重剖检/称重G2AN306肺内组6ADC1×107 CCU/头G3168气雾组6天邦5×107 CCU/头气雾免疫/采血/鼻拭子/称重G4168肌注组6天邦5×107 CCU/头肌注免疫/采血/鼻拭子/称重肌注免疫/鼻拭子采血/鼻拭子G5灭活苗组6辉瑞2ml/1头份G6乳兔苗胸腔组6吉林正业5ml/1头份胸腔免疫/采血/鼻拭子/称重采血/采血/鼻拭子鼻拭子G7乳兔苗滴鼻组6吉林正业1头份滴鼻免疫/采血/鼻拭子/称重G8健康对照组6-采血/鼻拭子/称重G9攻毒对照组6-称重攻毒/称重总计542.2.3免疫G1猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组用灭菌生理盐水50ml溶解168活疫苗冻干粉1瓶，使活疫苗终浓度为1×107 CCU/ml，1头份/ml。每头猪肺内免疫1ml，即1×107 CCU/头。G2猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组用灭菌生理盐水溶解AN306活疫苗冻干粉，使活疫苗终浓度为1×107 CCU/ml。每头猪肺内免疫1ml，即1×107 CCU/头。G3: -猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。将1瓶168株活疫苗用5ml无菌猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液溶解稀释成1×108CCU/ml浓度，取5ml疫苗溶液倒入喷雾器，对保温箱中的6头仔猪进行气雾免疫（0.2MPa，约10min）。G4:-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。将1瓶168株活疫苗用25ml佐剂G-1-1溶液稀释成2×107CCU/ml浓度，每头仔猪颈部肌肉注射免疫2.5ml，注射时分左右侧肌肉共2个注射点。首免后14天二免，方法同上。G5: -猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。按猪支原体肺炎灭活疫苗说明书，每头猪肌肉注射免疫1头份猪支原体肺炎灭活疫苗。G6:- 猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。按猪支原体肺炎乳兔活疫苗说明书，每头猪胸腔免疫1头份猪支原体肺炎活疫苗。G7: -猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。每头猪滴鼻免疫？头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。G8健康对照不免疫G9攻毒对照不免疫2.2.4 疫苗免疫后临床症状观察记录免疫后观察并记录可能出现的临床症状，填写附录3。尤其要记录如下重要的症状：咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤、死亡等2.2.5 疫苗免疫后血清抗体及分型检测除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、免疫后2、4、6周取3头猪各采血1ml（两次免疫组于首免前、首免后3、4、6周采血），分离血清，用自制P46-ELISA试剂盒检测IgG抗体。对于阳性者继续用分型试剂盒检测IgG亚类。2.2.6 疫苗免疫后细胞免疫指标检测除攻毒对照组外，其余各组于首免后2、4、6周取3头猪各采集抗凝血5ml（两次免疫组于免疫后3、4、6周采血），其中1ml用于血液生化检测；1ml用流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8+T细胞含量、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+/CD8+比率；另外3ml用于淋巴细胞增殖试验和IFN-检测2.2.7 疫苗免疫后黏膜免疫指标检测除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、首免后7、14、21、28、35、42天采集鼻拭子样品，检测吸呼道特异性sIgA抗体。2.2.8攻毒将每瓶猪肺炎支原体组织强毒用50ml生理盐水稀释，气管途径接种试验组试验猪，每头5ml。2.2.9攻毒后临床症状观察所有猪在攻毒后按附录2要求观察临床症状2.2.10日增重计算各组分别选定3头猪，不采集血样，分别于首免当天、攻毒当天和剖杀当天称重，计算日增重。2.2.11攻毒后肉眼病变剖检所有仔猪在攻毒后的第28天进行宰杀，记录肺病变，用28分法统计确定肺病变程度，并记算攻毒保护率（见附录1）。2.2.12攻毒后病理损伤观察剖杀后，采集所有猪左尖叶，福尔马列林溶液固定后，切片观察病理损伤。2.2.13攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测剖杀后，每头猪用50ml生理盐水采集肺泡灌洗液，用定量PCR方法检测猪肺炎支原体抗原。附录1 攻毒保护率计算攻毒保护率的统计与评判：试验猪扑杀后，分别记录左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶、副叶病变百分比率，将025%记为1；2650%记为2；5175%记为3；76100%记为4，统计每个试验猪病肺病变指数（最高为28）。试验猪病变指数大于10判为发病，小于4为健康（排除猪肺炎支原体感染），根据肺病变指数，按以下公式计算试验猪攻毒保护指数。试验猪攻毒保护指数（攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值试验猪肺病变指数）/（攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值不攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值）试验猪攻毒保护指数小于60为无保护，大于或等于60为有保护，再按以下公式计算试验猪攻毒保护率。试验猪攻毒保护率有保护试验猪数/试验猪数试验在阳性对照组全部发病、阴性对照组至少全部健康时有效。附录2 猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准评判参数01210最高分咳嗽无有严重2呼吸困难无有严重2呕吐无有严重2俯卧无有严重(躺卧)2食欲不振无有1震颤无有1死亡无有10注射后第1日(D1)直肠温度高出范围1.0以下1.01.51.5以上2注射后第2日(D2)直肠温度高出范围1.0以下1.01.51.5以上2注射后第3日直肠温度较对照组高出范围0.5以下0.51.01.0以上2累计总分28猪安检试验中，每头试验猪症状全部累计，总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全，累计总分25，可重检1次，重检累计总分不大于2安全。附录3 动物分组记录表猪场：农科院组别头数标记耳号G1 168肺内组G2 AN306肺内组G3 168气雾组G4 168肌注组G5 灭活苗组G6 乳兔苗肺内组G7 乳兔苗滴鼻组G8 健康对照G9 攻毒对照附录4 动物免疫记录表动物免疫 日期:组标记疫苗免疫途径剂量猪（头数）G1 168肺内组G2 AN306肺内组G3 168气雾组G4 168肌注组G5 灭活苗组G6 乳兔苗肺内组G7 乳兔苗滴鼻组操作人: 复核人：附录5免疫后异常临床症状观察记录表组：猪数：日期：标记：猪号观察日 期第几日附录6 抗体检测记录表组别耳标DPI 14/21DPI 28DPI 42IgG亚类IgG亚类IgG亚类G1G2G3G4G5耳标DPI 14/21DPI 28DPI 42IgG亚类IgG亚类IgG亚类G6G7G8G9附录7 淋巴细胞增殖试验结果附录8 血象分析附录9 T淋巴细胞分类计数附录10 黏膜抗体检测记录表附录11攻毒记录单攻毒株: 批号：来 源： 稀释液： 批号：来 源： 在实验室稀释 日期: 管 (毒液)批号量稀释ABCDEF动物攻毒日期:组猪（头数）攻毒途径剂量耳号G1G2G3G4G5G6G7G9操作人：复核人：附录12特殊情况记录表日期:组:隔离器：观察：签名:日期:组:隔离器：观察：签名: 如有特殊情况，比如转群，疾病，用药，换料等影响动物的事件。填写 “附录 12: 特殊情况记录”注：试验负责人员（SGQ, LMJ）应定期现场核查饲养情况，以及攻毒后的临床症状等，并在临床观察以及饲养记录上签字及日期。及时将原始数据传递至JAAS，便于沟通。附录13 攻毒后临床症状观察记录表组耳号临床症状记录与评分症状类型评分G1G2G3G4G5组耳号临床症状记录与评分症状类型评分G6G7G8G9附录14日增重记录组别耳标DPI 0DPI 42DPI 70日增重人重总重猪重人重总重猪重人重总重猪重DPI 0-42DPI-0-70G1G2G3G4G5组别耳标DPI 0DPI 42DPI 70日增重人重总重猪重人重总重猪重人重总重猪重DPI 0-42DPI-0-70G6G7G8G9附录15 攻毒后肺部剖检记录组耳号肺部照片背侧面腹侧面G1G2G3G4G5组耳号肺部照片背侧面腹侧面G6G7G8G9附录16攻毒后剖检记录组耳号肺叶病变指数攻毒保护率左尖叶左心叶左膈叶右尖叶右心叶右膈叶副叶总分G1G2G3G4G5组耳号肺叶病变指数攻毒保护率左尖叶左心叶左膈叶右尖叶右心叶右膈叶副叶总分G6G7G8G9日期： 操作人： 复核人：附录17 攻毒后肺部病理损伤记录组耳号病理切片照片G1G2G3G4G5组耳号病理切片照片G6G7G8G9附录18 攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测